CN105579472A - 新型抗体框架 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及具有有利特性的新型抗体框架。
Description
技术领域
本发明涉及具有有利特性的新型抗体框架。
背景技术
本发明涉及新型嵌合人抗体轻链框架，其包含来自Vκ的框架区I至III和来自Vλ的框架区IV，具有有利特性诸如高稳定性和减小的聚集倾向。
在过去四十年，从开发出第一批单克隆抗体(“mAb”；&Milstein,Nature.256(1975)495-7)开始，抗体已成为用于研究、诊断和治疗目的的越发重要的一种生物分子类别。最初，抗体唯一地是用目的对应抗原对动物进行免疫来获得。虽然非人来源的抗体可以用在研究和诊断中，但在治疗方法中，人抗体可能将非人抗体识别为外来物，并且产生针对非人抗体药物产品的免疫应答，从而使得所述非人抗体药物产品效力下降或无效。因此，已经建立重组方法以使非人抗体具有较低的免疫原性。
将非人mAbs转化为免疫原性较低的治疗剂的最初工作需要将由动物(例如，啮齿动物)的可变结构域和人恒定区组成的嵌合抗体工程化(Boulianne等,Nature312,(1984)643-646)。另外的方法专注于通过引入人可变结构域支架中的CDR(Jones等，Nature321(1986)522-525；Riechmann等，Nature332(1988)323-7)或通过表面重建可变结构域(Roguska等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(1994)969-973)来使啮齿动物的mAb人源化。
对于通过CDR环移植来人源化，人受体框架是基于与供体框架的同源性(例如，Roguska等,ProteinEngineering9(1996)895-904；WO/2008/144757(针对兔))或基于优选的稳定性特征(Ewert等,Methods34(2004)184-199)来选择。后一概念已被用于将兔抗体人源化到通用可变结构域框架中(US8,193,235)。
在任何选定方法的情况下，所得mAb或功能片段理想地保留供体mAb的所需药效学特性，同时显示类似药物的生物物理特性和最小的免疫原性。对于mAb或其功能片段的生物物理特性，聚集倾向已成为治疗分子的可开发性的主要问题，主要是出于以下三个原因：
首先，蛋白质聚集体通常显示在宿主体内引发免疫反应的较高可能性，这会导致形成抗药抗体并且最终形成药物中和抗体(Joubert等,J.Biol.Chem.287(2012)25266-25279)。
第二，聚集体因其去除的工作量增加而影响生产产率(Cromwell等,AAPSJournal8(2006),Article66)。
第三，可观察到脱靶效应。有关低聚物形成的问题对于其中单价结合是优选的应用(包括每个靶标和构建体仅具有单价的双特异性(或多特异性)抗体形式)而言是更为明显的，因为在这些情况下形成低聚物会产生具有多价结合特性的蛋白质聚结体，其可能导致脱靶效应。这种非特异性活性的实例是双特异性抗体形式的具有单个CD3ε-结合结构域的构建体的使用。这种形式可以例如将其两个结合结构域中的一个结合至癌抗原，并且将其第二CD3ε-结合结构域结合至募集细胞毒性T细胞。由于需要单价CD3ε-结合部分的交联来诱导通过CD3ε的信号传导，T细胞将只在通过结合至靶细胞表面的多个双特异性构建体衔接时才会受刺激，并且因此采用交联分子的特性，从而导致排他地针对癌细胞的特异性T细胞应答。相反，这种构建体的低聚物将展现出交联双特异性抗体的特性，并且因此使细胞毒性T细胞活化(甚至是在未结合至癌细胞的情况下)，从而引起T细胞的系统性活化。T细胞的这种非特异性和系统性活化会导致细胞因子水平升高，从而引起不利作用。
另外，可靠的且普遍适用的受体框架有益于实现一种使非人抗体人源化的稳健方法，因为克隆、表达和纯化方法可以被标准化。
为了满足上文所述的针对非人mAb的人源化标准，已公开的方法提出将人共有可变结构域框架序列用作受体支架以用于移植非人互补决定区的建议。基于以下假定：对于蛋白质中的每个氨基酸位置，对蛋白质稳定性有贡献的残基在进化过程中已富集于种系序列池中，普遍接受的是，所得人源化可变结构域越接近相应的可变结构域家族中的人种系共有序列，则预期的稳定性就越高。如由Steipe(Steipe等，J.Mol.Biol.1994240(1994)188-92)描述和由(等，J.Mol.Biol.305(2001)989-1010)综述的这个概念已被广泛接受并且获得了广泛的应用。非限制性实例是：(a)将共有序列可变结构域用于非人抗体的人源化(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289)；(b)使用共有序列可变结构域来构建CDR文库以用于体内筛选稳定的靶结合抗体(Knappik等，J.Mol.Biol.296(2000)57--86)；以及(c)基于知识的方法：通过将非共有残基交换为共有残基来改进抗体可变结构域的稳定性(Steipe，上述引文)。
此外，不同的可变结构域家族的稳定性是用VH3来描述，所述VH3是最稳定的可变重链结构域。重要的是，在可变轻链结构域的情况下，优选的是Vκ家族，而不是Vλ家族(Ewert，上述引文)。具体来说，VH3和Vκ1的人共有序列已被描述为具有有利的生物物理特性(Ewert，上述引文)并且特别适于来自非人来源的抗体的人源化(在Carter的上述引文中使用)。
根据这一点，存在若干出版物，其中人Vκ1-VH3共有框架hu-4D5已被用于啮齿动物和兔抗体的人源化(Rader,J.Biol.Chem.275(2000)13668-13676；WO/2005/016950；WO2008/004834)。或者，与hu-4D5属于同一家族的天然存在的序列已被用于从兔来源产生稳定的人源化单链(scFv)片段(US8,293,235；Borras等，J.Biol.Chem.285(2010)9054–9066)。
重要的是，已注意到自然选择在全长抗体的背景下总是进化出稳定的可变结构域，其中可变结构域邻近并接触恒定结构域1。因此，某些非共有残基完全可以使分离的可变结构域具有更好的稳定性，例如在单链Fv(scFv)片段的背景下。为了支持这一假设，对稳定性有贡献的非共有突变已在美国专利申请US2009/0074780中进行描述。
此外，抗体稳定性对于抗体治疗剂产品的制备、纯化、保存期以及随后的成本是至关重要的。这些参数的一个或多个的甚至微小改进对于以下问题可能是高度适当的：抗体药物的研究和开发是否正变得商业可行。
因此，虽然事实是已经就解决从非人抗体获得人源化抗体药物的问题进行了许多尝试，但对开发具有有利特性诸如高稳定性和减小的聚集倾向的新型人抗体框架仍有大的未能满足的需要，其中在与天然存在的序列相比时，人抗体框架含有尽可能少的突变，理想情况是不含突变，以便尽可能降低产生免疫原性序列的风险。这类稳定的人框架还可以用于例如通过环移植或简单地通过在亲本抗体与稳定框架之间交换对稳定性有贡献的组分来使完全人抗体或其片段稳定。
现有技术目前尚未实现或提出已由本发明提供的这个问题的解决方案，即新型嵌合人抗体轻链框架，其包含来自Vκ的框架区I至III和来自Vλ的框架区IV，其具有有利特性诸如高稳定性和减小的聚集倾向。
发明内容
本发明涉及新型嵌合人抗体轻链框架，其包含来自Vκ的框架区I至III和来自Vλ的框架区IV，其具有有利特性诸如高稳定性、减小的聚集倾向以及极小免疫原性潜力。
因此，在第一方面，本发明涉及一种抗体VL结构域，其包含：(i)人Vκ框架区I至III；(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3；以及(iii)框架区IV，其选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至SEQIDNO.22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和SEQIDNO.17；以及
c.基于Vλ得到序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
条件是，如果在b.或c.的情况下，框架区IV具有序列FGQGTKLTVLG(SEQIDNo.15)，
(w)所述人Vκ框架区I至III不同于以下克隆列表中所列的框架区：FW1.4gen(SEQIDNO:4)、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt以及43-FW1.4opt；
(x)所述人Vκ框架区I至III不同于通过可从以下克隆列表中所示的框架区序列重新排列而获得的序列：FW1.4gen(SEQIDNO:4)、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt以及43-FW1.4opt；
(y)所述人Vκ框架区I至III不同于可通过使序列FW1.4gen(SEQIDNO:4)在15、22、48、57、74、87、88、90、92、95、97以及99(AHo编号)中的一个或多个位置处进行突变而获得的序列；或
(z)与SEQIDNo:8的人Vκ序列中的相应区域相比，所述人Vκ框架区I至III包含不超过五个的突变，特别是与SEQIDNo:8的人Vκ序列相比，少于五个、少于四个、少于三个、特别是仅一个或没有突变。
在第二方面，本发明涉及一种分离的抗体或其功能片段，其包含包括根据本发明的抗体VL结构域。
在第三方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的分离的抗体或其功能片段，以及任选地药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在第四方面，本发明涉及一种核酸序列或核酸序列集合，所述核酸序列编码本发明中的任一个的抗体VL结构域、或本发明的分离的抗体或其功能片段；和/或涉及一种或多种通过根据本发明的第九方面的方法可获得的核酸序列。
在第五方面，本发明涉及一种载体或载体集合，所述载体包含本发明的核酸序列或核酸序列集合。
在第六方面，本发明涉及一种宿主细胞(特别是一种表达宿主细胞)，所述宿主细胞包含本发明的核酸序列或核酸序列集合、或本发明的载体或载体集合。
在第七方面，本发明涉及一种用于产生本发明中的任一个的抗体VL结构域、本发明的分离的抗体或其功能片段的方法，其包括以下步骤：表达本发明的核酸序列或核酸序列集合、本发明的载体或载体集合、或本发明的宿主细胞(特别是表达宿主细胞)。
在第八方面，本发明涉及一种用于产生人源化兔抗体的方法，其包括以下步骤：
a)用目的抗原使兔免疫；
b)分离至少一种目的抗体；以及
c)将所述至少一种目的抗体的VLCDR区克隆到根据本发明的编码抗体VL结构域的核酸序列中。
在第九方面，本发明涉及一种用于产生编码根据本发明的抗体VL结构域的核酸序列、或编码根据本发明的分离的抗体或其功能片段的一个或多个核酸序列的方法，其包括在一个或多个步骤中组合编码以下各项的核酸序列：(i)人Vκ框架区I至III；(ii)CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3；以及(iii)框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
特别是使用以下方法中的一种：
i.在包含编码人或人源化Vκ结构域的核酸序列的核酸构建体、特别是重组载体中通过框架区IV置换所述Vκ框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
ii.在一个或多个步骤中将编码以下各项的一个或多个核酸序列插入至包含编码框架区IV的核酸序列的核酸构建体、特别是重组载体：(i)人Vκ框架区I至III；以及(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其中所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
iii.在编码人或人源化Vκ结构域的核酸序列中使所述编码框架区IV的核酸序列突变，以产生框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；或
iv.在一个或多个步骤中，在包含编码轻链结构域(该轻链结构域包含人Vκ框架区I至III，CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3以及框架区IV)的核酸序列的核酸构建体、特别是重组载体中，用编码来自目的抗体的对应的一个或多个CDR结构域的一个或多个核酸序列来置换编码所述CDR结构域的一个或多个核酸序列，其中所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变。
附图说明
图1示出了概括框架和CDR区的可变结构域拓扑结构。
图2示出了hu-4D5(Carter,1992)和所测试的替代框架的可变结构域序列的序列比对。与hu-4D5的差异以黑色指示。对于hu-4D5，仅示出了框架区Vκ框架I至IV(SEQIDNO:34至37)和VH框架I至IV(SEQIDNO:38至41)。
图3示出了scFv1至scFv10的单体含量的标准化的时间分辨损失的比较。
图4示出了框架III残基AHo101与λ连接区(框架IV)之间的相互作用的模型；VLκ(上图；PDBID:1FVC)和VLλ(下图；PDBID2A9M)。
图5示出了叠合的具有天然/原始可变结构域(灰色)和含有λ框架IV的VL结构域(黑色)的人源化小鼠单克隆抗体的两个scFv构建体的标准化SE-HPLC色谱图。标准化的scFv单体峰用星号(*)标注，而低聚物和聚集体峰用括号突出显示。
具体实施方式
与用于产生用于使非人抗体人源化/稳定化或人抗体稳定化的人框架的现有方法相比，本发明的特征是以下事实：本发明涉及将κ可变轻链结构域中的κ连接区段置换为λ链接区段(框架区IV)，从而产生具有改进的蛋白质稳定性和降低的聚集倾向的κ–λ嵌合可变轻链结构域。本发明还涉及AHo101位(框架区III)处的κ共有残基的突变以及将所述κ共有残基置换为λ共有残基以支持将λ连接区段封装在κ–λ嵌合可变轻链结构域中，进而进一步改进蛋白质稳定性并进一步降低聚集倾向。
因此，在第一方面，本发明涉及一种抗体VL结构域，其包含：(i)人Vκ框架区I至III；(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3；以及(iii)框架区IV，其选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
条件是如果在b.或c.的情况下，框架区IV具有序列FGQGTKLTVLG(SEQIDNo.15)，
(w)所述人Vκ框架区I至III不同于以下克隆列表中所示的框架区：FW1.4gen(SEQIDNO:4)、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt以及43-FW1.4opt；
(x)所述人Vκ框架区I至III不同于通过从如以下克隆列表中所示的框架区序列重新排列而可获得的序列：FW1.4gen(SEQIDNO:4)、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt以及43-FW1.4opt；
(y)所述人Vκ框架区I至III不同于通过使序列FW1.4gen(SEQIDNO:4)在15、22、48、57、74、87、88、90、92、95、97以及99(AHo编号)中的一个或多个位置处进行突变而可获得的序列；或
(z)与SEQIDNo:8的人Vκ序列中的相应区域相比，所述人Vκ框架区I至III包含不超过五个突变，特别是与SEQIDNo:8的人Vκ序列相比，少于五个、少于四个、少于三个、特别是仅一个或没有突变。
在本发明的上下文中，克隆375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt和43-FW1.4opt指的是Borras等(上述引文)中所列的克隆。这些克隆是VL结构域FW1.4gen(SEQIDNO:4)的变体，其在VL框架区中的某些位置上与FW1.4gen(SEQIDNO:4)的那些有所不同，如表5中所示。
在一个具体实施方案中，所述框架区IV不是FGQGTKLTVLG(SEQIDNo.15)。
在本发明的上下文中，术语“抗体”用作“免疫球蛋白”(Ig)的同义词，所述免疫球蛋白被定义为属于IgG、IgM、IgB、IgA、或IgD类(或其任何亚类)的蛋白质，并且包括所有常规已知的抗体及其功能片段。抗体/免疫球蛋白的“功能片段”被定义为抗体/免疫球蛋白中保留抗原结合区的片段(例如，IgG的可变区)。抗体的“抗原结合区”通常存在于抗体的一个或多个高变区中，即，CDR-1、CDR-2和/或CDR-3区；然而，可变“框架”区也可以在抗原结合中起重要作用，诸如通过为CDR提供支架。
在本发明的上下文中，使用由Honegger&Plückthun提出的编号系统(Honegger&Plückthun,J.Mol.Biol.309(2001)657-670)，除非另外具体提及。另外，以下残基被定义为CDR区：CDR-L1:L24-L42；CDR-L2:L58-L72；CDR-L3:L107-L138；CDR-H1:H27-H42；CDR-H2:H57-H76；CDR-H3:H109-H138。优选地，“抗原结合区”包括可变轻(VL)链的至少氨基酸残基4至149以及可变重(VH)链的5至144，更优选地是VL的氨基酸残基3至149以及VH的4至146，并且特别优选的是整个VL和VH链(VL的氨基酸1至149位以及VH的1至149位；根据图2编号)。图2中指出了框架和CDR区。用于本发明中的免疫球蛋白的优选类别是IgG。本发明的“功能片段”包括F(ab')2片段、Fab片段以及scFv的结构域.。F(ab')2或Fab可以被工程化来最小化或完全去除CH1与CL结构域之间存在的分子间二硫键相互作用。本发明的抗体或其功能片段可以是如第[0055]段至第[0058]段中进一步描述的双功能性或多功能性构建体的部分。
在本发明的上下文中，术语“Vκ”和“Vλ”指的是根据序列同一性和同源性分组的抗体轻链序列的家族。用于确定序列同源性的方法例如通过使用同源性检索矩阵诸如BLOSUM(Henikoff,S.&Henikoff,J.G.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)10915-10919)，且用于根据同源性对序列进行分组的方法对于本领域普通技术人员而言是熟知的。对于Vκ和Vλ两者，可以鉴别不同的亚家族(参见，例如，Knappik，上述引文，其将Vκ分组为Vκ1至Vκ4并将Vλ分组为Vλ1至Vλ3)。
在本发明的上下文中，术语“通过从如克隆列表中所见的框架区序列重新排列而可获得的序列：……”指的是可以通过以下方式产生的序列：使用(i)所述列表(参见Borras，上述引文)中包括的所有序列中的给定位置处所存在的氨基酸残基，或(ii)在Borras(Borras，上述引文)中已优化的位置上的氨基酸残基，任一个氨基酸残基存在于所述序列中的不同位置(Borras(Borras，上述引文)中的15、22、40、49、58、69、70、72、74、77、79以及81位；对应于AHo15、22、48、57、74、87、88、90、92、95、97以及99位)中的一个位置处。
在本发明的一个实施方案中，框架区III的AHo101位(根据Honegger和Plückthun的编号系统是101位)的氨基酸残基为人Vλ共有序列中所述位置处所存在的氨基酸残基，特别是其中所述氨基酸残基不同于苯丙氨酸，更特别是其中所述氨基酸残基为谷氨酸。
在本发明的一个实施方案中，所述Vκ框架区I至III属于选自Vκ1、Vκ2、Vκ3以及Vκ4的Vκ结构域亚家族，特别是属于Vκ1家族。
在本发明的上下文中，Vκ结构域亚家族由SEQIDNO:23至26中所示的共有序列代表。在使用第[0039]段中所列的方法时，如果给定抗体可变轻链结构域显示出与所述Vκ结构域亚家族具有最高程度的同源性，那么它被视作是属于Vκ结构域亚家族。
在具体实施方案中，Vκ框架区I至III与(a)最接近的人种系序列，或(b)共有序列SEQIDNO:23至26中的一个，特别是SEQIDNO:23相比包含不多于五个突变；与(a)最接近的人种系序列，或(b)共有序列SEQIDNO:23至26中的一个，特别是SEQIDNO:23相比，特别是少于五个、少于四个、少于三个、特别是仅一个或没有突变。
在本发明的一个实施方案中，所述Vκ框架区I至III是选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:8，特别是SEQIDNO:8的序列中存在的框架区。
在本发明的一个实施方案中，所述CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3独立地选自：(i)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其来自对所关注抗原具有特异性的亲本非人抗体，特别是来自亲本兔抗体或来自亲本啮齿动物抗体，特别是亲本小鼠或大鼠抗体；(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其来自包含Vκ结构域的亲本人或人源化抗体，特别是来自批准用于治疗或以其他方式商业化的抗体；(iii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其得自根据(i)或(ii)的CDR结构域，特别是通过优化根据(i)或(ii)的一个或多个CDR结构域而获得的CDR结构域；以及(iv)有待被根据(i)、(ii)和/或(iii)的一个或多个CDR结构域置换的CDR结构域。
在本发明的一个实施方案中，框架区I至IV是如选自以下各项的序列中所存在的框架区的组合：SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12以及SEQIDNO:13。
在第二方面，本发明涉及一种分离的抗体或其功能片段，它们包括根据本发明的抗体VL结构域。
在具体的实施方案中，抗体VL结构域对所关注的靶标具有结合特异性。
如本文所使用，结合分子“特异于/对……具有特异性”，“特异地识别”，或“特异地结合至”靶标例如像人CD3，即这种结合分子能够区分这种靶生物分子与一种或多种参考分子的情况，因为结合特异性不是绝对的，而是相对特性。在它最普遍的形式中(并且在未提及定义参考物时)，“特异性结合”是指结合分子(如根据本领域中已知的特异性测定方法所确定区分所关注的靶生物分子与不相关生物分子)的能力。这类方法包括但不限于蛋白质印迹法、ELISA、RIA、ECL、IRMA测试以及肽扫描。例如，可以执行标准ELISA测定。评分可以通过标准显色(例如，有辣根过氧化物的第二抗体和有过氧化氢的四甲基联苯胺)来进行。某些孔中的反应通过例如在450nm下的光密度来评分。典型背景(＝阴性反应)可以是约0.1OD；典型的阳性反应可以是约1OD。这意味着阳性评分与阴性评分之间的比率可以是10倍或更高。通常，结合特异性的测定不使用单一的参考生物分子来进行，而是使用一组约三至五个不相关的生物分子诸如奶粉、BSA、转铁蛋白等来进行。
在本发明的上下文中，术语“约”或“大约”意指处在给定值或范围的90％与110％之间。
然而，“特异性结合”还可以是指结合分子以区分靶生物分子与用作参考点的一种或多种密切相关的生物分子的能力。另外，“特异性结合”可以涉及结合分子区分其靶抗原的不同部分，例如靶生物分子的不同结构域、区或表位，或靶生物分子的一个或多个重要的氨基酸残基或一段或多段氨基酸残基的能力。
在本发明的上下文中，术语“表位”是指给定的靶生物分子中靶生物分子与结合分子之间进行特异性结合所需的部分。表位可以是连续的，即，通过靶生物分子中所存在的邻近结构元件形成；或是不连续的，即，通过靶生物分子的一级序列中(诸如作为靶标的蛋白质的氨基酸序列中但被靶生物分子采纳的三维结构中(诸如在体液中)紧密相邻的)不同位置上的结构元件形成。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其功能片段选自：IgG抗体、Fab片段以及scFv片段。
在本发明的另一个具体实施方案中，分离的抗体或其功能片段是为抗体形式的双特异性构建体，所述双特异性构建体选自：单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚scDb(LD-scDb)、环状二聚scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞衔接子(BiTE；串联二scFv)、串联三scFv、三抗体、双特异性Fab2、二微型抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、二双抗体、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体，诸如bsAb(联接至轻链的C末端的scFv)、Bs1Ab(联接至轻链的N末端的scFv)、Bs2Ab(联接至重链的N末端的scFv)、Bs3Ab(联接至重链的C末端的scFv)、Ts1Ab(联接至重链与轻链两者的N末端的scFv)、Ts2Ab(联接至重链的C末端的dsscFv)，以及孔中纽(KiHs)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)和双重抗体(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)。特别适于在本文使用的是单链双抗体(scDb)，具体地说是双特异性单体scDb。
双特异性scDb具体地说是双特异性单体scDb具体包含两个可变重链结构域(VH)或其片段，以及两个可变轻链结构域(VL)或其片段，这两者通过接头L1、L2以及L3按以下顺序连接：VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA、VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA、VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA、VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA、VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成第一抗原的抗原结合位点，并且VLB和VHB共同形成第二抗原的抗原结合位点。
接头L1具体是具有2-10个氨基酸、更具体是3-7个氨基酸、以及最具体是5个氨基酸的肽，并且接头L3具体是具有1-10个氨基酸、更具体是2-7个氨基酸、以及最具体是5个氨基酸的肽。中间接头L2具体是具有10-40个氨基酸、更具体是15-30个氨基酸、以及最具体是20-25个氨基酸的肽。
本发明的双特异性构建体可以使用本领域中已知的任何常规的抗体生产方法来产生(参见，例如针对双特异性构建体生产的Fischer,N.&Leger,O.,Pathobiology74(2007)3-14；针对双特异性双抗体和串联scFv的Hornig,N.&A.,MethodsMol.Biol.907(2012)713-727和WO99/57150)。用于制备本发明的双特异性构建体的合适的方法的特定实例尤其还包括Genmab(参见Labrijn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA110(2013)5145-5150)和Merus(参见deKruif等，Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。用于产生包含功能性抗体Fc部分的双特异性抗体的方法在本领域中也是已知的(参见，例如Zhu等，CancerLett.86(1994)127-134)；以及Suresh等，MethodsEnzymol.121(1986)210-228)。
这些方法通常涉及产生单克隆抗体：例如借助于使用杂交瘤技术使骨髓瘤细胞与已用所需抗原免疫的小鼠的脾细胞融合(参见，例如Yokoyama等，Curr.Protoc.Immunol.第2章，第2.5单元，2006)，或借助于重组抗体工程化(抗体库克隆或噬菌体展示/酵母展示)(参见，例如Chames&Baty,FEMSMicrobiol.Letters189(2000)1-8)；使用已知的分子克隆技术来将两个不同的单克隆抗体的抗原结合结构域或其片段或部分组合以给出双特异性构建体。
在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其功能片段包含VH结构域，所述结构域属于选自以下的VH结构域亚家族：VH1A、VH1B、VH2、VH3、VH4、VH5以及VH6，特别是属于VH结构域亚家族VH3或VH4、特别是属于VH结构域亚家族VH3。
在本发明的上下文中，VH结构域亚家族由SEQIDNO:27至33中所示的共有序列代表。在使用第[0039]段中所列的方法时，如果给定抗体可变重链结构域显示出与所述VH结构域亚家族具有最高程度的同源性，那么它被视作是属于VH结构域亚家族。
在具体实施方案中，VH结构域与(a)最接近的人种系序列，或(b)共有序列SEQIDNO:28至34中的一个，特别是SEQIDNO:30相比包含不多于五个突变；与(a)最接近的人种系序列，或(b)共有序列SEQIDNO:27至33中的一个，特别是SEQIDNO:30相比，特别是少于五个、少于四个、少于三个、特别是仅一个或没有突变。
在第三方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的分离的抗体或其功能片段，以及任选地包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在第四方面，本发明涉及一种核酸序列或核酸序列集合，所述核酸序列编码本发明中的任一个的抗体VL结构域、或本发明的分离的抗体或其功能片段；和/或涉及一种或多种通过根据本发明的第九方面的方法可获得的核酸序列。
在第五方面，本发明涉及一种载体或载体集合，所述载体包含本发明的核酸序列或核酸序列集合。
在第六方面，本发明涉及一种宿主细胞(尤其是一种表达宿主细胞)，所述宿主细胞包含本发明的核酸序列或核酸序列集合、或本发明的载体或载体集合。
在第七方面，本发明涉及一种用于产生本发明中的任一个的抗体VL结构域、本发明的分离的抗体或其功能片段的方法，其包括以下步骤：表达本发明的核酸序列或核酸序列集合、本发明的载体或载体集合、或本发明的宿主细胞(尤其是表达宿主细胞)。
在第八方面，本发明涉及一种用于产生人源化兔抗体或啮齿动物抗体尤其是小鼠或大鼠抗体的方法，其包括以下步骤：
a)用目的抗原使兔或啮齿动物(尤其是小鼠或大鼠)免疫；
b)分离至少一种目的抗体；以及
c)将所述至少一种目的抗体的VLCDR区克隆到本发明的编码抗体VL结构域的
核酸序列中。
在具体的实施方案中，所述抗体VL结构域中的框架区IV在产生人源化兔抗体时不是FGQGTKLTVLG(SEQIDNo.15)。
在具体的实施方案中，本发明的方法还包括以下步骤中的一个或多个：
aa.克隆分离与目的抗原相互作用的亲和力成熟的记忆B细胞，特别是通过使用荧光激活细胞分拣；
ab.在不需要单个B细胞克隆永生化的共培养系统中培养单个B细胞；
ac.在基于细胞的ELISA中筛选B细胞培养物上清液，以鉴别结合至目的抗原的至少一种抗体；和/或
ad.将至少一种抗体的VHCDR区克隆到编码人抗体VH结构域的核酸序列中。
用于兔抗体或啮齿动物抗体的人源化的方法对于本领域的普通技术人员而言是熟知的(参见，例如，Borras，上述引文；Rader等，TheFASEBJournal,expressarticle10.1096/fj.02-0281fje，于2002年10月18日在线公开；Yu等，(2010)AHumanizedAnti-VEGFRabbitMonoclonalAntibodyInhibitsAngiogenesisandBlocksTumorGrowthinXenograftModels.PLoSONE5(2):e9072.doi:10.1371/journal.pone.0009072)。因此，兔或啮齿动物的免疫可以通过以下方式进行：用目的抗原诸如蛋白质进行，或在肽或蛋白质抗原的情况下，通过用编码所关注的肽或蛋白质的核酸例如质粒来对兔进行DNA免疫。
在第九方面，本发明涉及一种用于产生编码本发明的抗体VL结构域的核酸序列、或编码根据本发明的分离的抗体或其功能片段的一个或多个核酸序列的方法，其包括在一个或多个步骤中组合核酸序列，所述核酸序列编码(i)人Vκ框架区I至III；(ii)CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3；以及(iii)框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
特别是使用以下方法中的一种：
i.在包含编码人或人源化Vκ结构域的核酸序列的核酸构建体(特别是重组载体)中通过框架区IV置换所述Vκ框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
ii.在一个或多个步骤中将编码以下各项的一个或多个核酸序列插入包含编码框架区IV的核酸序列的核酸构建体、特别是重组载体：(i)人Vκ框架区I至III；以及(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其中所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
iii.在编码人或人源化Vκ结构域的核酸序列中使所述编码框架区IV的核酸序列突变，以产生框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；或
iv.在一个或多个步骤中在包含编码包含人Vκ框架区I至III，CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3以及框架区IV的轻链结构域的核酸序列的核酸构建体,特别是重组载体中，利用编码来自目的抗体的对应一个或多个CDR结构域的一个或多个核酸序列置换编码所述CDR结构域的核酸序列中的一个或多个，其中所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下列表的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下列表的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
在本发明的方法的具体实施方案中，其中在(b)或(c)框架区IV具有序列FGQGTKLTVLG(SEQIDNo.15)的情况下，
(w)所述人Vκ框架区I至III不同于以下克隆列表中所存在的框架区：FW1.4gen(SEQIDNO:4)、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt以及43-FW1.4opt；
(x)所述人Vκ框架区I至III不同于通过从如以下克隆列表中所列的框架区序列重新排列而可获得的序列：FW1.4gen(SEQIDNO:4)、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt以及43-FW1.4opt；
(y)所述人Vκ框架区I至III不同于通过使序列FW1.4gen(SEQIDNO:4)在15、22、48、57、74、87、88、90、92、95、97以及99(AHo编号)中的一个或多个位置处进行突变而可获得的序列；或
(z)与SEQIDNo:8的人Vκ序列中的相应区域相比，所述人Vκ框架区I至III包含不超过五个突变，特别是与SEQIDNo:8的人Vκ序列相比，少于五个、少于四个、少于三个、特别是仅一个或没有突变。
在具体的实施方案中，所述框架区IV在所述CDR结构域中的一个或多个是兔来源时不是FGQGTKLTVLG(SEQIDNo.15)。
实施例
以下实施例说明本发明，而不限制其范围。
实施例1：具有示例性兔CDR的scFv构建体的构建
我们的目标是鉴别相对于解折叠和聚集倾向显示出改进的稳定性的可变结构域。此外，这些结构域应尽可能地接近人种系抗体库以使引发人类体内的免疫应答的风险最小化。令人意外的是，我们发现，VH3共有框架与由来自共有Vκ1的框架区I至III和来自不同的Vλ结构域的框架区IV(参见图1)构成的嵌合VL结构域的组合产生scFv构建体具有优异的生物物理特性。
我们发明的起点是如在1992年公开(Carter，上述引文)的人VH3和Vκ1共有框架Hu-4D5。我们将示例性兔抗-TNFα抗体的CDR(WO/2009/155723)移植到如所(Rader2000，上述引文；WO2005/016950；WO2008/004834)描述的hu-4D5可变结构域中。人源化可变结构域通过如由Borras，(上述引文所描述)的柔性肽接头联接，从而产生单链Fv(scFv)片段(scFv1)。
除了hu-4D5之外，测试另一种公开的框架解决方案，即框架FW1.4gen(scFv2)，所述框架的广泛的生物物理数据已被公开(Borras，上述引文)。框架FW1.4gen与hu-4D5相比时包括若干氨基酸置换，因此偏离人共有区。在VH中，这类差异可能由亲和力成熟产生，一方面因为其来源于人cDNA文库，含有经历过体细胞超突变的成熟抗体的序列，而非种系序列，并且另一方面因为作者出于容纳兔CDR的目的已引入若干突变。在VL中，有意地引入很少的突变或不引入突变，从而表明大部分差异由种系序列使用了体细胞超突变产生，或可能是文库克隆程序所致的人为现象。
基于hu-4D5或FW1.4gen两个构建体(分别是scFv1和scFv2)的热解折叠的实验测定显示了scFv1的优异性能，即框架与人共有序列具有更高的同源性，因此与参考文献是一致的。令人意外的是，这种优异的稳定性在应激条件下储存期间并未转化为关于单分散性的更高的稳定性(参见表4)。相反，scFv2此处显示出更好的稳定性。
为了使观察到的稳定性的差异合理化，更仔细地检查框架内的序列变异。在框架IV区内鉴别出具有五个氨基酸的片段，所述片段在转化成FW1.4gen中的Vκ1的共有序列(scFv3)(参见图3)时在应激稳定性研究中会导致单体状态的稳定性受损。
这个发现是高度出乎意料的，因为它与普遍理解相矛盾，所述普遍理解即为共有序列(在这种情况下，Vκ1的共有序列)将关于相应的可变结构域的稳定性呈现出最有利的解决方案。基于这个发现，我们打算进一步检查模型系统中的结构域稳定性的决定因素。由于FW1.4的框架区IV内的五个氨基酸使得连接区段(框架区IV)类似于λ-类型框架区IV序列，而非κ-类型，因此我们假设λ-类型连接区段对于Vκ1-VH3可变结构域的稳定性比κ-类型连接区段可能更有利。
事实上，我们发现将Vκ1框架区IV完全置换为对应的Vλ框架区(scFv5，scFv9)使得就热解折叠的中点(表3)和应激稳定性研究期间的单体状态的稳定性(表4)两方面而言与scFv1或scFv2相比稳定性特征更有利。另外，将不同的截短的Vλ框架区IV种系基序引入到Vκ1共有框架(scFv7，scFv10)的背景中显示出一些稳定效应。重要的是，将Vκ1框架区IV完全置换为Vλ区IV的免疫原性可能较低，因为所有单独框架区在这种方法的情况下保持与种系一致，或与种系共有区一致。
此外，框架III中的AHo101位置通过比较对框架区IV的封装作出贡献的Vκ和Vλ可变结构域的结构模型(图4)来鉴别。在这个位置引入Vλ共有残基(scFv4，scFv6，scFv8)会导致进一步提高热解折叠的结构域稳定性(表3)和应激稳定性(表4)。
总之，已发现在scFv可变结构域构建体的背景下，优异的稳定性特征通过将来自不同的Vλ种系基因的共有框架区IV与Vκ序列的框架区I至III进行组合来实现。这些人工和嵌合可变结构域的稳定性进一步通过可变轻链结构域的框架区III中的F101E修改(根据AHo编号方案)来改进，所述F101E即为空间上接近框架区IV的位置。
重要的是，基于公开的情况(ProteinEngineering,Design&Selection25(2012)485–505)，可变结构域的优选特性也有望转化为其他抗体形式。
从参考文献(WO2009/155723)鉴别示例性兔结合剂，并且使用如Borras等(Borras，上述引文)中所公开的CDR定义将所述结合剂的CDR移植到人共有VH3/Vκ1框架的相应的可变结构域中(Rader2000，上述引文；WO/2005/016950；WO2008/004834；US8,293,235)。对于兔CDR的环移植，将根据Honegger(Honegger&Plückthun，上述引文；参见图2)进行编号的序列片段CDR-L1(L24-L42)、CDR-L2(L58-L72)、CDR-L3(L107-L138)、CDR-H1(H27-H42)、CDR-H2(H57-H76)、CDR-H3(H109-H138)转移到人框架中。基于这些人源化可变结构域，scFv构建体通过借助于柔性Gly4-Ser接头连接VL和VH来产生，从而产生NH2-VL-接头-VH-COOH的构型。
方法
构建体设计和制造
从头合成所得氨基酸序列，并且将其克隆到针对大肠杆菌表达基于pET26b(+)主链(Novagen)进行修改的表达载体中。将表达构建体转化至大肠杆菌菌株BL12(DE3)(Novagen)中，并且在2YT培养基(Sambrook,J.,等，MolecularCloning:ALaboratoryManual)中将细胞培养作为起始培养物。接种表达培养物，并且在37℃和200rpm下在带挡板的烧瓶中孵育所述表达培养物。一旦OD600nm达到1，就通过添加IPTG至0.5mM的终浓度来诱导蛋白质表达。在过夜表达之后，通过以4000g离心来收获细胞。对于包涵体的制备，将细胞沉淀在IB重悬浮缓冲液(50mMTris-HClpH7.5，100mMNaCl，5mMEDTA，0.5％曲通(Triton)X-100)中重悬。向细胞浆液补充1mMDTT、0.1mg/mL溶菌酶、10mM亮抑蛋白酶肽、100μMPMSF以及1μM胃酶抑素。通过3个超声均化循环来溶解细胞，同时在冰上冷却所述细胞。随后添加0.01mg/mLDNA酶，并且在室温下将匀浆孵育20分钟。通过以10,000g和4℃离心来使包涵体沉降下来。将IB重悬浮在IB重悬浮缓冲液中，并且通过超声处理来均化，之后进行另一次离心。总共最少3次用IB重悬浮缓冲液进行洗涤步骤，并且随后用IB洗涤缓冲液进行2次洗涤，以产生最终的IB。
对于蛋白质重折叠，以5mL/g湿润IB的比率将分离的IB重悬浮在增溶缓冲液(100mMTris/HClpH8.0，6MGdn-HCl，2mMEDTA)中。将增溶作用在室温下孵育30分钟，直到添加DTT至20mM的终浓度，并且将孵育另外继续30分钟。在增溶作用完成之后，通过以8500g和4℃离心10分钟来使溶液变澄清。以0.5g/L的溶解蛋白质的最终蛋白质浓度快速稀释在重折叠缓冲液(通常为：100mMTris-HClpH8.0，4.0M尿素，5mM半胱氨酸，1mM胱氨酸)中来进行重折叠。重折叠反应常规最少孵育14小时。将所得蛋白质溶液浓缩，并且通过与天然缓冲液(50mM柠檬酸盐-磷酸盐pH6.4，200mMNaCl)渗滤交换缓冲液。通过在合适的树脂材料(例如，Superdex75，GEHealthcare)上进行尺寸排阻色谱法来纯化重折叠蛋白质。通过尺寸排阻HPLC分析分离的单体部分，SDS-PAGE用于分析纯度，并且UV/Vis光谱法用于分析蛋白质含量。将蛋白质浓度调节到所需水平，并且进行稳定性分析。
结构模型的比较
使用PDB中获得的结构模型的实例(分别是PDBID1FVC和PDBID2A9M)来对可变结构域VLκ和VLλ的三维结构进行比较。VL框架区IV的封装的分析揭示了从147位向上的侧链取向的差异。此外，在Vκ和Vλ结构中，氨基酸侧链在101位的取向是不同的。如图4所示，中心氨基酸(101位)的不同封装是显而易见的。在Vκ的情况下，苯丙氨酸101在λ可变结构域中指示在结构域的核心处，然而，101位处的谷氨酸被暴露于溶剂，并且V147(箭头)转而定位到疏水核上。基于这种情况，产生含有氨基酸交换F101E的可变结构域(SEQIDNo:8，11和13)来容纳Vλ框架IV的Vλ特异性封装。
实施例2：测定scFv构建体的生物物理数据
热解折叠
测试的构建体的热解折叠的过渡中点是通过差示扫描荧光测定法(DSF)来测定，基本上如Niesen(Niesen等，NatProtoc.2(2007)2212-21)所述。DSF测定在qPCR仪(例如，MX3005p,AgilentTechnologies)上进行。将样品稀释在25μL总体积的含有最终浓度为5xSYPRO橙的缓冲液(柠檬酸盐-磷酸盐pH6.4，0.25MNaCl)中。在缓冲液探索性实验中，针对所有构建体，测定解折叠温度的pH依赖性并且观察可比pH特征。一式三份测量样品，并且设定程序使得从25℃至96℃的温度斜升。获取荧光信号，并且用GraphPadPrism(GraphPadSoftwareInc.)分析原始数据。
应激稳定性研究
经两周且在37℃储存下通过尺寸排阻-高效液相色谱法(SE-HPLC)分析蛋白质的低聚性，并且通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质的降解。在研究之前，将样品浓缩为1、10和40g/L，并且确定t0时间点。通过在ShodexKW-402.5-4F(ShowaDenko)上分离样品并评价所得色谱图来量化单体含量。为了计算蛋白质单体的相对百分比，将单体峰的面积除以不可归于样品基质的峰的总面积。用AnykDMini-ProteanTGX凝胶(Bio-RadLaboratories)进行SDS-PAGE分析来评定蛋白质降解，并且利用考马斯亮蓝来染色。在不同的时间点通过用配备有Nanoquant平板的InfinityreaderM200Pro(TecanGroupLtd.)进行UV-Vis光谱法来监测蛋白质浓度。
实施例3：来自市售人源化小鼠单克隆抗体的scFv构建体的构建
为了证实所提出的概念对抗体可变结构域的稳定作用具有广泛适用性，基于包含Vκ轻链的市售人源化小鼠单克隆抗体产生两个单链Fv构建体。对于第一构建体，原始可变结构域序列按公开的情况用于IgG的氨基酸序列，而对于第二构建体，使用修改的序列，其中可变轻链结构域的框架区IV被置换为来自λ种系基因的相应序列。在scFv构建体中，可变结构域通过具有20个氨基酸的柔性(Gly4Ser)4接头(SEQIDNO:1)来联接，从而产生如在模型构建体scFv1至scFv10(参见表2)中所使用的NH2-VL-接头-VH-COOH的构型。如上所述进行scFv分子的表达和重折叠，并且重折叠蛋白质通过在蛋白质L树脂上进行亲和色谱法来纯化。通过SE-HPLC对纯化的蛋白质的分析揭示了构建体的可生产性的显著差异，所述显著差异表现为含有VL中的λ框架IV的构建体的显著提高的单体含量(参见图5)。此外，具有原始序列和含有VL中的λ框架IV的分子的构建体的热解折叠分析分别产生69.9℃和71.2℃的解折叠中点。这个观察与第[0082]段中所描述的结果一致。
实施例4：具有较短接头序列的scFv构建体的构建
为了分析接头序列的影响，以与上文在实施例1中所描述相同的方式使用较短的具有15个氨基酸的(Gly4Ser)3接头(SEQIDNO:34)来制得替代构建体。除了接头，两个构建体scFv11和scFv12分别对应于构建体scFv1和scFv5(参见表2)。如上文在实施例2中所描述进行应激稳定性研究。如表4中所示，较短接头含有VL中的λ框架IV的构建体scFv12相对于具有共有κ轻链scFv11的构建体显示出增加的稳定性。分子的总稳定性低于具有较短接头的相应构建体。众所周知的是，通过使用20聚体或25聚体接头替代15聚体接头能增加scFv稳定性(参见和Plückthun,J.Mol.Biol.305(2001)989-1010)。因此，这些发现与利用20聚体接头的结果是一致的，并且证实可变结构域的稳定性通过将λ框架IV引入VL中来提高。
表1：蛋白质序列表
(在SEQIDNO:23至33中，CDR区以粗体和斜体表示)
表2：不同scFv构建体的可变结构域的组合
| scFv构建体 | 可变结构域1 | 接头 | 可变结构域2 |
| scFv1 | SEQ ID 2 | SEQ ID 1 | SEQ ID 3 |
| scFv2 | SEQ ID 4 | SEQ ID 1 | SEQ ID 518 --> |
| scFv3 | SEQ ID 6 | SEQ ID 1 | SEQ ID 3 |
| scFv4 | SEQ ID 11 | SEQ ID 1 | SEQ ID 14 |
| scFv5 | SEQ ID 9 | SEQ ID 1 | SEQ ID 14 |
| scFv6 | SEQ ID 8 | SEQ ID 1 | SEQ ID 14 |
| scFv7 | SEQ ID 7 | SEQ ID 1 | SEQ ID 14 |
| scFv8 | SEQ ID 13 | SEQ ID 1 | SEQ ID 14 |
| scFv9 | SEQ ID 12 | SEQ ID 1 | SEQ ID 14 |
| scFv10 | SEQ ID 10 | SEQ ID 1 | SEQ ID 14 |
| scFv11 | SEQ ID 2 | SEQ ID 42 | SEQ ID 3 |
| scFv12 | SEQ ID 9 | SEQ ID 42 | SEQ ID 14 |
表3：通过差示扫描荧光测定法测定所有构建体的热解折叠的过渡中点
表4：储存期间的单体损失
注意：斜体条目来自具有Vκ-类型框架IV区的scFv构建体
表5：Borras等(上述引文)中所列的克隆列表和序列变化
下文所列的所有克隆都具有FW1.4gen的序列(SEQIDNO:4)，但区别在于下文以粗体表示的位置(根据Borras等(上述引文)对位置编号)
| VL位置 | 15 | 22 | 40 | 49 | 58 | 69 | 70 | 72 | 74 | 77 | 79 | 81 |
| FW1.4gen(SEQ ID NO:4) | V | T | P | Y | V | A | E | T | T | S | Q | D |
| 375-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | Q | T | T | S | Q | D |
| 435-FW1.4opt | V | K | P | Y | V | A | E | T | T | S | Q | D |
| 509-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | E | T | T | S | Q | D |
| 511-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | E | T | T | S | Q | D |
| 534-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | E | T | T | S | Q | D |
| 567-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | Q | T | T | S | Q | D |
| 578-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | Q | T | T | S | Q | D |
| 1-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | E | T | T | S | Q | D |
| 8-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | D | T | A | S | Q | D |
| 15-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | E | T | T | S | Q | D |
| 19-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | Q | T | T | S | Q | D |
| 34-FW1.4opt | L | T | S | Y | V | A | E | S | T | S | Q | D |
| 35-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | E | T | T | S | Q | D |
| 42-FW1.4opt | V | T | P | Y | V | T | E | T | T | S | Q | D |
| 43-FW1.4opt | V | K | P | Y | F | A | E | T | T | G | E | A |
*****
本发明在范围上不受本文描述的特定实施方案的限制。事实上，本领域的技术人员将根据前述说明理解本发明中除了本文描述的那些修改之外的各种修改。这类修改意图落在所附权利要求书的范围内。
在相应专利法的允许范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、参考文献以及其他材料以引用的方式并入本文。
Claims (17)
1.一种抗体VL结构域，其包含：(i)人Vκ框架区I至III；(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3；以及(iii)框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下序列的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下序列的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
条件是，如果在b.或c.的情况下，框架区IV具有序列FGQGTKLTVLG(SEQIDNo.15)，
(w)所述人Vκ框架区I至III不同于以下克隆列表中所示的框架区：FW1.4gen(SEQIDNO:4)、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt以及43-FW1.4opt；
(x)所述人Vκ框架区I至III不同于通过从如以下克隆列表中所示的框架区序列重新排列而可获得的序列：FW1.4gen(SEQIDNO:4)、375-FW1.4opt、435-FW1.4opt、509-FW1.4opt、511-FW1.4opt、534-FW1.4opt、567-FW1.4opt、578-FW1.4opt、1-FW1.4opt、8-FW1.4opt、15-FW1.4opt、19-FW1.4opt、34-FW1.4opt、35-FW1.4opt、42-FW1.4opt以及43-FW1.4opt；
(y)所述人Vκ框架区I至III不同于通过使序列FW1.4gen(SEQIDNO:4)在15、22、48、57、74、87、88、90、92、95、97以及99中的一个或多个位置处进行突变而获得的序列；或
(z)与具有SEQIDNo:8的人Vκ序列中的相应区域相比，所述人Vκ框架区I至III包含不超过五个突变，特别是与具有SEQIDNo:8的人Vκ序列相比，少于五个、少于四个、少于三个、特别是仅一个或没有突变。
2.根据权利要求1所述的抗体VL结构域，其特征在于，框架区III的AHo101位的氨基酸残基为人Vλ共有序列中所述位置处所存在的氨基酸残基，特别是其中所述氨基酸残基不同于苯丙氨酸，更特别是其中所述氨基酸残基为谷氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的抗体VL结构域，其特征在于，所述Vκ框架区I至III是来自Vκ1家族。
4.根据权利要求3所述的抗体VL结构域，其特征在于，所述Vκ框架区I至III为选自以下的序列中所存在的框架区：SEQIDNO:2和SEQIDNO:8，特别是SEQIDNO:8。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体VL结构域，其特征在于，所述CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3独立地选自：(i)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其来自对目的抗原具有特异性的亲本非人抗体，特别是来自亲本兔抗体或来自亲本啮齿动物抗体，特别是亲本小鼠或大鼠抗体；(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其来自包含Vκ结构域的亲本人或人源化抗体，特别是来自批准用于治疗或以其他方式商业化的抗体；(iii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其得自根据(i)或(ii)的CDR结构域，特别是通过优化根据(i)或(ii)的一个或多个CDR结构域而获得的CDR结构域；以及(iv)将被根据(i)、(ii)和/或(iii)的一个或多个CDR结构域置换的CDR结构域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体VL结构域，其特征在于，所述框架区I至IV为选自以下的序列中所存在的框架区的组合：SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12以及SEQIDNO:13。
7.一种分离的抗体或其功能片段，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗体VL结构域。
8.根据权利要求7所述的分离的抗体或其功能片段，其包含VH结构域，所述VH结构域属于选自以下的VH结构域亚家族：VH1A、VH1B、VH2、VH3、VH4、VH5以及VH6，特别是属于VH结构域亚家族VH3或VH4、特别是属于VH结构域亚家族VH3。
9.根据权利要求7或8所述的分离的抗体或其功能片段，其选自：IgG抗体、Fab片段、scFv片段、单链双抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚scDb(LD-scDb)、环状二聚scDb(CD-scDb)、双特异性T细胞衔接子(BiTE；串联二scFv)、串联三scFv、三抗体、双特异性Fab2、二微型抗体、四抗体、scFv-Fc-scFv融合体、二双抗体、DVD-Ig、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv2-Fc、IgG-scFv融合体，如bsAb(联接至轻链的C末端的scFv)、Bs1Ab(联接至轻链的N末端的scFv)、Bs2Ab(联接至重链的N末端的scFv)、Bs3Ab(联接至重链的C末端的scFv)、Ts1Ab(联接至重链与轻链两者的N末端的scFv)、Ts2Ab(联接至重链的C末端的dsscFv)，以及孔中纽(Knob-into-Holes，KiHs)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)和双重抗体(通过Duobody技术制备的双特异性IgG)。
10.一种药物组合物，其包含根据权利要求7至9中任一项所述的分离的抗体或其功能片段，和任选地药学上可接受的载体和/或赋形剂。
11.一种核酸序列或核酸序列集合，所述核酸序列或核酸序列集合(i)编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗体VL结构域，或根据权利要求7至9中任一项所述的分离的抗体或其功能片段；或(ii)能通过根据权利要求17所述的方法获得的分离的抗体或其功能片段。
12.一种载体或载体集合，所述载体或载体集合包含根据权利要求11所述的核酸序列或核酸序列集合。
13.一种宿主细胞，特别是表达宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求11所述的核酸序列或核酸序列集合，或根据权利要求12所述的载体或载体集合。
14.一种方法，所述方法用于产生根据权利要求1至6中任一项所述的抗体VL结构域，或根据权利要求7至9中任一项所述的分离的抗体或其功能片段，所述方法包括以下步骤：表达根据权利要求11所述的核酸序列或核酸序列集合，或根据权利要求12所述的载体或载体集合，或根据权利要求13所述的宿主细胞，特别是表达宿主细胞。
15.一种用于产生人源化兔或啮齿动物抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
a.用目的抗原使兔或啮齿动物免疫；
b.分离至少一种目的抗体；以及
c.将所述至少一种目的抗体的VLCDR区克隆到编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗体VL结构域的核酸序列中。
16.根据权利要求15所述的方法，其还包括以下步骤中的一个或多个：
aa.克隆分离与目的抗原相互作用的亲和力成熟的记忆B细胞，特别是通过使用荧光激活细胞分拣；
ab.在不要求单个B细胞克隆永生化的共培养系统中培养单个B细胞；
ac.在基于细胞的ELISA中筛选B细胞培养物上清液，以鉴别结合至目的抗原的至少一种抗体；和/或
ad.将至少一种抗体的VHCDR区克隆到编码人抗体VH结构域的核酸序列中。
17.一种方法，所述方法用于产生编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗体VL结构域的核酸序列，或编码根据权利要求7至9中任一项所述的分离的抗体或其功能片段的一个或多个核酸序列，所述方法包括在一个或多个步骤中将编码以下各项的核酸序列进行组合：(i)人Vκ框架区I至III；(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3；以及(iii)框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
特别是使用以下方法中的一种：
i.在包含编码人或人源化Vκ结构域的核酸序列的核酸构建体，特别是重组载体中通过框架区IV置换所述Vκ框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
ii.在一个或多个步骤中将编码以下各项的一个或多个核酸序列插入至包含编码框架区IV的核酸序列的核酸构建体、特别是重组载体：(i)人Vκ框架区I至III；以及(ii)CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3，其中所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；
iii.在编码人或人源化Vκ结构域的核酸序列中使所述编码框架区IV的核酸序列突变，以产生框架区IV，所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变；或
iv.在一个或多个步骤中在包含编码包含人Vκ框架区I至III，CDR结构域CDR1、CDR2以及CDR3以及框架区IV的轻链结构域的核酸序列的核酸构建体，特别是重组载体中，通过编码来自目的抗体的对应一个或多个CDR结构域的一个或多个核酸序列置换编码所述CDR结构域的一个或多个核酸序列，其中所述框架区IV选自：
a.用于框架区IV的人Vλ种系序列，特别是选自以下的Vλ种系序列：SEQIDNO.16至22；
b.基于Vλ的序列，其为(bi)来自用于框架区IV的人Vλ种系序列的共有Vλ序列，特别是SEQIDNO.17；或(bii)来自用于框架区IV的重排人Vλ序列的共有Vλ序列，特别是选自以下的Vλ共有序列：SEQIDNO.16和17；以及
c.基于Vλ的序列，其与用于框架区IV的最接近的人Vλ种系序列相比具有一个或两个突变，特别是一个突变。
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