CN110709418B

CN110709418B - 新型抗hsa抗体

Info

Publication number: CN110709418B
Application number: CN201880036722.9A
Authority: CN
Inventors: 迪·贡德; 塞巴斯蒂安·迈耶; 克里斯蒂安·赫斯; 特莎·比埃里
Original assignee: Numa Therapeutic Co ltd
Current assignee: Numa Therapeutic Co ltd
Priority date: 2017-06-05
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2038-06-04
Also published as: CN110709418A; IL271127A; US11365240B2; AU2018280679A1; JP2020522250A; JP7130678B2; CA3064160A1; KR20200015505A; EP3634997A1; US20200325214A1; MA49249A

Abstract

本发明涉及对人血清白蛋白特异的新型抗体(HSA)。

Description

新型抗HSA抗体

技术领域

本发明涉及对人血清白蛋白(HSA)特异的新型抗体。

背景技术

本发明涉及对人血清白蛋白具有结合特异性的新型抗体，其具有有利的性质，例如高稳定性、降低的聚集倾向和改善的结合亲和力，并且其特别适合于生成多特异性抗体构建体。

自从第一批单克隆抗体开发以来(“mAbs”；&Milstein，Nature，256(1975)495-7)，在过去的四十年中，抗体已成为用于研究、诊断和治疗目的的越来越重要的一类生物分子。最初，抗体仅通过用相应的目标抗原免疫动物来获得。尽管可以将非人类来源的抗体用于研究和诊断中，但是在治疗方法中，人体可能会将非人类抗体识别为外来抗体，并且会引发针对非人类抗体药物物质的免疫应答，从而使其作用减弱或无效。因此，已经建立了重组方法以使非人抗体的免疫原性降低。

通过任意选择的方法，所得的mAb或功能性片段理想地保留供体mAb的所需药效学性质，同时显示药物样的生物物理性质和最小的免疫原性。

关于抗体功能性片段的生物物理性质，与完整的IgG抗体相比，血浆中较短的半衰期已成为治疗性分子可发展性(developability)的主要关注点。

过去已经开发了几种方法来延长抗体片段的半衰期。这些方法包括使用特定的缓释制剂(Mainardes和Silva，2004)、降低片段对血清蛋白酶的敏感性(Werle和Bernkop-Schnorrch，2006)，或通过减少细胞内内体隔室中的受体结合亲和力的氨基酸取代降低抗体片段的内在清除率，从而导致配体-分选过程中的再循环增加，因此导致细胞外基质中更长的半衰期(Sarkar等人，2002)。

此外，治疗性蛋白质与具有固有长血清半衰期的第二分子的缀合已在不同的设置中进行。一种这样的方法是通过聚乙二醇(PEG)的化学附着来增加蛋白质的流体动力学尺寸(Chapman，2002；Pockros等人，2004；Veronese和Pasut，2005)，聚乙二醇可以在人类中产生终末半衰期长达14天的药物(Choy等人，2002)，或者由氨基酸Pro、Ala和/或Ser组成的构象紊乱的多肽序列(“PASylation”；参见Binder&Skerra(2017)Curr.Opin.Colloid Int.31(2017)10-17)。或者，已将治疗性蛋白质与具有长血清半衰期的天然蛋白质作为遗传融合而产生；要么是67kDa的血清白蛋白(SA)(Syed等人，1997；Osborn等人，2002)要么是抗体的Fc部分，其根据糖基化，在天然二聚体形式中额外增加60-70kDa(Mohler等人，1993)。这产生了在人体中具有数天的终末半衰期的药物(例如，与Fc区融合的TNF受体(p75)为4天(Lee等人，2003))。

Holt等人已经通过使用抗血清白蛋白结构域抗体延长短期药物的半衰期(Holt等人，Protein Engineering，Design and Selection 21(2008)283S28288)扩展了后一种方法。可以证明,这种药物与抗HSA VH结构域抗体的融合导致白介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)的血清半衰期延长。然而，Holt等人仅使用单结构域抗体，因此限制了用于基于互补VL和VH结构域作为异缔合结构域的相互作用的方法的这种技术的使用。

尽管使用抗HSA抗体或其片段似乎提供了一个有趣的选择，但任何此类抗体都必须表现出复杂的特征模式以便成功解决该方法带来的开放性问题：(i)抗HSA抗体或其片段必须对HSA具有高亲和力；(ii)抗-HSA抗体或其片段在pH值为约5.5至约7.4时必须具有高亲和力，以保护生理相关条件下的稳定结合；(iii)抗体必须对HSA是特异性的，但提供对非人灵长类动物和/或啮齿动物血清白蛋白的交叉反应性，以实现包含这种抗HSA抗体或其片段的构建体的适当的临床前测试的性能；(iv)抗HSA抗体或其片段与HSA的结合必须保持抗体结合HSA结合FcRn的能力，以允许抗HSA抗体或其片段通过HSA与FcRn之间的相互作用而与HSA一起再循环；(v)当以抗体片段形式使用时，该片段必须是稳定的，如热解折叠中的高解链温度所证明的；和(vi)当以抗体片段形式使用时，该片段必须是稳定的，如在应力稳定性研究中没有或有限量的降解产物和/或聚集体所证明的。尽管对于本领域技术人员来说是众所周知的，可以通过免疫、通过文库筛选或选择和/或通过亲本抗体的这种参数的优化以合理的成功预期来获得具有期望的参数(例如抗体亲和力)的抗体，但是是否能够获得或产生以参数(i)至(vi)的这种复杂模式为特征的抗体是相当不可预测的。

因此，尽管已经进行了许多尝试来解决增加基于抗体片段的构建体的血清半衰期的问题，但是仍然存在很大的未满足的需求来开发可以用于构建多特异性抗体构建体并且导致这种构建体的半衰期延长的新方法和/或构建体。

本发明提供的针对该问题的解决方案，即新型抗HSA抗体及其片段，迄今为止，现有技术尚未实现或未提出。

发明内容

本发明涉及对人血清白蛋白(HSA)特异的新型抗体。

因此，在第一方面，本发明涉及对人血清白蛋白具有特异性的抗体或其功能性片段，其包含：

可变轻链，其中所述可变轻链从N-末端到C-末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW表示轻链框架区，并且其中每个LCDR表示轻链互补决定区，并且其中所述LCDR共同与取自根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的VL序列的相应LCDR具有至少90％的序列同一性；

和

可变重链，其中所述可变轻链从N-末端到C-末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW表示重链框架区，并且每个HCDR表示重链互补决定区，并且其中所述HCDR共同与取自根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的VH序列的相应HCDR具有至少90％的序列同一性。

在第二方面，本发明涉及包含本发明抗体或其功能性片段的药物组合物，以及任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。

在第三方面，本发明涉及编码本发明抗体或其功能性片段的核酸序列或核酸序列的集合。

在第四方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合的载体或载体的集合。

在第五方面，本发明涉及宿主细胞，特别是表达宿主细胞，其包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合，或本发明的载体或载体的集合。

在第六方面，本发明涉及用于生产本发明抗体或其功能性片段的方法，其包含表达本发明的核酸序列或核酸序列的集合、或本发明的载体或载体的集合、或宿主细胞，特别是本发明的表达宿主细胞的步骤。

在第七方面，本发明涉及产生多特异性构建体的方法，其包含在一个或多个步骤中将编码根据本发明的抗体或其功能性片段的一个或多个核酸序列克隆到多特异性构建体中的步骤，所述多特异性构建体包含至少第二生物活性结构域，并任选地包含一个或多个另外的生物活性结构域。

在第八方面，本发明涉及多特异性多肽构建体，其包含(i)根据权利要求1-4中任一项所述的抗体或其功能性片段；和(ii)第二生物活性结构域；以及任选地，(iii)一个或多个另外的生物活性结构域。

在第九方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体。

在第十方面，本发明涉及本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体在制造药物中的用途。

在第十一方面，本发明涉及治疗患有疾病特别是人类疾病的受试者的方法，其包含向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其功能性片段或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体。

在第十二方面，本发明涉及本发明的抗体或其功能性片段或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体在治疗疾病特别是人类疾病中的用途。

附图说明

图1示出了向食蟹猴静脉内施用(3mg/ml)后PRO462的药效学参数(每组3只，显示平均值；数据参见表8，实施例7)。在21天内采集血样。该图示出了PRO462的平均组血浆浓度。由于抗药物抗体的发展，省略了以后的时间点。

图2示出了实施例6中讨论的小鼠PK研究的结果(在静脉内给予5mg/kg试验品的雄性CD-1小鼠中的Pro497的平均组血浆浓度；数据参见表9)。

图3示出了多特异性构建体PRO497的结构。

具体实施方式

本公开涉及对人血清白蛋白(HSA)特异的新型抗体。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

除非另有说明，否则术语“包含(comprising)”和“包括(including)”在本文中以其开放式和非限制性的含义使用。关于这样的后面的实施方案，术语“包含”因此包括范围较窄的术语“由……组成”。

除非本文另外指出或与上下文明显矛盾,否则在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)术语“一(a)”和“一个(an)”以及“该(the)”和类似的附图标记应被解释为涵盖单数和复数。例如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。当复数形式用于化合物、盐等时，这也被认为是指单一化合物、盐等。

术语“HSA”特别是指具有UniProt ID号P02768的人血清白蛋白或其变体。人血清白蛋白(HSA)是人血清中66.4kDa的丰富蛋白质(占总蛋白质的50％)，其由585个氨基酸组成(Sugio，Protein Eng，Vol.12，1999，439-446)。多功能HSA蛋白与允许结合和运输许多代谢产物的结构相关，这些代谢产物例如脂肪酸、金属离子、胆红素和某些药物(Fanali，Molecular Aspects of Medicine，Vol.33,2012,209-290)。血清中的HSA浓度约为3.5-5g/dL。结合白蛋白的抗体及其片段可以用于例如延长与其结合的药物或蛋白质的体内血清半衰期。

和

在本发明的上下文中，术语“抗体”用作“免疫球蛋白”(Ig)的同义词，其被定义为属于IgG、IgM、IgE、IgA、IgY或IgD(或其任何亚类)的蛋白，并且包括所有常规已知的抗体。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键互相连接的至少两个重链(H)链和两个轻链(L)链的糖蛋白。每个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可被进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间以称为框架区(FW)的更保守的区。每个VH和VL由三个CDR和四个FW组成，它们以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

术语“抗体片段”是指完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且术语“功能性片段”或“功能性抗体片段”是指包含至少抗原结合结构域(例如，完整抗体的抗原决定可变区)的抗体片段，其足以赋予功能性抗体片段对目标(例如抗原)的识别和特异性结合。功能性抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单结构域抗体(如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域)和由例如双价片段的抗体片段形成的多特异性分子，所述双价片段,包含两个或多个例如，通过铰链区的二硫键连接的两个Fab片段，或两个或更多个，例如两个连接的抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。抗体片段也可掺入到单结构域抗体、巨型抗体(maxibody)、微型抗体(minibody)、胞内抗体(intrabody)、双功能抗体(diabody)、三功能抗体(triabody)、四功能抗体(tetrabody)、v_NAR和双-scFv中(参见例如Hollinger和Hudson，Nature Biotechnology 23：1126-1136，2005)。还可以基于例如纤连蛋白III型(Fn3)的多肽将抗体片段接枝到支架中(参见美国专利号6,703,199其描述纤连蛋白多肽微型抗体)。抗体的“抗原结合区”或“抗原结合结构域”通常存在于抗体的一个或多个高变区，即CDR1、CDR2和/或CDR3区中；然而，可变的“框架”区也可以例如通过为CDR提供骨架而在抗原结合中起重要作用。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语“抗体”包括例如单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼抗体或嵌合抗体。抗体可以是任何同种型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。

“互补决定区”(“CDRs”)是具有使用多种众所周知的方案中的任一种所确定的边界的氨基酸序列，所述方案包括Kabat等人(1991)，“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(“Kabat”编号方案)、Al-Lazikani等人，(1997)JMB273，927-948(“Chothia”编号方案)and ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc，M.-P.，TheImmunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.-P.等人，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。例如，对于经典格式，根据Kabat，重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基被编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基被编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸被编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基被编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。通过组合Kabat和Chothia的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR2)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，VH中的CDR氨基酸残基被编号为大约26-35(HCDR1)、51-57(HCDR2)和93-102(HCDR3)，并且VL中的CDR氨基酸残基被编号为大约27-32(LCDR2)、50-52(LCDR2)和89-97(LCDR3)(根据“Kabat”编号)。根据IMGT，抗体的CDR可以使用程序IMGT/DomainGap Align来确定。

在本发明的上下文中，除非另外特别指出，否则使用由Honegger&Plückthun建议的编号系统(“AHo编号”)(Honegger&Plückthun，J.Mol.Biol.309(2001)657-670)。此外，将以下残基定义为CDR：LCDR1(也称为CDR-L1)：L24-L42；LCDR2(也称为CDR-L2)：L58-L72；LCDR3(也称为CDR-L3)：L107-L138；HCDR1(也称为CDR-H1)：H27-H42；HCDR2(也称为CDR-H2)：H57-H76；HCDR3(也称为CDR-H3)：H108-H138。

优选地，“抗原结合区”包括可变轻(VL)链的至少氨基酸残基4至138和可变重(VH)链的5至138(在每种情况下根据Honegger&Plückthun编号)，更优选VL的氨基酸残基3至144和VH的4至144，并且特别优选的是完整的VL和VH链(VL的氨基酸位置1至149和VH的1至149)。框架区和CDR在表7中表示。在本发明中使用的免疫球蛋白的优选类别是IgG本发明的功能性片段包括F(ab')₂片段、Fab片段、Fv和scFv的结构域。F(ab')₂或Fab可以被工程化以最小化或完全去除在CH1和CL结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用。本发明的抗体或其功能性片段可以是双或多官能构建体的一部分，如在第[0079]至[0082]段中进一步描述的。

如本文所用，“结合分子”是“特异于靶标的/对靶标特异的”、“特异性地识别”或“特异性地结合”靶标(例如人血清白蛋白)，当这种结合分子能够在这样的靶生物分子和一个或多个标准分子之间进行区分时，因为结合特异性不是绝对的，而是相对的性质。以其最一般的形式(并且当没有提及定义的参考文献时)，“特异性结合”是指结合分子区分目标靶生物分子与无关的生物分子之间的能力，如例如根据本领域已知的特异性检测方法所确定的。这样的方法包括但不限于Western印迹、ELISA、RIA、ECL、IRMA、SPR(表面等离子体共振)测试和肽扫描。例如，可以进行标准ELISA测定。评分可以通过标准颜色开发(例如，具有辣根过氧化物和四甲基联苯胺与过氧化氢的二级抗体)进行。在某些孔中的反应由光密度(例如，在450nm处)评分。典型背景(＝阴性反应)可能约为0.1OD；典型的阳性反应可能约为1OD。这意味着阳性和阴性得分之间的比率可以是10倍或更高。在另一个实施例中，可以进行SPR测定，其中背景和信号之间的至少10倍，优选至少100倍的差异表示特异性结合。通常，结合特异性的确定是通过使用不是单一的标准生物分子，而是一组约三到五种不相关的生物分子(例如奶粉、转铁蛋白等)来进行的。

然而，“特异性结合”也可以指结合分子区分靶生物分子和一个或多个密切相关的生物分子的能力，所述生物分子用作标准点，例如来自不同物种(例如牛血清白蛋白)的血清白蛋白。此外，“特异性结合”可涉及结合分子区分其靶抗原的不同部分的能力，所述靶抗原的不同部分例如靶生物分子的不同结构域、区域或表位或靶生物分子的一个或多个关键氨基酸残基或氨基酸残基段。

在本发明的上下文中，术语“表位”是指靶生物分子与结合分子之间特异性结合所需的给定的靶生物分子的部分。表位可以是连续的，即由存在于靶生物分子中的相邻结构元件形成，或者是不连续的，即由在靶生物分子的一级序列中(例如在作为标靶的蛋白质的氨基酸序列中)的不同位置处的结构元件形成，但在靶生物分子例如在体液中采用的三维结构中紧密接近。

在一个具体的实施方案中，所述可变轻链是Vκ1轻链，和/或所述可变重链是VH3链。在另一个具体的实施方案中，所述可变轻链是嵌合轻链，其包含Vκ框架区I-III和V骨架区IV。在一个实施方案中，轻链是嵌合轻链，其包含：

(i)选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的VL序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3；

(ii)人Vκ框架区域FW1至FW3，尤其是人Vκ1框架区域FW1至FW3；

(iii)FW4，其选自(a)FW4的人Vλ种系序列，特别是选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的Vλ种系序列，优选SEQ ID NO：7；和(b)基于Vλ的序列，其与FW4的最接近的人Vλ种系序列相比，具有一个或两个突变，特别是一个突变，所述FW4包含选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选SEQ ID NO：7。

在本发明的上下文中，术语“VH”(“可变重链”)、“Vκ”和“Vλ”是指根据序列同一性和同源性进行分组的抗体重链和轻链序列的家族。用于确定序列同源性的方法，例如通过使用同源性搜索矩阵，例如BLOSUM(Henikoff，S.&Henikoff，J.G.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)10915-10919)，以及用于根据同源性的序列分组的方法是本领域普通技术人员众所周知的。对于VH、Vκ和Vλ，可以鉴定出不同的亚家族，例如，如在Knappik等人，J.Mol.Biol.296(2000)57-86中所示，其中将VH分组为VH1A、VH1B和VH2-VH6、将Vκ分组为Vκ1-Vκ4以及将Vλ分组为Vλ1-Vλ3。在体内，抗体Vκ链、Vλ链和VH链分别是种系κ链V和J片段、种系λ链V和J片段以及重链V、D和J片段随机重排的结果。给定抗体可变链所属的亚家族由相应的V片段确定，并且具体地由框架区FW1-FW3确定。因此，仅由特定组的框架区HFW1至HFW3在本申请中表征的任意VH序列可以与任意HFW4序列组合，例如取自重链种系J段之一的HFW4序列，或取自重排的VH序列的HFW4序列。在具体的实施方案中，所述HFW4序列是WGQGTLVTVSS。

合适地，本发明的抗体或功能性片段为分离的抗体或其功能性片段。如本文所用，术语“分离的抗体”是指多肽或其蛋白质，其凭借其起源或操作：(i)作为表达载体的一部分的表达产物存在于宿主细胞中，或(ii)与不同于其天然连接的蛋白质或其它化学部分连接，或(iii)非天然存在。“分离的”进一步是指蛋白质，其：(i)是化学合成的；(ii)在宿主细胞中表达并通过凝胶色谱法从相关蛋白中纯化出来。术语“分离的抗体”还指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合人血清白蛋白的分离的抗体是基本上不含特异性结合除了人血清白蛋白之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合人血清白蛋白的分离的抗体可以对其它抗原具有交叉反应性，所述其它抗原例如来自其它物种(例如，非人灵长类动物和/或啮齿动物血清白蛋白)的血清白蛋白分子。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学品。

“亲和力”是指单个结合位点或分子(例如抗体或其功能性片段)与其结合伴侣(例如抗原)之间的总非共价相互作用之和的强度。除非另外指出，如本文所用，术语“结合亲和力”是指反映结合对的成员之间的1：1相互作用(例如，单个抗体结合结构域与其抗原的相互作用)的内在结合亲和力。亲和力一般可由解离常数(K_D)表示。亲和力可通过本领域已知的常见方法测量，其包括本文所述的那些，特别是亲和力可通过表面等离子体共振来测量。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体或功能性片段的K_D可以在1至50000pM、1至40000pM、1至30000pM、1至25000pM、1至20000pM、1至10000pM、1至7500pM、1至5000pM、1至4000pM、1至3000pM、1至2000pM、1至1500pM、1至1000pM之间，其优选通过表面等离振子共振测量；更特别是通过实施例2.1中所示的方法测定。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段具有结合人血清白蛋白的小于50nm的K_D值，特别是小于3nm，更特别地小于1nm，其优选通过表面等离子体共振测量；更特别是通过实施例2.1中所示的方法测定。在另一个实施方案中，本发明抗体或功能性片段具有在约5.5和约7.4的pH值下结合人血清白蛋白的K_D值。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体或功能性片段的结合非人灵长类和/或啮齿动物血清白蛋白的K_D值可以在1至250000pM、1至200000pM、1至150000pM、1至100000pM、1至75000pM、1至50000pM、1至40000pM、1至30000pM、1至20000pM、1至10000pM、1至7500pM、1至5000pM之间，其优选通过表面等离振子共振测量；更特别是通过实施例2.1中所示的方法测定。在一个具体的实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段具有结合人血清白蛋白的小于250nM的K_D值，特别是小于100nM，更特别地小于50nM，其优选通过表面等离子体共振测量；更特别是通过实施例2.1中所示的方法测定。

在一个具体的实施方案中，所述可变轻链与根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的VL序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，和/或其中所述可变重链是VH3链，其与根据SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的VH序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性。

以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“序列同一性”或“序列同一性百分比”，和“序列相似性”或“序列相似性百分比”。如本文所用，术语“序列同一性”是通过计算两个多肽序列之间相同的氨基酸残基的最大数目来确定的，其中可以考虑空位(gaps)和/或插入以便允许最大程度的序列重叠。例如，两个完全相同的100mer多肽具有100％的序列同一性。当它们相差单个突变时，或当一个多肽含有一个氨基酸缺失时，序列同一性为99％(99个位置相同)。换句话说，“序列同一性百分比”是通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来计算的，确定相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)或氨基酸残基在两个序列中均出现的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置总数(即窗口尺寸)，然后将结果乘以100得出序列同一性的百分比。术语“序列相似性”是当比较两个序列时两个序列之间的相似性程度。在必要或需要时，可以进行序列的最佳比对以进行比较,例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981))，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48：443-53(1970))，通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-48(1988))，通过这些算法的计算机实现(例如，威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)或通过目视检查。(一般参见Ausubel等人(eds.)，CurrentProtocols in Molecular Biology，4th ed.，John Wiley and Sons，New York(1999))。除非本文另有说明，否则本文所指的序列相似性程度是通过使用Dayhoff PAM矩阵来确定的(M.O.Dayhoff，R.Schwartz，B.C.Orcutt:A model of Evolutionary Change inProteins，345-352页；in:Atlas of protein sequence and structure，NationalBiomedical Research Foundation，1979)。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，其例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。本文中可互换地使用术语“多肽”和“降解蛋白”来指代氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有说明，否则特定的多肽序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体。

在一个具体的实施方案中，所述抗体或其功能性片段包含(i)可变轻链,其与根据SEQ ID NO：1的VL序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，和VH链，其与根据SEQ ID NO：2的VH序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，或(ii)可变轻链,其与根据SEQ ID NO：3的VL序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，和VH链，其与根据SEQ ID NO：4的VH序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性。

在一个实施方案中，本发明涉及对人血清白蛋白特异的抗体或其功能性片段，其包含：(i)可变轻链,其与根据SEQ ID NO：1的VL序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，其中所述可变轻链包含取自根据SEQ ID NO：1的VL序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3；和(ii)可变重链,其与根据SEQ ID NO：2的VH序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，其中所述可变重链包含取自根据SEQ ID NO：2的VH序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及对人血清白蛋白具有特异性的抗体或其功能性片段，其包含：(i)可变轻链,其与根据SEQ ID NO：1的VL序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，其中所述可变轻链包含取自根据SEQ ID NO：1的VL序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述可变轻链包含K50Q和A51P(AHo编号)；和(ii)可变重链，其与根据SEQ ID NO：2的VH序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，其中所述可变重链包含取自根据SEQ ID NO：2的VH序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述可变重链包含W54Y、V103T和Y105F(AHo编号)。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及对人血清白蛋白具有特异性的抗体或其功能性片段，其包含(i)可变轻链,其包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列的或其保守修饰变体，和(ii)可变重链,其包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其保守修饰变体。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及对人血清白蛋白具有特异性的抗体或其功能性片段，其包含(i)可变轻链,其包含根据SEQ ID NO：1的氨基酸序列,和(ii)可变重链,其包含根据SEQID NO：2的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及对人血清白蛋白具有特异性的抗体或其功能性片段，其包含：(i)可变轻链,其与根据SEQ ID NO：3的VL序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，其中所述可变轻链包含取自根据SEQ ID NO：3的VL序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3；和(ii)可变重链,其与根据SEQ ID NO：4的VH序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，其中所述可变重链包含取自根据SEQ ID NO：4的VH序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及对人血清白蛋白具有特异性的抗体或其功能性片段，其包含：(i)可变轻链,其与根据SEQ ID NO：3的VL序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，其中所述可变轻链包含取自根据SEQ ID NO：3的VL序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3，并且其中所述可变轻链包含I2V、Q3V、K50Q和A51P(AHo编号)；和(ii)可变重链,其与根据SEQ ID NO：4的VH序列具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，优选至少90％的序列同一性，其中所述可变重链包含取自根据SEQ ID NO：4的VH序列的CDR结构域CDR1、CDR2和CDR3,并且其中所述可变重链包含I55V、V103T和Y105F(AHo编号)。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及对人血清白蛋白具有特异性的抗体或其功能性片段，其包含(i)可变轻链，其包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列的或其保守修饰变体，和(ii)可变重链，其包含根据SEQ ID NO：4的氨基酸序列或其保守修饰变体。在一个更具体的实施方案中，本发明涉及对人血清白蛋白具有特异性的抗体或其功能性片段，其包含(i)可变轻链，其包含根据SEQ ID NO：3的氨基酸序列，和(ii)可变重链，其包含根据SEQID NO：4的氨基酸序列。

术语“保守修饰的变体”或“保守变体”适用于氨基酸序列和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或当所述核酸不编码氨基酸序列时，则是指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任意给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子指定丙氨酸的位置，密码子可以改变为所描述的相应密码子的任一个，而不改变编码的多肽。这样的核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸的每种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异都隐含在每个所述序列中。

对于多肽序列，“保守修饰的变体”或“保守变体”包括对多肽序列的单独取代、缺失或添加，其导致用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表在本领域中是众所周知的。此类保守修饰的变体是补充而不排除本发明的多态变体、种间同系物和等位基因。以下八个组含有彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Protein(1984))。在一个实施方案中，术语“保守性序列修饰”用于指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。

在具体的实施方案中，本发明的抗体或其功能性片段的特征在于以下参数中的一个或多个：

(i)其具有结合人血清白蛋白的小于50nm，特别是小于3nm，更特别是小于1nm的K_D值，特别是如通过表面等离子体共振所测量的；更特别地，通过实施例2.1中所示的方法测定；

(ii)其具有在约5.5和约7.4的pH值下结合人血清白蛋白的这样的K_D值，特别是如通过表面等离子体共振所测量的；

(iii)其具有结合非人灵长类动物和/或啮齿动物血清白蛋白的小于250nM，特别是小于100nM，更特别地小于50nM的K_D值，特别是如通过表面等离子体共振所测量的；更特别地，通过实施例2.1中所示的方法测定；

(iv)抗HSA抗体或其片段与HSA的结合必须保持抗体结合的HSA结合FcRn的能力，以允许抗HSA抗体或其片段通过HSA与FcRn之间的相互作用而与HSA一起再循环，如实施例2.2中使用的测定所确定；

(v)当以scDb(单链双功能抗体形式)或scFv(单链可变片段形式)抗体形式表达时，优选以scFv形式表达时，尤其是如前所述通过差示扫描荧光法(DSF)测定(Egan等人，MAbs，9(1)(2017)，68-84；Niesen，et al.，Nature Protocols，2(9)(2007)2212-2221)，尤其是在将样品在pH范围为3.5至7.5且含有0.15-0.25M NaCl，特别是0.15M NaCl的五种柠檬酸磷酸盐缓冲液中稀释时，其热解折叠温度(Tm)的平均中点至少超过60℃。scFv构建体的热解折叠的转变中点是使用荧光染料通过差示扫描荧光法确定的(参见Wong&Raleigh，Protein Science 25(2016)1834-1840)。通过掺入在相关缓冲液中制备的储备赋形剂，制备相关赋形剂条件下的样品，使最终蛋白质浓度为50μg ml^-1。对于缓冲液探索实验，将样品在具有不同pH值(pH 3.4、4.4、5.4、6.4和7.2)的含有最终浓度为/>的最终scFv缓冲液中稀释至总体积100μl。将scFv DSF标准与未知样品一起作为内部对照进行测量。将25微升制备的样品一式三份添加到白壁AB基因PCR板中。该分析在用作热循环仪的qPCR机中进行，并使用该软件的自定义染料校准程序检测荧光发射。将包含测试样品的PCR板置于以1℃的增量递增的25℃到96℃的温度斜坡，每次温度递增后停顿30秒。总测定时间为约两个小时。通过使用计算曲线拐点的数学二阶导数方法的GraphPad Prism软件计算Tm；报告的Tm是三个测量值的平均值；在一个具体的实施方案中，如实施例4.1中所述进行Tm的测定，其中将样品在含有0.25M NaCl的pH值为6.4的柠檬酸缓冲液中稀释；以及

(vi)当以抗体片段形式使用时，该片段必须稳定，如降解产物和/或聚集体不存在或数量有限所证明，如在28天的应力稳定性研究期间在37℃下单体含量损失少于3％所证明，特别地，所述应力稳定性研究根据实施例4.2进行，特别地，单体含量损失少于2％，特别地，当本发明的抗体的起始浓度为10mg/ml时。

在一个优选的实施方案中，所述抗体或其功能性片段的热解折叠平均中点温度(Tm)超过至少65℃，优选至少69℃。在37℃下于50mM柠檬酸-磷酸盐(pH 6.4、150mM NaCl)中存储14天的过程中，通过SE-HPLC分析蛋白质的寡聚化。在研究之前，将样品浓缩至10gl^-1并确定d0时间点。通过在Shodex KW-402.5-4F色谱柱上分离样品并评估所得色谱图来定量单体含量。为了计算蛋白质单体的相对百分比，将单体峰的面积除以不属于样品基质的峰的总面积。在一个优选的实施方案中，当以10μg/ml的浓度在37℃下于50mM柠檬酸-磷酸盐(pH 6.4、150mM NaCl)中存储两周时，所述抗体或其功能性片段的单体含量损失小于15％、12％、10％、7％、5％或2％，优选地小于5％，更优选地小于2％。

在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其功能性片段选自：IgG抗体、Fab和scFv片段。合适地，本发明的抗体或其功能性片段是scFv抗体片段。“单链Fv”或“scFv”或“sFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得sFv能够形成用于靶标结合的所需结构。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构(参见，例如，Plückthun，The pharmacology of MonoclonalAntibodies，vol.113，Rosenburg and Moore eds.，Springer-Verlag，New York，1994，pp.269-315)。

在一个具体的实施方案中，所述功能性片段是包含根据SEQ ID NO：5的接头的scFv形式。

在本发明的另一个具体实施方案中，分离的抗体或其功能性片段是多特异性构建体(例如双特异性构建体)或多价构建体(例如双价构建体)，其是选自本领域已知的任何合适的多特异性(例如双特异性)形式的抗体形式，其通过非限制性示例的方式包括基于下列的形式：单链双功能抗体(scDb)、串联scDb(Tandab)、线性二聚体scDb(LD-scDb)、环状二聚体scDb(CD-scDb)，双特异性T细胞接合子(BiTE；串联di-scFv)、串联tri-scFv、三抗体(Fab-(scFv)₂)或双抗体(Fab-(scFv)₁)、三功能抗体(triabody)、scDb-scFv、双特异性Fab₂、双微小抗体、四功能抗体(tetrabody)、scFv-Fc-scFv融合体、二双功能抗体、DVD-Ig、COVD、IgG-scFab、scFab-dsscFv、Fv₂-Fc、IgG-scFv融合体，例如bsAb(连接至轻链C末端的scFv)、Bs1Ab(连接至轻链N末端的scFv)、Bs2Ab(连接至重链N末端的scFv)、Bs3Ab(连接至重链C末端的scFv)、Ts1Ab(连接至重链和轻链的N末端的scFv)、Ts2Ab(连接至重链的C末端的dsscFv)和Knob-into-Hole抗体(KiHs)(通过KiH技术制备的双特异性IgG)、MATCH(描述于WO2016/0202457；Egan T.等人，mAbs 9(2017)68-84)和DuoBodies(由Duobody技术制备的双特异性IgG)(MAbs.2017Feb/Mar；9(2):182-212.doi:10.1080/19420862.2016.1268307)。特别适用于本文的是单链双功能抗体(scDb)，特别是双特异性单体scDb。更特别适用于本文的是scDb-scFv或MATCH，优选scDb-scFv。

术语“双功能抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含与同一条多肽链中的VL连接的VH(VH-VL)。通过使用太短的以至于不允许在同一条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对以产生两个抗原结合位点。双功能抗体可以是双价的或双特异性的。双抗体在例如EP404097、WO1993/01161、Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)中有更完整的描述。三功能抗体和四功能抗体也描述于Hudson等人，Nat.Med.9:129-134(2003)中。

双特异性scDb，特别是双特异性单体scDb，特别地包含两个可变重链结构域(VH)或其片段和两个可变轻链结构域(VL)或其片段，其通过接头L1、L2和L3连接以以下顺序连接：VHA-L1-VLb-L2-VLA、VHA-L1-VL2-L2-VLA、VLA-L1-VL2-L2-LB-L3-L3-VHA、VHb-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB、VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB、VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB或VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB，其中VLA和VHA结构域共同形成第一抗原的抗原结合位点，并且VLB和VHB共同形成第二抗原的抗原结合位点。

接头L1特别是2-10个氨基酸的肽，更特别是3-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸，并且接头L3特别是1-10个氨基酸的肽，更特别是2-7个氨基酸，最特别是5个氨基酸。中间接头L2特别是10-40个氨基酸的肽，更特别是15-30个氨基酸，最特别是20-25个氨基酸。

在本发明的一个实施方案中，分离的抗体或其功能性片段是以WO2016/0202457所述的匹配形式的多特异性和/或多价抗体；EGAN T.等人，Mab 9(2017)68-84。

本发明的双特异性、双价、多特异性和/或多价构建体可以使用本领域已知的任何方便的抗体制备方法来生产(关于双特异性构建体的产生，参见例如Fischer，N.&Leger，O.，Pathobiology 74(2007)3-14；关于双特异性双抗体和串联scFv Hornig，N.&A.，Methods Mol.Biol.907(2012)713-727,和WO 99/57150)。用于制备本发明的双特异性构建体的合适方法的具体实例还包括，尤其是，Genmab(参见Labrijn等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA110(2013)5145-5150)和Merus(参见de Kruif等人，Biotechnol.Bioeng.106(2010)741-750)技术。产生包含功能性抗体Fc部分的双特异性抗体的方法在本领域中也是已知的(参见，例如，Zhu等人，Cancer Lett.86(1994)127-134)；和Suresh等人，Methods Enzymol.121(1986)210-228)。

这些方法通常涉及单克隆抗体的产生，例如通过使用杂交瘤技术将骨髓瘤细胞与已用所需抗原免疫的小鼠脾细胞融合(参见，例如，Yokoyama等人，Curr.Protoc.Immunol.Chapter 2，Unit 2.5，2006)，或通过重组抗体工程技术(库克隆或噬菌体展示/酵母展示)(参见，例如，Chames&Baty，FEMS Microbiol.Letters189(2000)1-8)，以及两种不同单克隆抗体的抗原结合结构域或其片段或部分的组合以使用已知的分子克隆技术得到双特异性构建体。

短语“药学上可接受的”是指那些化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医疗判断范围内，适用于与人类或动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，符合合理的收益/风险比。

根据本发明的药物组合物可以进一步常规地包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、补充免疫增强剂(例如佐剂和细胞因子)以及任选地其他治疗剂。所述组合物还可包含抗氧化剂和/或防腐剂。作为抗氧化剂，可以提及硫醇衍生物(例如硫代甘油、半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸、胱氨酸、二硫赤藓糖醇、二硫苏糖醇、谷胱甘肽)、生育酚、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、亚硫酸盐(例如硫酸钠、亚硫酸氢钠、丙酮亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、甲醛次硫酸钠、硫代硫酸钠)和去甲二氢愈创木酸。合适的防腐剂可以是例如苯酚、氯丁醇、苄醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和氯化十六烷吡啶。

在本文提供的具体实施方案中，所述抗体或其功能性片段可通过重组方式分离、制备、表达或产生，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、与重组的组合抗体文库分离的抗体，或通过任何其他方式制备，表达，产生或分离的抗体，所述其他方式涉及例如通过合成产生，编码人免疫球蛋白序列的DNA序列的基因工程，或将编码人免疫球蛋白的序列(例如人免疫球蛋白基因序列)剪接至其他这样的序列。

因此，在第三方面，本发明涉及编码本发明抗体或其功能性片段的核酸序列或核酸序列的集合。

术语“核酸”在本文中与术语“多核苷酸”可互换使用，并且是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接(linkage)的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与标准核酸相似的结合特性，并且以类似于标准核苷酸的方式被代谢。这样的类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，如下所述，简并的密码子替代可以通过产生序列来实现，其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081，1991；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608，1985；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98，1994)。

在第四方面，本发明涉及包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合的载体或载体的集合。术语“载体”或“表达载体”是指多核苷酸，最常见的是DNA质粒，其包含编码本发明的抗体或其片段的核苷酸序列以在宿主细胞中，优选在哺乳动物细胞中重组表达。载体可能会或可能不会在细胞中复制。一旦获得了编码本文描述的抗体的可变重链和/或可变轻链或其片段的多核苷酸，就可以使用本领域众所周知的技术通过重组DNA技术来生产用于产生抗体分子的载体。因此，本文描述了通过表达含有抗体编码核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员众所周知的方法来构建包含抗体编码序列以及合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。

可以通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后可以通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的抗体或其片段。因此，本发明涉及宿主细胞，特别是表达宿主细胞，其包含本发明的核酸序列或核酸序列的集合，或本发明的载体或载体的集合。在某些实施方案中，宿主细胞包含载体，该载体包含编码本发明抗体或其片段的可变重链和可变轻链两者的多核苷酸。在具体的实施方案中，宿主细胞含有两种不同的载体，第一载体包含编码所述抗体的可变重链或其片段的多核苷酸，第二载体包含编码所述抗体的可变轻链或其片段的多核苷酸。在其他实施方案中，第一宿主细胞包含第一载体，所述第一载体包含编码所述抗体的可变重链或其片段的多核苷酸，第二宿主细胞包含第二载体，所述第二载体包含编码所述抗体的可变轻链或其功能性片段的多核苷酸。

人源化兔抗体或啮齿动物抗体的方法是本领域普通技术人员众所周知的(参见，例如，Borras，loc.cit.；Rader等人，The FASEB Journal，express article10.1096/fj.02-0281fje，published online October 18，2002；Yu等人(2010)A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody Inhibits Angiogenesis and Blocks Tumor Growthin Xenograft Models.PLoS ONE 5(2):e9072.doi:10.1371/journal.pone.0009072)。兔或啮齿类动物的免疫可以用例如蛋白质的目的抗原本身来进行，或者在肽或蛋白质抗原的情况下，可以通过用编码目的肽或蛋白质的核酸(例如质粒)对兔的DNA免疫来进行。

术语“宿主细胞”是指已将表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的受试者细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这样的后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。

在第六方面，本发明涉及用于生产本发明抗体或其功能性片段的方法，其包含表达本发明的核酸序列或核酸序列的集合、或本发明的载体或载体的集合、或本发明的宿主细胞，特别是表达宿主细胞的步骤。

在第七方面，本发明涉及产生多特异性构建体的方法，其包含在一个或多个步骤中将编码根据本发明的抗体或其功能性片段的一个或多个核酸序列克隆到多特异性构建体中的步骤，所述多特异性构建体包含至少第二生物活性结构域和任选地，一个或多个另外的生物活性结构域。

在第八方面，本发明涉及多特异性多肽构建体，其包含(i)根据本发明的抗体或其功能性片段；和(ii)第二生物活性结构域；以及任选地，(iii)一个或多个另外的生物活性结构域。

在第七或第八方面的具体实施方案中，所述第二生物活性结构域是第二抗体或其功能性片段。

在具体的实施方案中，存在所述任选的另外的生物活性结构域中的至少一种，特别是其中所述另外的生物活性结构域是第三抗体或其功能性片段。

在具体的实施方案中，所述多特异性多肽构建体还包含一种或多种多肽接头。

在具体的实施方案中，所述多特异性多肽是单体多肽，特别地，单体多肽，其中根据本发明的抗体或其功能性片段是通过接头连接到所述第二生物活性结构域的scFv抗体片段，特别地，其中所述第二生物活性结构域是第二scFv抗体片段。

在具体的实施方案中，所述多特异性多肽是二聚体多肽，特别地，二聚体多肽，其中两个多肽的结合是由所述多特异性多肽中包含的抗体片段的互补VL和VH结构域的结合引起的。在具体的这类实施方案中，所述多特异性多肽是根据WO 2016/202457的教导的多特异性抗体构建体。在具体的其他实施方案中，所述多特异性多肽是单链双功能抗体构建体(scDb)。在具体的其他实施方案中，所述多特异性多肽是Fab-scFv)n构建体(n是选自1、2、3或4的整数)，其采用由VL-CL和VH-CH1组成的Fab片段的异二聚体组装，其中任一恒定域形成骨架，其中通过柔性接头将一个或多个scFv片段连接至该支架。

在第九方面，本发明涉及用作药物的本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体。在一个实施方案中，本发明涉及一种用于治疗疾病，特别是人类疾病的多特异性多肽构建体，其包含本发明的抗体或其功能性片段，其中所述多特异性多肽构建体包含第二生物活性结构域，其能够与相应疾病的治疗相关靶标特异性地相互作用。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”、“治疗(treated)”等是指获得期望的药理和/或生理作用。就部分或完全治愈疾病和/或对疾病的不良影响或延迟疾病进展而言，该作用可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对哺乳动物例如人类的疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病，例如阻止其发展；(c)减轻疾病，例如使疾病消退。

在第十方面，本发明涉及本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体在制备药物中的用途。

在第十一方面，本发明涉及治疗患有疾病(特别是人类疾病)的受试者的方法，其包含向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其功能性片段或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体。在第十一方面，本发明涉及治疗患有疾病特别是人类疾病的受试者的方法，其包含向所述受试者施用有效量的本发明的抗体或其功能性片段或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体，其中所述多特异性多肽构建体包含第二生物活性结构域，其能够与相应疾病中治疗相关的靶标特异性地相互作用。

术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物(例如哺乳动物和非哺乳动物(例如非人类灵长类动物、绵羊、狗、牛、鸡))、两栖动物和爬行动物。在一个优选的实施方案中，所述受试者是人类。除非另有说明，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用。

术语“有效量”或“治疗有效量”或“有效的量(efficacious amount)”是指当施用于哺乳动物或其他受试者以治疗疾病时足以实现对疾病的这种治疗的药剂的量。“治疗有效量”将根据待治疗的受试者的药剂、疾病和其严重程度以及年龄、体重等而变化。

在第十二方面，本发明涉及本发明的抗体或其功能性片段，或包含本发明的抗体或其功能性片段的多特异性多肽构建体在治疗疾病，特别是人类疾病的用途，特别地，其中所述多特异性多肽构建体包含第二生物活性结构域，其能够与相应疾病中治疗相关的靶标特异性地相互作用。

实施例

以下实施例说明了本发明而不限制其范围。

实施例1：选择和人源化

为了产生HSA结合结构域的主要候选物(Lead Candidate)，选择了15个兔单克隆抗体克隆。

所选克隆的人源化包括将兔子CDR转移到Vκ1/VH3类型的scFv受体框架上，该框架包含一个如WO 2014/206561中所述的V框架IV序列。在该过程中，在供体序列(兔mAb)上鉴定了六个CDR区的氨基酸序列，并将其接枝到受体支架序列中。

最终构建体中还包含了来自兔供体在某些框架位置的其他氨基酸，这些氨基酸可能会影响CDR的定位并因此影响抗原结合(Borras等人，2010；J.Biol.Chem.，285:9054-9066)(见表1)。这些构建体的表征数据的比较表明，与单独的CDR嫁接相比，它具有显著的优势。产生的可变结构域的序列示于表2。

一旦前述章节中所述的经计算机模拟的构建体设计完成，就合成了相应的基因并构建了细菌表达载体。在DNA水平上确定表达构建体的序列，并根据通用表达和纯化方案制备构建体。

蛋白质的异源表达在大肠杆菌中作为不溶性包涵体进行。用成倍增长的起始培养物接种表达培养物。使用可商购的丰富培养基在轨道摇床中的摇瓶中进行培养。使细胞生长至确定的OD 600为2并通过用1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)过夜表达诱导。发酵结束时，通过离心收集细胞，并通过超声处理匀浆。此时，通过细胞裂解物的SDS-PAGE分析确定不同构建体的表达水平。通过离心方案从均质化的细胞沉淀中分离包涵体，该离心方案包括几个洗涤步骤以去除细胞碎片和其他宿主细胞杂质。将纯化的包涵体溶解在变性缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0、6M Gdn-HCl、2mM EDTA)中，并通过可扩展的重折叠方案将scFv进行重折叠，从而生成毫克量的天然折叠的单体scFv。采用标准化方案纯化scFv，包括以下步骤。重折叠后的产物通过使用Capto L琼脂糖(GE Healthcare)的亲和色谱法捕获，得到纯化的scFv。使用HiLoad Superdex75色谱柱(GE Healthcare)，通过抛光尺寸排阻色谱法进一步纯化在初始测试中符合亲和力和效能标准的主要候选物。纯化方案后，将蛋白质配制成缓冲盐溶液并进行表征。

实施例2：人源化scFv的表征

2.1在pH 7.4和pH 5.5下对血清白蛋白的亲和力

使用MASS-1设备(Sierra Sensors)通过SPR测量确定人源化scFv与不同物种的血清白蛋白(SA)的亲和力。使用胺偶联化学将SA直接偶联至高容量的胺传感器芯片(SierraSensors)。在执行再生搜寻和表面性能测试以找到最佳测定条件后，测量scFv剂量响应，并将获得的结合曲线进行双标准(空标准通道和零分析物进样)并使用1：1Langmuir模型拟合以恢复动力学参数。该测定在不同的pH值下运行两次：一次在pH值为5.5的1X PBS-Tween缓冲液中，另一次在pH 7.4的1X PBS-Tween缓冲液中。

对人源化构建体的结合动力学的测量结果显示了两个克隆的跨物种反应性的差异和所测试的CDR和STR移植物中的定量差异。对于两个构建体对，所描述的结构残基的引入导致亲和力的改善。对于克隆19-01-H04的构建体，取决于所测试的物种和pH，亲和力的改善高达20至300倍。对于克隆23-13-A01的构建体，实现了约3倍的适度改善(参见表3)。

就跨物种反应性而言，克隆19-01-H04显示出对人和非人灵长类动物血清白蛋白的高亲和力结合，而对啮齿动物SA则未观察到结合。对于克隆23-13-A01，观察到人和非人灵长类动物SA的高亲和力结合，此外，所述分子以降低的亲和力与啮齿动物SA结合(参见表4)。

2.2抗体结合的HSA的FcRn结合

在pH 5.5上进行测定以确认scFv结合的HSA仍然能够结合FcRn。通过HSA和FcRn之间的相互作用，使抗HSA scFv或其衍生物与HSA一起再循环是必要的。使用固定有HSA的芯片开发了一种测定法：1.注入90nM scFv，并在低pH下测量相互作用。2.注入90nM FcRn，并在低pH3下测量相互作用。注入1：1的scFv和FcRn混合物(各90nM)，以查看各次注入的结合水平之和是否接近注入混合物时的结合水平。如果结合scFv的HSA无法再结合FcRn，则混合物的结合水平将与单独的scFv的结合水平相同。

通过使用该测定，可以确认当通过克隆19-01-H04和23-13-A01的scFv结合时，HSA完全能够结合FcRn。

实施例3：单链双功能抗体(scDb)形式的生成

为了进一步表征αHSA结构域特征，将优选的结构域并入多特异性构建体中。

对于这两个结构域，在单链双功能抗体中制备了双特异性构建体。如前所述进行单链双功能抗体(scDb)形式的构建体设计[Holliger等人，“Diabodies”:small bivalentand bispecific antibody fragments.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，6444–6448]。简而言之，以VLA-S1-VHB-L1-VLB-S2-VHA的方式排列表1中列出的可变域，其中S1和S2是短G₄S接头，L1是长(G₄S)₄接头。将得到的具有αHSA结构域和对第二抗原的第二特异性的构建体在结构域19-01-H04-sc02的情况下，称为PRO462，而在结构域23-13-A01-sc02的情况下，称为PRO480。

将核苷酸序列重新合成，并克隆到基于pET26b(+)骨架(Novagen)的合适的大肠杆菌载体中。将表达构建体转化到大肠杆菌菌株BL12(DE3)(Novagen)中，并将细胞作为初始培养物在2YT培养基中培养(Sambrook，J.,等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual)。接种表达培养物并在摇瓶中于37℃和200rpm下孵育。一旦达到OD600 nm为1，则通过添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导蛋白表达。过夜表达后，通过以4000g离心收集细胞。为了制备包涵体，将细胞沉淀在IB重悬缓冲液中重悬(50mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl、5mMEDTA、0.5％Triton X-100)。在细胞浆液中添加1mM DTT、0.1mg/mL溶菌酶、10mM亮抑酶肽(Leupeptin)、100μM PMSF和1μM胃酶抑素(Pepstatin)。在冰上冷却的同时，通过三轮超声均质化来裂解细胞。随后加入0.01mg/mL DNAse，并将匀浆在室温下孵育20分钟。通过在15000g和4℃下离心将包涵体沉淀。将IB重悬于IB重悬缓冲液中，并在再次离心之前通过超声处理使其均质化。用IB重悬缓冲液总共至少进行了3个洗涤步骤，随后用IB洗涤缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5、100mM NaCl、5mM EDTA)洗涤2次，得到最终的IB。

为了使蛋白质重折叠，将分离的IB以5毫升每g的湿IB的比例重悬于增溶缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8.0、6M Gdn-HCl、2mM EDTA)中。将溶解物在室温下孵育30分钟，直到加入终浓度为20mM的DTT，然后继续孵育30分钟。增溶完成后，通过在21500g和4℃下离心10分钟来澄清溶液。在重折叠缓冲液(通常为：100mM Tris-HCl pH 8.0、5.0M尿素、5mM半胱氨酸、1mM胱氨酸)中通过最终蛋白浓度为0.3g/L的增溶蛋白的快速稀释进行重折叠。将重折叠反应常规孵育至少14小时。通过在8500g和4℃下离心10分钟来澄清所得的蛋白质溶液。通过Capto L树脂(GE Healthcare)上的亲和层析纯化重折叠的蛋白质。分离的单体部分通过尺寸排阻HPLC、SDS-PAGE以分析纯度并通过UV/Vis光谱以分析蛋白质含量。通过透析将缓冲液交换成天然缓冲液(50mM柠檬酸-磷酸盐pH 6.4、200mM NaCl)。将蛋白质浓度调整至稳定性分析的预期值。

实施例4：单链双功能抗体(scDb)构建体的功能表征

4.1热解折叠

基本上如Niesen所述(Niesen等人，Nat Protoc.2(2007)2212-21)，通过差示扫描荧光法(DSF)确定被测构建物热解折叠的转变中点。DSF分析是在qPCR机(例如MX3005p，Agilent Technologies)中进行的。将样品在含有最终浓度为5x SYPRO orange的缓冲液(柠檬酸磷酸盐pH 6.4、0.25M NaCl)中稀释，总体积为25μL。一式三份测量样品，并设定25-96℃的温度梯度。采集荧光信号，并用GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.)分析原始数据。

表5显示了使用与本申请中公开的内容密切相关的构建体创建的代表性数据。

4.2应力稳定性研究

在四个星期的过程中对蛋白质进行了分析并将其在37℃下保存，通过尺寸排阻高效液相色谱法(SE-HPLC)对其寡聚化进行了分析，而通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其降解进行了分析。在研究之前，将样品浓缩至1并确定起始时间点。通过在Shodex KW-402.5-4F(Showa Denko)上分离样品并评估所得色谱图来定量单体含量。为了计算蛋白质单体的相对百分比，将单体峰的面积除以不属于样品基质的峰的总面积。使用任何kD Mini-Protean TGX凝胶(Bio-Rad Laboratories)并用考马斯亮蓝染色通过SDS-PAGE分析评估蛋白质降解。使用配备有Nanoquant板(Tecan Group Ltd.)的Infinity阅读器M200 Pro，通过UV-Vis光谱在不同的时间点监测蛋白质浓度。

Pro462和Pro480的稳定性数据与通过SPR的抗原结合的证实结合显示了在多特异性抗体形式的情况下相应的αHSA结构域的稳定性和结构完整性(参见表6)。

实施例5：构建体PRO497(Fab-scFv)₂的生成

Fab-(scFv)₂形式是一种多功能重组抗体衍生物，其采用由VL-CL和VH-CH1组成的Fab片段异二聚体组装，其中任一恒定域均形成骨架，通过柔性接头可在其上掺入其他结合结构域(例如scFvs)(Schoonjans，Willems等人2001)(Schoonjans，Willems等人2000)。这些分子可以在哺乳动物宿主细胞(例如CHO-S)中共表达，其中即使存在链延伸，结合的免疫球蛋白伴侣分子也可以驱动VL-CL和VH-CH1结构域异二聚化。这些异二聚体是稳定的，其中每种连接体(binder)均保持其特定亲和力。Fab-(scFv)₂分子的CL和CH1位置的ScFv融合体被认为是相同的。分子中仅有的非天然序列片段是连接scFv结构域内可变域的肽接头，并且具有Fab恒定域的scFv结构域由认为不是抗原性或免疫原性的甘氨酸丝氨酸聚合物组成。PRO497是Fab-(scFv)₂分子，其包含抗CD3特异性(09-24-H09-sc04)Fab部分，其中抗HSA特异性scFv结构域(23-13-A01-sc02)与CL结构域融合，并且抗IL23R特异性scFv结构域(14-11-D07-sc04)与CH1结构域融合。scFv结构域内的结构域通过20个氨基酸(G₄S)₄接头连接，而单个scFv结构域则通过15个氨基酸(G₄S)₃肽接头与Fab片段融合。

Schoonjans，R.，A.Willems，J.Grooten和N.Mertens(2000)."Efficientheterodimerization of recombinant bi-and trispecific antibodies."Bioseparation 9(3):179-183.

Schoonjans，R.，A.Willems，S.Schoonooghe，W.Fiers，J.Grooten和N.Mertens(2000)."Fab chains as an efficient heterodimerization scaffold for theproduction of recombinant bispecific and trispecific antibody derivatives."JImmunol 165(12):7050-7057.

实施例6：通过体内PK研究构建体PRO497的功能表征

PPRO497在小鼠中的药代动力学

这项研究的目的是确定对雄性CD-1小鼠静脉施用后的PRO497的药代动力学。通过静脉内途径对12只动物施用5mg/kg的PRO497。给药前、给药后10min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、96h和144h收集血液样品。收集后，将用于血清的全血置于血清分离管中并使其凝结。观察样品是否存在血块凝缩并离心[在环境温度下2200×g 10分钟]。将血清样品转移到各个聚丙烯小瓶中，并立即放在干冰上，然后在-70±10℃下保存。

使用定量ELISA分析血清中PRO497的浓度，以检测小鼠血清中的PRO479(图2)。使用Watson药代动力学软件(Thermo Electron Corporation，版本号7.2.0.02)，采用与静脉内给药途径一致的非分区方法，预估药代动力学参数。

实施例7：通过体内PK研究构建体PRO462的功能表征

食蟹猴中PRO462的药代动力学

在向雄性食蟹猴静脉内施用后，确定PRO462的药代动力学。总共三只非幼稚动物接受了3mg/kg目标剂量水平的PRO462单次施用。从以下时间点采集的血液样本中制备血清：

给药后10和30分钟以及给药后1、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96、144、192、240、288、336、384、432和504h。

使用定量ELISA分析血清中PRO462的浓度(图1)。使用非分区方法，使用WinNonlin药代动力学软件(Phoenix 1.4版)预估药代动力学参数。

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*****

本发明的范围不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，本发明除了本文描述的那些之外的各种修改对于本领域技术人员根据前述描述是显而易见的。这样的修改意图包括在所附权利要求的范围内。

在相应的专利法允许的范围内，本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用并入本文。

序列表

<110> 努玛治疗有限公司

<120> 新型抗HSA抗体

<130> 114034P877PC

<150> US62/515,293

<151> 2017-06-05

<150> EP17195783,0

<151> 2017-10-10

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn

20 25 30

Asn Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser

85 90 95

Ser Ser Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 2

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile

35 40 45

Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 3

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ile Ile Ser Ser Arg

20 25 30

Ser Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn

85 90 95

Phe Gly Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Val Gly Cys Val Phe Thr Gly Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp

50 55 60

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Pro Val Ser Val Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 6

Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 7

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

1 5 10

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 8

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组抗体序列

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Claims

1.一种抗体或其功能性片段，其对人血清白蛋白特异，其包括：

(i)(a)可变轻链，

其中所述可变轻链从N-末端到C-末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW表示轻链框架区，并且每个LCDR表示轻链互补决定区，并且其中所述LCDR是取自根据SEQ ID NO：1的VL序列的三个LCDR；

和

(b)可变重链，

其中所述可变重链从N-末端到C-末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW表示重链框架区，并且每个HCDR表示重链互补决定区，并且其中所述HCDR是取自根据SEQ ID NO：2的VH序列的三个HCDR；

其中所述LCDR和HCDR是根据AHo编号方案定义的，和其中所述抗体或其功能性片段包括与根据SEQ ID NO：1的VL序列具有至少90％序列同一性的可变轻链和与根据SEQ ID NO：2的VH序列具有至少90％序列同一性的可变重链，或

(ii)(a)可变轻链，

其中所述可变轻链从N-末端到C-末端包含区域LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4，其中每个LFW表示轻链框架区，并且每个LCDR表示轻链互补决定区，并且其中所述LCDR是取自根据SEQ ID NO：3的VL序列的三个LCDR；

和

(b)可变重链，

其中所述可变重链从N-末端到C-末端包含区域HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4，其中每个HFW表示重链框架区，并且每个HCDR表示重链互补决定区，并且其中所述HCDR是取自根据SEQ ID NO：4的VH序列的三个HCDR；

其中所述抗体或其功能性片段包括与根据SEQ ID NO：3的VL序列具有至少90％序列同一性的可变轻链和与根据SEQ ID NO：4的VH序列具有至少90％序列同一性的可变重链；并且

其中所述抗体或其功能性片段由以下参数表征：

(i)与人血清白蛋白结合的K_D值小于1nM，如通过表面等离子体共振所测量的；

(ii)在pH值5.5和7.4下与人血清白蛋白结合的K_D值均小于3nM，如通过表面等离子体共振所测量的；

(iii)与非人灵长类动物和/或啮齿动物血清白蛋白结合的K_D值小于50nM，如通过表面等离子体共振所测量的；

(iv)保留了抗体结合的HSA与FcRn结合的能力；

(v)当以单链双功能抗体形式表达时，在将样品在pH值范围为3.5-7.5且含有0.15-0.25M NaCl的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中稀释时，通过差示扫描荧光法测定的热解折叠温度(Tm)的平均中点至少超过60℃；以及

(vi)当以单链双功能抗体形式表达的抗体处于10mg/ml的起始浓度时，在应激稳定性研究中28天的过程中在37℃下单体含量损失小于3％。

2.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，和任选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。

3.一种核酸，其编码根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段。

4.一种载体，其包含根据权利要求3所述的核酸。

5.一种用于生产根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段的方法，其包括表达根据权利要求3所述的核酸或根据权利要求4所述的载体的步骤。

6.一种生成多特异性构建体的方法，其包括以下步骤：

在一个或多个步骤中，将编码根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段的一个或多个核酸克隆到多特异性构建体中，所述多特异性构建体包含至少第二生物活性结构域，并任选地包含一个或多个另外的生物活性结构域。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二生物活性结构域是第二抗体或其功能性片段。

8.一种多特异性多肽构建体，其包含(i)根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段；和(ii)第二生物活性结构域；以及任选地，(iii)一个或多个另外的生物活性结构域。

9.根据权利要求8所述的多特异性多肽构建体，其中所述第二生物活性结构域是第二抗体或其功能性片段。

10.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段、根据权利要求2所述的药物组合物或根据权利要求8或9所述的多特异性多肽构建体在制备药物中的用途，其中所述药物包含第二生物活性结构域，所述第二生物活性结构域能够与相应疾病的治疗相关靶标特异性地相互作用。