KR20200015505A - 신규 항 hsa 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 혈청 알부민(HAS)에 특이적인 신규 항체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 인간 혈청 알부민(HSA)에 특이적인 신규 항체에 관한 것이다.
본 발명은, 유리한 특성, 예컨대 높은 안정성, 감소한 응집 성향 및 개선된 결합 친화성을 가지고, 다중 특이적 항체 구조체 생성에 특히 적합하며, 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 가지는 신규 항체에 관한 것이다.
첫 모노클로날 항체("mAb"; Kohler& Milstein, Nature, 256 (1975) 495-7)가 개발된 이래로 지난 40년 동안, 항체는 연구, 진단 및 치료의 목적을 가지는 중요 생물분자 군으로서 그 존재감을 더해왔다. 처음에 항체는 오로지 동물을, 대응하는 관심 항원으로 면역화함로써 수득되었다. 비인간 기원의 항체는 연구, 진단 및 치료적 접근법에서 사용될 수 있었지만, 인간의 신체는 비인간 항체를 외래물질로 인지하여, 비인간 항체 약물 물질에 대해 면역 반응을 유도함으로써, 이 비인간 항체 약물 물질의 유효성을 떨어뜨리거나 아예 발휘되지 못하도록 만들 수 있다. 이에 따라 비인간 항체의 면역원성을 떨어뜨리는 재조합 방법이 개발되었다.
선택된 임의의 접근법으로 생성된 mAb 또는 기능성 단편은, 이상적으로 공여개체 mAb의 원하는 약동학적 특성을 보유함과 동시에, 약물과 유사한 생물물리학적 특성을 보이고, 최소한의 면역원성을 나타낸다.
항체의 기능성 단편의 생물물리학적 특성에 관하여, IgG 전항체의 혈장 중 반감기에 비해 더 짧은 혈장 중 반감기는 치료 분자의 개발가능성을 가로막는 주요 걸림돌이 되어 왔다.
과거에 항체 단편의 반감기를 연장시키기 위한 몇 가지 접근법이 개발되었다. 이러한 접근법으로서는, 특정의 서방형 제제(Mainardes and Silva, 2004)의 사용, 단편의 혈청중 프로테아제에 대한 민감성 감소(Werle and Bernkop-Schnurch, 2006), 또는 세포내 엔도좀 구획에서의 수용체 결합 친화성을 감소시켜, 리간드 선별 과정에서의 재이용을 증가시키고, 종국에는 세포외 배지에서 더 긴 반감기를 달성하는, 아미노산 치환에 의한 항체 단편의 고유 클리어런스 율(clearance rate) 감소(Sarkar et al., 2002)를 포함한다.
게다가, 원래 혈청중 반감기가 긴 제2 분자와 치료 단백질의 접합이 상이한 환경에서 수행되었다. 이러한 방법의 하나로서는, 인간에서의 최종 반감기가 14일 이하인 약물(Choy et al., 2002)이 제조될 수 있도록 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 화학적으로 부착시키거나(Chapman, 2002; Pockros et al., 2004; Veranese and Pasut, 2005), 또는 아미노산 Pro, Ala 및/또는 Ser으로 이루어진 입체형태 무질서 폴리펩티드 서열을 부착시켜("PAS화"; Binder &Skerra (2017) Curr. Opin. Colloid Int. 31 (2017) 10-17 참조) 단백질의 수력학적 크기를 증가시키는 것(Chapman, 2002; Pockros et al., 2004; Veronese and Pasut, 2005)이 있다. 대안적으로 치료 단백질이, 반감기가 긴 천연 단백질, 즉 67 kDa의 혈청 알부민(SA)(Syed et al., 1997; Osborn et al., 2002) 또는 항체의 Fc 부 중 어느 하나과의 유전적 융합체로서, 당화 여부에 따라서 천연의 이량체 형태에 60 kDa ~ 70 kDa만큼이 더 증량되는 치료 단백질이 제조되었다(Mohler et al., 1993). 이를 통하여 인간에서의 최종 반감기가 수 일(예컨대 Fc 영역에 융합된 TNF 수용체(p75)의 경우 4일)인 약물 이 수득되었다(Lee et al., 2003).
Holt외 다수는, 수명이 짧았던 약물의 반감기를 연장시키고자 항혈청 알부민 도메인 항체를 사용함으로써 상기 접근법들 중 후자의 접근법을 확장하였다(Holt et al., Protein Engineering, Design and Selection 21 (2008) 283-288). 이러한 약물과 항 HSA VH 도메인 항체의 융합은 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1ra)의 혈청중 반감기 연장을 초래하였음이 확인될 수 있었다. 하지만, Holt외 다수는 오로지 단일 도메인 항체만을 사용하였기 때문에, 이러한 기술을 상보성 VL 도메인 및 VH 도메인의 헤테로결합 도메인으로서의 상호작용을 기반으로 한 접근법에 이용하는 것은 한계가 있었다.
항 HSA 항체 또는 이의 단편을 사용하는 것은 흥미있는 선택권을 제공하는 것으로 보이긴 했지만, 이러한 항체 임의의 것은, 이 접근법이 가지고 있는 해결되지 않은 문제들, 즉 (i) 항 HSA 항체 또는 이의 단편은 HSA에 대한 친화성이 커야 할 것이고; (ii) 항 HSA 항체 또는 이의 단편은 생리적으로 관련된 조건에서의 안정적 결합이 보장되도록 pH 값 약 5.5 및 약 7.4에서 친화성이 커야 할 것이며; (iii) 항체는 HSA에 특이적이어야 하지만, 이와 같은 항 HSA 항체 또는 이의 단편을 포함하는 구조체의 적당한 전임상 시험의 수행이 가능하게 되기 위해서는 비인간 영장류 및/또는 설치류 혈청 알부민에 대한 교차반응성을 제공하여야 하고; (iv) 항 HSA 항체 또는 이의 단편과 HSA의 결합은, 항체 결합 HSA가 FcRn과 결합하는 능력을 보존하여, 항 HSA 항체 또는 이의 단편이 HSA 및 FcRn 사이의 상호작용을 통해 HSA와 함께 재이용되는 것을 허용하여야 하며; (v) 단편이 항체 단편 포맷으로 사용될 때, 이 단편은 열에 의한 언폴딩(unfolding)시 높은 용융 온도에 의해 입증되는 바와 같이 안정적이어야 하고; (vi) 단편이 항체 단편 포맷으로 사용될 때, 이 단편은 스트레스 안정성 연구에서 분해 생성물 및/또는 응집체의 부재 또는 제한된 양만큼의 생성에 의해 입증되는 바와 같이 안정적이어야 하는 것과 같은 문제들을 성공적으로 해결하기 위해, 여러 특징의 복합된 패턴을 보여야만 할 것이다. 성공에 대한 합리적인 기대감을 가지고 면역화, 라이브러리 스크리닝 또는 선택 및/또는 모 항체의 이러한 매개변수 최적화 중 어느 한 가지에 의해 원하는 매개변수, 예컨대 항체의 친화성을 가지는 항체를 수득하는 것이 가능함이 당 업자에게 널리 공지되어 있긴 하지만, 매개변수 (i) 내지 (vi)의 이와 같은 복합적 패턴에 의해 특징지어지는 항체를 수득 또는 생성하는 것이 가능할지 아닐지에 대해 예측하기란 상당히 어렵다.
그러므로 항체 단편 기반 구조체의 혈청중 반감기를 증가시키는 문제를 해결하기 위한 다수의 시도들이 이미 행하여졌다는 사실에도 불구, 다중 특이적 항체 구조체를 구성하는데 사용될 수 있고, 이러한 구조체의 반감기 연장을 달성하는 신규 접근법 및/또는 구조체를 개발하는 것에 관한 절실한 요구는 여전히 충족되지 않은채 남아있다.
본 발명에 의해 제공된 이 문제에 관한 해결책, 즉 신규 항 HSA 항체 및 이의 단편은 지금까지 그 어떠한 선행 기술에 의해서도 달성되었거나 제안된 바 없다.
본 발명은 인간 혈청 알부민(HSA)에 특이적인 신규 항체에 관한 것이다.
그러므로 제1 측면에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고,
가변 경쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4을 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 LFW는 경쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 LCDR은 경쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 LCDR들은 함께 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 대응 LCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]; 그리고
가변 중쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 HFW는 중쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 HCDR은 중쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 HCDR들은 함께 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 대응 HCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]
를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편과, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단을 포함하는 벡터 또는 벡터 집단에 관한 것이다.
제5 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단을 포함하는 숙주 세포, 특히 발현 숙주 세포에 관한 것이다.
제6 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단, 또는 본 발명의 숙주 세포, 특히 발현 숙주 세포를 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제7 측면에서, 본 발명은 다중 특이적 구조체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 1개 이상을 1개 이상의 단계에서 적어도 제2의 생물활성 도메인과, 선택적으로는 1개 이상의 추가 생물활성 도메인을 포함하는 다중 특이적 구조체로 클로닝하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제8 측면에서, 본 발명은 (i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따르는 항체 또는 이의 기능성 단편과; (ii) 제2의 생물활성 도메인; 그리고 선택적으로 (iii) 1개 이상의 추가 생물활성 도메인을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체에 관한 것이다.
제9 측면에서, 본 발명은 의약품으로서 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체에 관한 것이다.
제10 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체의 의약품 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.
제11 측면에서, 본 발명은 질환, 특히 인간의 질환이 발병한 대상체를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체 유효량만큼을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
제12 측면에서, 본 발명은 질환, 특히 인간의 질환을 치료함에 있어 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 용도; 또는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체에 관한 것이다.
도 1은 사이노몰거스 원숭이(군당 3마리, 평균으로 보임; 데이터는 표 8과 실시예 7을 참조함)에 정맥내 투여(3 mg/ml)된 후, PRO462의 약동학적 매개변수를 보여준다. 혈액 시료는 21일의 기간에 걸쳐 취하여졌다. 그래프는 군의 혈장중 평균 PRO462 농도를 보여준다. 항 약물 항체 개발로 말미암아 후반부 시점은 생략되었다.
도 2는 실시예 6에 논의된 마우스 PK 연구 결과들을 보여준다(시험 약물 5 mg/kg만큼이 정맥내 투여된 수컷 CD-1 마우스에 있어 군의 혈장중 평균 PRO497 농도; 데이터는 표 9를 참조함).
도 3은 다중 특이적 구조체 PRO497의 구조를 보여준다.
도 2는 실시예 6에 논의된 마우스 PK 연구 결과들을 보여준다(시험 약물 5 mg/kg만큼이 정맥내 투여된 수컷 CD-1 마우스에 있어 군의 혈장중 평균 PRO497 농도; 데이터는 표 9를 참조함).
도 3은 다중 특이적 구조체 PRO497의 구조를 보여준다.
본 발명은 인간 혈청 알부민(HSA)에 특이적인 신규 항체에 관한 것이다.
달리 정의되어있지 않은 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술을 가진 자들에 의해 일반적으로 이해되고 있는 의미와 동일한 의미를 가진다.
"~를 포함하는(comprising)" 및 "~를 포함하는(including)"이란 용어는, 달리 명시되지 않는 한, 본원에서 제약을 두지 않고 비제한적인 의미로 사용된다. 그러므로 이처럼 비제한적 의미로 사용되는 구현예들과 관련하여, "~를 포함하는"이란 용어는 이보다 협소한 의미의 용어인 "~으로 이루어진"을 포함한다.
본 발명을 기술하는 내용(특히 첨부된 청구항들의 내용) 중 "하나의" 및 "한"및 "본"이란 용어, 그리고 유사 언급대상은, 본원에 달리 명시되지 않았거나 내용과 명백히 상충하지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포괄하는 것으로 해석되어야 할 것이다. 예를 들어 "한 세포"란 용어는 세포 혼합물을 비롯한 세포 다수를 포함한다. 복수 형태를 나타내는 용어가 화합물과 염 등에 대해 사용되는 경우, 이 용어는 또한 단일의 화합물 또는 염도 의미하는 것으로 간주된다.
"HSA"란 용어는, 구체적으로 UniProt ID 번호 P02768인 인간 혈청 알부민 또는 이의 변이체를 지칭한다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 인간 혈청중에 풍부하게 존재하고(총 단백질의 50%), 585개의 아미노산으로 구성된 66.4 kDa의 단백질이다(Sugio, Protein Eng, Vol. 12, 1999, 439-446). 다기능성 HSA 단백질은 다수의 대사물질, 예컨대 지방산, 금속 이온, 빌리루빈 및 몇몇 약물의 결합 및 운반을 허용하는 구조와 결합되어 있다(Fanali, Molecular Aspects of Medicine, Vol. 33, 2012, 209-290). HSA의 혈청중 농도는 약 3.5 g/dL ~ 약 5 g/dL이다. 알부민 결합 항체와 이의 단편은, 예를 들어 약물이나 이 약물과 접합한 단백질의 생체 내 혈청중 반감기를 연장시키기 위해 사용될 수 있다.
그러므로 제1 측면에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고,
가변 경쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4을 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 LFW는 경쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 LCDR은 경쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 LCDR들은 함께 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 대응 LCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]; 그리고
가변 중쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 HFW는 중쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 HCDR은 중쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 HCDR들은 함께 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 대응 HCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]
를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.
본 발명의 내용 중, "항체"란 용어는 "면역글로불린"(Ig)에 대한 유의어로서 사용되는데, 이는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgY 또는 IgD 군(또는 이의 임의의 하위군)에 속하는 단백질로서 정의되고, 종래에 공지된 항체 모두를 포함한다. 자연발생 "항체"는, 중(H) 쇄 적어도 2개와 경(L) 쇄 적어도 2개가 이황화 결합에 의해 상호 결합되어 포함되어 있는 당단백질이다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로서 약칭됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, 즉 CL로 구성되어 있다. VH 영역 및 VL 영역은 추가로, 틀 영역(FW)이라 칭하여지는 더욱 잘 보존된 영역들 사이에 배치된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 칭하여지는 초가변 영역으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카복시 말단 방향으로 하기 순서로 배열된 CDR 3개와 FW 4개로 구성된다: FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3-FW4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역들은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.
"항체 단편"이란 용어는, 비변형 항체 또는 이의 재조합 변이체의 일부분 적어도 하나를 지칭하고, "기능성 단편" 또는 "기능성 항체 단편"이란 용어는, 기능성 항체 단편의 표적, 예컨대 항원 인지 및 이 표적과의 특이적 결합을 제공하기에 충분한, 비변형 항체의 적어도 항원 결합 도메인, 예컨대 항원 결정 가변 영역을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 기능성 항체 단편의 예로서는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편들, scFv 항체 단편, 선형 항체, 단일 도메인 항체, 예컨대 sdAb(VL 또는 VH), 낙타과 VHH 도메인, 그리고 항체 단편, 예컨대 경첩 영역에서 이황화물 가교에 의해 결합된 Fab 단편 2개 이상, 예컨대 2개, 또는 결합한 항체의 단리된 CDR 또는 기타 에피토프 결합 단편 2개 이상, 예컨대 2개를 포함하는 2가 단편으로 제조된 다중 특이적 분자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체 단편은 또한 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 나노바디, 인트라바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv에 통합될 수 있다(예컨대 문헌(Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005) 참조). 항체 단편은 또한 제III형 피브로넥틴(Fn3)과 같은 폴리펩티드를 기반으로 하는 스캐폴드에 그래프팅(grafting)될 수 있다(피브로넥틴 폴리펩티드 미니바디가 기술되어 있는 미국 특허 제6,703,199호 참조). 항체의 "항원 결합 영역" 또는 "항원 결합 도메인"은, 통상 항체의 초가변 영역(들) 1개 이상, 즉 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역에서 발견되지만; 가변 "틀" 영역도 또한, 예컨대 CDR에 대한 스캐폴드를 제공함으로써 항원 결합에서 중요한 역할을 할 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역글로불린과, 숙주 조직 또는 인자, 예컨대 다양한 면역계 세포(예컨대 효과기 세포)와 고전적 보체계의 제1 성분(Clq)의 결합을 매개할 수 있다. 용어"항체"는, 예를 들어 모노클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타과 항체 또는 키메라 항체를 포함한다. 항체는 임의의 이소타입의 것(예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 임의의 군의 것(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위군의 것일 수 있다
"상보성 결정 영역" ("CDR")은 Kabat외 다수에 의해 기술된 체계(1991)("Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD) ("Kabat" 번호매김 체계), Al-Lazikani외 다수에 의해 기술된 체계(1997)(JMB 273, 927-948) ("Chothia" 번호매김 체계) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 번호매김에 의한 체계(Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P외 다수(Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)("IMGT" 번호매김 체계)를 비롯한 다수의 널리 공지된 체계 중 임의의 것이 사용되어 경계가 결정되는 아미노산 서열이다. 예를 들어 전통적인 포맷의 경우 Kabat 체계하에서 중쇄 가변 도메인(VH) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 31번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; 경쇄 가변 도메인(VL) 중의 CDR 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2), 그리고 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Chothia 체계하에서 VH 중의 CDR 아미노산은 26번 ~ 32번(HCDR1), 52번 ~ 56번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3)과 같이 번호가 매겨지고; VL 중의 아미노산 잔기들은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)과 같이 번호가 매겨진다. Kabat 체계 및 Chothia 체계 둘 다에 의한 CDR 정의들을 조합하였을 때, 인간 VH 중의 CDR은 26번 ~ 35번(HCDR1), 50번 ~ 65번(HCDR2) 및 95번 ~ 102번(HCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어지고, 인간 VL 중의 CDR은 24번 ~ 34번(LCDR1), 50번 ~ 56번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3) 아미노산 잔기들로 이루어진다. IMGT 하에서 VH 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 26번 ~ 35번(HCDR1), 51번 ~ 57번(HCDR2) 및 93번 ~ 102번(HCDR3)으로 번호가 매겨지고, VL 중의 CDR 아미노산 잔기들은 대략 27번 ~ 32번(LCDR1), 50번 ~ 52번(LCDR2) 및 89번 ~ 97번(LCDR3)으로 번호가 매겨진다("Kabat" 체계에 따른 번호매김). IMGT하에 항체의 CDR들은 IMGT/DomainGap Align이라는 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 내용에서는 달리 특별히 언급되지 않는 한 Honegger 및 Pluckthun에 의해 제안된 번호매김 체계("AHo 번호매김")가 사용된다(Honegger & Pluckthun, J. Mol. Biol. 309 (2001) 657-670). 또한 하기 잔기들이 CDR로서 정의된다: LCDR1(CDR-L1라고도 지칭됨): L24 ~ L42; LCDR2(CDR-L2라고도 지칭됨): L58 ~ L72; LCDR3(CDR-L3라고도 지칭됨): L107 ~ L138; HCDR1(CDR-H1라고도 지칭됨): H27-H42; HCDR2(CDR-H2라고도 지칭됨): H57 ~ H76; HCDR3(CDR-H3라고도 지칭됨): H108-H138.
바람직하게 "항원 결합 영역"은 적어도 가변 경(VL) 쇄의 4번 ~ 138번 아미노산 잔기와, 가변 중(VH) 쇄의 5번 ~ 128번 아미노산 잔기(각각의 경우 번호매김은 Honegger 및 Pluckthun에 따름), 더욱 바람직하게 VL의 3번 ~ 144번 아미노산 잔기 및 VH의 4번 ~ 144번 아미노산 잔기를 포함하고, 특히 바람직하게는 전체 VL 및 VH 사슬(VL의 1번 ~ 149번 아미노산 위치 및 VH의 1번 ~ 149번 아미노산 위치)이다. 틀 영역 및 CDR은 표 7에 명시되어 있다. 본 발명에서 사용하기 바람직한 면역글로불린 군은 IgG이다. 본 발명의 "기능성 단편"은 F(ab')2 단편, Fab 단편, Fv 및 scFv의 도메인을 포함한다. F(ab')2 또는 Fab는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에서 일어나는 분자간 이황화물 상호작용이 최소화되거나 완전히 제거되도록 조작될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 섹션 [0079] ~ [0082]에 추가로 기술된 바와 같이 이기능성 또는 다기능성 구조체의 일부일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 결합 분자는, 이 결합 분자가 표적 생물분자와, 1개 이상의 기준 분자(들)를 구별할 수 있을 때, 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민"에 특이적"이거나, 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민"을 특이적으로 인지"하거나, 또는 표적, 예컨대 인간 혈청 알부민"에 특이적으로 결합"하는 것인데, 왜냐하면 결합 특이성은 절대적인 것이 아니고, 상대적인 특성이기 때문이다. 자체의 가장 일반적인 형태로 존재할 때 (그리고 한정된 기준이 언급되지 않을 때) "특이적 결합"이란, 결합 분자가, 예를 들어 당 분야에 공지된 특이성 검정 방법에 따라 확정되는 바와 같이, 관심 표적 생물분자와 무관 생물분자를 구별할 수 있는 능력을 지칭한다. 이러한 검정 방법으로서는 웨스턴 블럿팅(Western blotting), ELISA, RIA, ECL, IRMA, SPR(표면 플라스몬 공명법) 검사 및 펩티드 스캔을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 표준 ELISA 검정이 수행될 수 있다. 점수매김(scoring)은 표준 발색법(예컨대 서양고추냉이 과산화물과 2차 항체, 그리고 테트라메틸벤지딘과 과산화수소)에 의해 수행될 수 있다. 임의의 웰 내에서의 반응은, 예컨대 450 nm에서의 광학 밀도에 의해 점수가 매겨진다. 통상의 백그라운드(= 음성 반응)는 약 0.1 OD일 수 있고, 통상의 양성 반응은 약 1 OD일 수 있다. 이는, 양의 점수와 음의 점수 사이의 비가 10배 이상일 수 있음을 의미한다. 추가의 예에서, SPR 검정이 수행될 수 있는데, 이때 백그라운드와 신호 간 적어도 10배, 바람직하게는 적어도 100배 차이가 있음은 특이적 결합이 이루어졌음을 나타낸다. 통상적으로 결합 특이성의 확정은 단일 기준 생물분자를 사용하여 수행되는 것이 아니라, 약 3개 내지 약 5개의 무관한 생물분자, 예컨대 분유 또는 트랜스페린 등
으로 이루어진 세트를 사용하여 수행된다.
그러나 "특이적 결합"은 또한 결합 분자가 표적 생물분자와, 기준점으로 사용되는 1개 이상의 밀접하게 관련된 생물분자(들), 예컨대 상이한 종으로부터 유래하는 혈청 알부민, 예컨대 소 혈청 알부민을 구별하는 능력을 지칭할 수도 있다. 추가로 "특이적 결합"은 결합 분자가 자체의 표적 항원의 상이한 부분들, 예컨대 표적 생물분자의 상이한 도메인, 영역 또는 에피토프를 구별하는 능력, 또는 표적 생물분자의 아미노산 잔기 확장부 또는 핵심 아미노산 잔기 1개 이상을 구별하는 능력과 관련이 있을 수도 있다.
본 발명의 내용에 있어 "에피토프"란 용어는, 표적 생물분자와 결합 분자간의 특이적 결합에 필요한, 주어진 표적 생물분자의 부분을 지칭한다. 에피토프는 연속적일 수 있거나(즉 표적 생물분자 내에 존재하는 인접 구조 요소들에 의해 형성될 수 있거나), 또는 불연속적일 수 있다(즉 표적 생물분자의 1차 서열, 예컨대 표적인 단백질의 아미노산 서열 내 상이한 위치에 있지만, 예컨대 체액 중 표적 생물분자가 채택하는 3차원 구조상으로는 매우 가까이에 있는 구조적 요소에 의해 형성될 수 있다).
특정 구현예에서, 상기 가변 경쇄는 Vκ1 경쇄이고/이거나, 상기 가변 중쇄는 VH3 사슬이다. 다른 특정의 구현예에서, 상기 가변 경쇄는 Vκ 틀 영역 I ~ III 및 Vλ 틀 영역 IV를 포함하는 키메라 경쇄이다. 일 구현예에서, 경쇄는
(i) 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 따르는 VL 서열로부터 취하여지는 CDR 도메인들, 즉 CDR1, CDR2 및 CDR3;
(ii) 인간 Vκ 틀 영역 FW1 ~ FW3, 특히 인간 Vκ1 틀 영역 FW1 ~ FW3;
(iii) (a) FW4에 대한 인간 Vλ 생식계열 서열, 특히 서열 번호 6 및 서열 번호 7로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호 7인 Vλ 생식계열 서열; 및 (b) 가장 가까운 FW4에 대한 인간 Vλ 생식계열 서열에 비하여 돌연변이를 1개 또는 2개, 특히 돌연변이를 1개 가지고, 서열 번호 6 및 서열 번호 7로부터 선택되는 아미노산 서열, 바람직하게는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 Vλ 기반 서열로부터 선택되는 FW4
를 포함하는 키메라 경쇄이다.
본 발명의 내용에서 "VH"(가변 중쇄), "Vκ" 및 "Vλ"란 용어는, 서열 동일성과 상동성에 따라 분류된 항체 중쇄 서열 및 경쇄 서열의 과를 지칭한다. 예컨대 상동성 검색 매트릭스, 예컨대 BLOSUM(Henikoff, S. &Henikoff, J. G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 10915-10919)을 사용하여 서열 상동성을 확정하기 위한 방법과, 상동성에 따라서 서열을 분류하기 위한 방법은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. VH의 경우 상이한 하위 과 Vκ 및 Vλ는, 예컨대 VH1A, VH1B 및 VH2 ~ VH6인 VH, Vκ1 ~ Vκ4인 Vκ, 그리고 Vλ1 ~ Vλ3인 Vλ로 구분한 문헌[Knappik et al., J. Mol. Biol. 296 (2000) 57-86]에 보인 바와 같이 식별될 수 있다. 항체 Vκ 사슬, Vλ 사슬 및 VH 사슬은 생식계열 κ 사슬 V 및 J 분절, 생식계열 λ 사슬 V 및 J 분절, 그리고 중쇄 V, D 및 J 분절 각각의 생체 내 무작위 재배열의 결과이다. 주어진 항체 가변 사슬이 어느 하위 과에 속하는지는, 대응하는 V 분절, 구체적으로 틀 영역 FW1 ~ FW3에 의해 결정된다. 그러므로 본 출원에서 오로지 특정의 틀 영역 HFW1 ~ HFW3 세트에 의해서만 특징지어지는 임의의 VH 서열은 임의의 HFW4 서열, 예컨대 중쇄 생식계열 J 분절로부터 취하여진 HFW4 서열, 또는 재배열된 VH 서열로부터 취하여진 HFW4 서열과 합하여질 수 있다. 특정의 구현예들에서, HFW4 서열은 WGQGTLVTVSS이다.
적합하게 본 발명의 항체 또는 기능성 단편은 단리된 항체 또는 이의 기능성 단편이다. 본원에 사용된 바와 같은 "단리된 항체"란 용어는, 자체의 기원 또는 조작으로 말미암아 (i) 발현 벡터 일부분의 발현 생성물로서 숙주 세포 내에 존재하거나, 또는 (ii) 자연에 있을 때 결합되는 것 이외의 것인 단백질이나 기타 화학기와 결합되어 있거나, 또는 (iii) 자연에서는 발생하지 않는 폴리펩티드 또는 이의 단백질을 의미한다. 추가로 "단리된"이란, 어떤 단백질이 (i) 화학 합성되거나; 또는 (ii) 숙주 세포 내에서 발현된 후, 결합하고 있던 단백질로부터 겔 크로마토그래피에 의해 정제된 상태를 의미한다. "단리된 항체"란 용어는 또한 상이한 항원 특이성을 가지는 기타 항체로부터 실질적으로 분리되어 있는 항체를 지칭한다(예컨대 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 단리 항체는 실질적으로 인간 혈청 알부민 이외의 항원과 특이적으로 결합하는 항체로부터 실질적으로 분리되어 있음). 그러나 인간 혈청 알부민과 특이적으로 결합하는 단리 항체는 다른 항원, 예컨대 다른 종으로부터 유래한 혈청 알부민 분자(예컨대 비인간 영장류 및/또는 설치류 혈청 알부민)에 대해 교차 반응성을 가질 수 있다. 게다가 단리된 항체는 세포성 물질 및/또는 화학물질로부터 실질적으로 분리되어 있을 수 있다.
"친화성"이란, 단일 결합 부위 또는 분자, 예컨대 항체 또는 이의 기능성 단편과, 이의 결합 파트너, 예컨대 항원 사이의 비공유 상호작용의 총 합을 지칭한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같은 "결합 친화성"이란, 결합 쌍의 일원들 간 1:1 상호작용, 예컨대 단일 항체 결합 도메인과 이의 항원의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 친화성은, 일반적으로 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 친화성은 당 분야에 공지된 통상의 방법, 예컨대 본원에 기술된 방법들로 측정될 수 있는데, 구체적으로 친화성은 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 수 있다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 KD는, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 더욱 구체적으로는 실시예 2.1에 보인 방법에 의해 측정될 때, 1 pM 내지 50,000 pM, 1 pM 내지 40,000 pM, 1 pM 내지 30,000 pM, 1 pM 내지 25,000 pM, 1 pM 내지 20,000 pM, 1 pM 내지 10,000 pM, 1 pM 내지 7,500 pM, 1 pM 내지 5,000 pM, 1 pM 내지 4,000 pM, 1 pM 내지 3,000 pM, 1 pM 내지 2,000 pM, 1 pM 내지 1,500 pM, 1 pM 내지 1,000 pM일 수 있다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편의, 인간 혈청 알부민과의 결합에 대한 KD 값은, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 더욱 구체적으로는 실시예 2.1에 보인 방법에 의해 측정될 때, 50 nM 미만, 구체적으로 3 nM 미만, 더욱 구체적으로 1 nM 미만이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 pH 값 약 5.5 및 약 7.4 둘 다에서의 인간 혈청 알부민과의 결합에 대해 이러한 KD 값을 가진다. 특정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 비인간 영장류 및/또는 설치류 혈청 알부민과의 결합에 대한 KD 값은, 바람직하게는 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 더욱 구체적으로는 실시예 2.1에 보인 방법에 의해 측정될 때, 1 pM 내지 250,000 pM, 1 pM 내지 200,000 pM, 1 pM 내지 150,000 pM, 1 pM 내지 100,000 pM, 1 pM 내지 75,000 pM, 1 pM 내지 50,000 pM, 1 pM 내지 40,000 pM, 1 pM 내지 30,000 pM, 1 pM 내지 20,000 pM, 1 pM 내지 10,000 pM, 1 pM 내지 7,500 pM, 1 pM 내지 5,000 pM일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 기능성 단편의 비인간 영장류 및/또는 설치류 혈청 알부민과의 결합에 대한 KD 값은, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 더욱 구체적으로는 실시예 2.1에 보인 방법에 의해 측정될 때, 250 nM 미만, 구체적으로 100 nM 미만, 더욱 구체적으로 50 nM 미만이다.
특정 구현예에서, 상기 가변 경쇄는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 따르는 VL 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고/보이거나, 상기 가변 중쇄는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 따르는 VH 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 VH3 사슬이다.
하기 용어들은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열간 서열 관계를 기술하는데 사용된다: "서열 동일성" 또는 "서열 동일성 퍼센트" 및 "서열 유사성" 또는 "서열 유사성 퍼센트". 본원에 사용된 바와 같은 "서열 동일성"이란 용어는, 2개의 폴리펩티드 서열간 동일한 아미노산 잔기의 최대 수를 산정함으로써 확정되는데, 단 최대의 서열 중첩도를 허용시키기 위해서는 갭 및/또는 삽입이 고려될 수 있다. 예를 들어 완전히 동일한 100머 폴리펩티드 2개는 서열 동일성이 100%이다. 이들 폴리펩티드들이 하나의 돌연변이에 의해 상이해지거나, 또는 하나의 폴리펩티드가 하나의 아미노산 결실을 함유하면, 서열 동일성은 99%이다(100개의 위치 중 99개의 위치가 동일). 다시 말해서, "서열 동일성 퍼센트"는, 비교 윈도우에 대해 최적으로 정렬된 서열 2개를 비교하고, 동일한 핵산 염기(예컨대 A, T, C, G, U 또는 I) 또는 아미노산 잔기가 두 서열에 출현하는 위치의 수를 확정하여, 매칭된 위치의 수를 산출한 다음, 매칭되는 위치의 수를 비교 윈도우 내에 있는 위치의 총 수(즉 윈도우 크기)로 나눈 후, 이로부터 얻어진 결과에 100을 곱하여, 서열 동일성 퍼센트를 수득함으로써 산정된다. "서열 유사성"은 2개의 서열이 비교되었을 때 이 두 서열들이 닮은 정도이다. 필요하거나 요망되는 경우, 예를 들어 Smith 및 Waterman의 국소 상동성 알고리즘(Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)), Needleman 및 Wunsch의 상동성 정렬 알고리즘(J. MoI. Biol. 48:443-53 (1970)), Pearson 및 Lipman의 유사성 검색 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)), 이들 알고리즘(예컨대 Wisconsin Genetics 소프트웨어 팩키지 중 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA; Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 컴퓨터를 통한 실행, 또는 시각적 관찰에 의하여, 비교에 최적인 서열 정렬이 수행될 수 있다(일반적으로 Ausubel외 다수 편저 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999) 참조). 본원에 달리 명시되지 않는 한, 본원에 지칭된 서열의 유사도는 Dayhoff PAM 매트릭스를 이용하여 확정된다(M.O. Dayhoff, R. Schwartz, B.C. Orcutt: A model of Evolutionary Change in Proteins, pages 345-352; in: Atlas of protein sequence and structure, National Biomedical Research Foundation, 1979).
"아미노산"이란 용어는, 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산의 작용 방식과 유사한 방식으로 작용을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모의체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화된 것들뿐만 아니라, 사후에 변형된 아미노산, 예컨대 하이드록시프롤린, 감마-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 본원에서 아미노산 잔기들로 이루어진 중합체를 지칭하는 것으로서 호환되어 사용되고 있다. 이 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 인공 모의체인 아미노산 중합체에 적용될 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비 자연 발생 아미노산 중합체에도 적용된다. 달리 명시되지 않는 한, 특정의 폴리펩티드 서열은 또한 명백하게 이 서열의 보존적으로 변형된 변이체도 포함한다.
특정의 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 (i) 서열 번호 1에 따른 VL 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄와, 서열 번호 2에 따른 VH 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 VH 사슬, 또는 (ii) 서열 번호 3에 따른 VL 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄와, 서열 번호 4에 따른 VH 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 VH 사슬을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고, (i) 서열 번호 1에 따른 VL 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄[단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 1에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 CDR 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함함]와; (ii) 서열 번호 2에 따른 VH 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄[단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 2에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 CDR 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함함]를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다. 더욱 구체적인 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고, (i) 서열 번호 1에 따른 VL 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄[단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 1에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 CDR 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 가변 경쇄는 K50Q 및 A51P(AHo 번호매김)를 포함함]와; (ii) 서열 번호 2에 따른 VH 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄[단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 2에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 CDR 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 가변 중쇄는 W54Y, V103T 및 Y105F(AHo 번호매김)를 포함함]를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고, (i) 서열 번호 1에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 가변 경쇄와, (ii) 서열 번호 2에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다. 더욱 구체적인 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고, (i) 서열 번호 1에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄와, (ii) 서열 번호 2에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고, (i) 서열 번호 3에 따른 VL 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄[단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 3에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 CDR 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함함]와; (ii) 서열 번호 4에 따른 VH 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄[단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 4에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 CDR 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함함]를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다. 더욱 구체적인 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고, (i) 서열 번호 3에 따른 VL 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄[단 상기 가변 경쇄는 서열 번호 3에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 CDR 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 가변 경쇄는 I2V, Q3V, K50Q 및 A51P(AHo 번호매김)를 포함함]와; (ii) 서열 번호 4에 따른 VH 서열에 대해 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%, 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 중쇄[단 상기 가변 중쇄는 서열 번호 4에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 CDR 도메인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하고, 상기 가변 중쇄는 I55V, V103T, Y105F(AHo 번호매김)를 포함함]를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고, (i) 서열 번호 3에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 가변 경쇄와, (ii) 서열 번호 4에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 보존적으로 변형된 변이체를 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다. 더욱 구체적인 구현예에서, 본 발명은 인간 혈청 알부민에 특이적이고, (i) 서열 번호 3에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄와, (ii) 서열 번호 4에 따르는 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄를 포함하는, 항체 또는 이의 기능성 단편에 관한 것이다.
"보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 변이체"란 용어는, 아미노산 서열과 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정의 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 지칭하거나, 또는 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우에는, 본질적으로 동일한 핵산 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 말미암아 기능상 동일한 핵산 다수가 임의의 주어진 단백질을 암호화한다. 예를 들어 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 암호화한다. 그러므로 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서 이 코돈은, 암호화된 폴리펩티드를 변경시키지 않고, 기술된 대응 코돈들 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형되는 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 어떤 폴리펩티드를 암호화하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산에 일어날 수 있는 모든 침묵 변형을 기술하기도 한다. 당 업자는 핵산 내에 있는 각각의 코돈(보통 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG와, 보통 트립토판의 유일한 코돈인 TGG는 제외)이 변형되어, 기능상 동일한 분자가 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 그러므로 어떤 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 일어나는 침묵 변이 각각은 기술된 각각의 서열 내에 내포되어 있다.
폴리펩티드 서열에서 "보존적으로 변형된 변이체" 또는 "보존적 변이체"는 어떤 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 일으키는, 폴리펩티드 서열에 대한 각각의 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 이처럼 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 대립형질, 종간 상동체 및 다형성 변이체에 부가적이고, 이것들을 배제하지 않는다. 하기 8개의 군은 서로 간에 보존적 치환인 아미노산들을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소루신(I), 루신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(S), 트레오닌(T); 그리고 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(에컨대 문헌(Creighton, Proteins (1984)) 참조). 일 구현예에서, "보존적 서열 변형"이란 용어는, 어떤 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 유의미한 영향을 미치지 않거나, 이를 유의미하게 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는데 사용된다.
특정의 구현예에서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 하기 매개변수들 중 1개 이상에 의해 특징지어진다:
(i) 인간 혈청 알부민과의 결합에 대한 KD 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법; 더욱 구체적으로는 실시예 2.1에 보인 방법에 의해 측정될 때, 50 nM 미만, 구체적으로 3 nM 미만, 더욱 구체적으로 1 nM 미만임;
(ii) 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, pH 값 약 5.5 및 약 7.4 둘 다에서 이러한 인간 혈청 알부민과의 결합에 대해 이와 같은 KD 값을 가짐;
(iii) 비인간 영장류 및/또는 설치류 혈청 알부민과의 결합에 대한 KD 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법; 더욱 구체적으로는 실시예 2.1에 보인 방법에 의해 측정될 때, 250 nM 미만, 구체적으로 100 nM 미만, 더욱 구체적으로 50 nM 미만임;
(iv) 실시예 2.2에서 사용된 검정법에 의해 확정되는 바에 따르면, HSA와 항 HSA 항체 또는 이의 단편의 결합은, 항체 결합 HSA가 FcRn과 결합하는 능력을 보존하여, HSA 및 FcRn 사이의 상호작용을 통해 항 HSA 항체 또는 이의 단편이 HSA와 함께 재이용되는 것을 허용하여야 함;
(v) 구체적으로 이미 기술된 시차주사형광측정법(DSF)(Egan, et al., MAbs, 9(1) (2017), 68-84; Niesen, et al., Nature Protocols, 2(9) (2007) 2212-2221)에 의해 확정되는 바에 따르면, 구체적으로 시료들이 pH 값 3.5 내지 7.5 범위이고, 0.15 M ~ 0.25 M NaCl, 특히 0.15 M NaCl을 함유하는 인산염-시트르산염 완충제 5개 중에서 희석될 때, scDb 항체 포맷(단일 사슬 다이아바디 포맷) 또는 scFv 항체 포맷(단일 사슬 가변 단편 포맷), 바람직하게 scFv 포맷으로 발현될 때의 열 언폴딩 온도(Tm)의 평균 중간점은 적어도 60℃를 초과하여야 함 [scFv 구조체의 열 언폴딩에 있어서의 전이 중간점은 형광 염료인 SYPRO® 오렌지를 사용하여 시차주사형광측정법에 의해 확정됨(Wong & Raleigh, Protein Science 25 (2016) 1834-1840 참조). 유관 수용 조건하에 있는 시료는 유관 완충제 중에 제조된 수용 원액에 스파이킹(spiking)하여 최종 단백질 농도 50 μg ml-1이 되도록 준비됨. 완충제 정탐 실험(scouting experiment)을 위해, 시료는 최종 scFv 완충제 중에 희석되되, 단 pH 값은 상이하게 하고(pH 3.4, 4.4, 5.4, 6.4 및 7.2), 5x SYPRO® 오렌지는 총 부피 100 μl 중 최종 농도로 포함시킴. scFv DSF 기준은 미지의 시료들과 함께 내부 대조군으로서 측정됨. 준비된 시료 25 마이크로리터만큼이 백색의 벽으로 둘려있는 AB 유전자 PCR 평판에 3회 첨가됨. 검정은 고온 순환기로서 사용되는 qPCR 기기 내에서 수행되고, 형광 발광은 소프트웨어의 맞춤 염료 교정 루틴에 따라서 검출됨. 검정 시료가 담긴 PCR 평판 온도는 1℃씩 승온하여 25℃에서 96℃까지 상승되고, 매 승온 시마다 30초씩 휴지기를 둠. 총 검정 시간은 약 2시간임. Tm은 곡선의 변곡점을 산정하기 위한 산술적 2차도함수법을 이용하여 소프트웨어 GraphPad Prism에 의해 산정되고; 보고된 Tm은 3회 측정값의 평균이며; 특정 구현예에서, Tm의 확정은 실시예 4.1에 기술된 바와 같이 수행되되, 단 시료는 pH 값 6.4이고, 0.25 M NaCl을 함유하는 인산염-시트르산염 완충제 중에 희석됨]; 그리고
(vi) 단편이 항체 단편 포맷으로 사용될 때, 이 단편은 구체적으로 실시예 4.2에 따라 수행되는 스트레스 안정성 연구에서 28일 동안 37℃에서의 단량체 함량 감소율(monomeric content loss)이 3% 미만인 것, 구체적으로 본 발명의 항체가 출발 농도 10 mg/ml로 존재할 때, 단량체 함량 감소율이 2% 미만인 것에 의해 입증되는 바와 같이, 분해 생성물 및/또는 응집체의 부재 또는 제한된 양만큼의 생성에 의해 입증되는 바에 의하면 안정적이어야 함.
바람직한 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 열 언폴딩 온도(Tm)의 평균 중간점이 적어도 65℃를 초과하여, 바람직하게 적어도 69℃이다. 단백질은 14일간의 보관 기간 동안에 37℃ 및 50 mM 시트르산염-인산염(pH 6.4), 150 mM NaCl 중에서 SE-HPLC에 의한 올리고머화에 관하여 분석된다. 본 연구에 들어가기 앞서, 시료는 10 g/l로 농축되고, d0 시점이 결정된다. 단량체 함량은 시료를 Shodex KW-402.5-4F 컬럼으로 분리하여, 얻어진 크로마토그램을 평가함으로써 정량된다. 단백질 함량의 상대적 퍼센트를 산정하기 위해, 단량체 피크의 면적은 시료 매트릭스에 의해 나타날 수 없는 피크들의 총 면적으로 나누어진다. 바람직한 구현예에서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은, 2주 동안 37℃ 및 50 mM 시트르산염-인산염(pH 6.4), 150 mM NaCl 중에서 농도 10 g/l 인채 보관될 때, 15%, 12%, 10%, 7%, 5% 또는 2% 미만, 바람직하게 5% 미만, 더욱 바람직하게 2% 미만의 단량체 함량 감소율을 보인다.
본 발명의 일 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 기능성 단편은 IgG 항체, Fab 및 scFv 단편으로부터 선택된다. 적합하게 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편은 scFv 항체 단편이다. "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는데, 단 이들 도메인은 하나의 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로 Fv 폴리펩티드는 VH 도메인 및 VL 도메인 사이에, sFv가 표적 결합에 요망되는 구조를 형성하도록 만들 수 있는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는데, 단 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 일반적으로 scFv 폴리펩티드는 VH 도메인 및 VL 도메인 사이에, sFv가 항원 결합에 요망되는 구조를 형성하도록 만들 수 있는 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다(예컨대 문헌(Pluckthun, The pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, 1994, pp. 269-315) 참조).
특정의 구현예들에서, 상기 기능성 단편은 서열 번호 5에 따르는 링커를 포함하는 scFv 포맷이다.
본 발명의 또 다른 특정의 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 기능성 단편은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 다중 특이적 포맷, 예컨대 이중 특이적 포맷, 비제한적 예를 들자면 단일 사슬 다이아바디(scDb), 탠덤 scDb(Tandab), 선형 이량체 scDb(LD-scDb), 원형 이량체 scDb(CD-scDb), 이중 특이적 T 세포 점유체(Bispecific T-cell Engager; BiTE; 탠덤 디-scFv), 탠덤 트리-scFv, 트리바디(Fab-(scFv)2), 바이바디(Fab-(scFv)1), 트리아바디, scDb-scFv, 이중 특이적 Fab2, 디-미니항체, 테트라바디, scFv-Fc-scFv 융합체, 디-다이아바디, DVD-Ig, COVD, IgG-scFab, scFab-dsscFv, Fv2-Fc, IgG-scFv 융합체, 예컨대 bsAb(경쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Bs1Ab(경쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs2Ab(중쇄의 N 말단에 결합된 scFv), Bs3Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 scFv), Ts1Ab(경쇄와 중쇄 둘 다의 N 말단에 결합된 scFv), Ts2Ab(중쇄의 C 말단에 결합된 dsscFv), 그리고 납-인-홀(Knob-into-Hole) 항체(KiHs)(KiH 기법에 의해 제조된 이중 특이적 IgG), MATCH(WO2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84에 기술됨) 그리고 듀오바디(DuoBody)(듀오바디 기법에 의해 제조된 이중 특이적 IgG)(MAbs. 2017 Feb/Mar;9(2):182-212. doi: 10.1080/19420862.2016.1268307)를 기반으로 하는 포맷으로부터 선택되는 항체 포맷인, 다중 특이적 구조체, 예컨대 이중 특이적 구조체, 또는 다가 구조체, 예컨대 이가 구조체이다. 단일 사슬 다이아바디(scDb), 구체적으로 이중 특이적 단량체 scDb가 본원에 사용되기 특히 적합하다. scDb-scFv 또는 MATCH, 바람직하게 scDb-scFv가 본원에 사용되기 더욱 특히 적합하다.
"다이아바디"란 용어는 항원 결합 부위를 2개 가지는 항체 단편을 지칭하는데, 이 단편은 동일 폴리펩티드 사슬 내 VL과 결합된 VH(VH-VL)를 포함한다. 지나치게 짧아서 동일 사슬상 도메인 2개 사이의 쌍 형성을 허용하지 않는 링커가 사용되면, 이들 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 쌍을 형성하게 되고, 이로써 2개의 항원 결합 부위가 생성된다. 다이아바디는 이가 또는 이중 특이적일 수 있다. 다이아바디는, 예컨대 문헌[EP404097, WO1993/01161, Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003), 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 자세히 기술되어 있다. 트리아바디 및 테트라바디도 또한 문헌[Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기술되어 있다.
이중 특이적 scDb, 구체적으로 이중 특이적 단량체 scDb는, 구체적으로 링커 L1, L2 및 L3에 의해 VHA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VLA, VHA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VLA, VLA-L1-VLB-L2-VHB-L3-VHA, VLA-L1-VHB-L2-VLB-L3-VHA, VHB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VLB, VHB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VLB, VLB-L1-VLA-L2-VHA-L3-VHB 또는 VLB-L1-VHA-L2-VLA-L3-VHB와 같은 순서로 결합되어 있는, 2개의 가변 중쇄 도메인(VH) 또는 이의 단편과, 2개의 가변 경쇄 도메인(VL) 또는 이의 단편을 포함하되, 단 상기 VLA 도메인 및 VHA 도메인은 함께 제1 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성하고, 상기 VLB 및 VHB는 함께 제2 항원에 대한 항원 결합 부위를 형성한다.
링커 L1은, 구체적으로 2개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 3개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이고, 링커 L3은, 구체적으로 1개 ~ 10개 아미노산, 더욱 구체적으로 2개 ~ 7개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 5개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다. 중간 링커인 L2는, 구체적으로 10개 ~ 40개 아미노산, 더욱 구체적으로 15개 ~ 30개 아미노산, 그리고 가장 구체적으로 20개 ~ 25개 아미노산으로 이루어진 펩티드이다.
본 발명의 일 구현예에서, 단리 항체 또는 이의 기능성 단편은 문헌[WO2016/0202457; Egan T., et al., mAbs 9 (2017) 68-84]에 기술된 MATCH 포맷의 다중 특이적 및/또는 다가 항체이다.
본 발명의 이중 특이적, 이가, 다중 특이적 및/또는 다가 구조체는 당 분야에 공지된 임의의 편리한 항체 제조 방법을 사용하여 제조될 수 있다[예컨대 이중 특이적 구조체의 제조에 관한 문헌(Fischer, N. & Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14); 이중 특이적 다이아바디 및 탠덤 scFv에 관한 문헌(Hornig, N. &Fδrber-Schwarz, A., Methods Mol. Biol. 907 (2012)713-727, 및 WO 99/57150) 참조]. 본 발명의 이중 특이적 구조체를 제조하는데 적합한 방법의 구체 예로서는, 여타의 것들 중 Genmab 기법(Labrijn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (2013) 5145-5150 참조) 및 Merus 기법(de Kruif et al., Biotechnol. Bioeng. 106 (2010) 741-750 참조)을 추가로 포함한다. 기능성 항체 Fc 부분을 포함하는 이중 특이적 항체를 제조하기 위한 방법도 또한 당 분야에 공지되어 있다[예컨대 문헌(Zhu et al., Cancer Lett. 86 (1994) 127-134); 및 Suresh et al., Methods Enzymol. 121 (1986) 210-228) 참조].
이러한 방법은, 통상, 예컨대 하이브리도마 기법을 이용하여 원하는 항원으로 면역화된 마우스 유래 비장 세포와 골수종 세포를 융합하거나(예컨대 Yokoyama et al., Curr. Protoc. Immunol.Chapter 2, Unit 2.5, 2006 참조), 또는 재조합 항체 조작(레파토리 클로닝 또는 파아지 전시/효모 전시)에 의하거나(예컨대 Chames&Baty, FEMS Microbiol. Letters 189 (2000) 1-8 참조), 그리고 상이한 모노클로날 항체 2개의 항원 결합 도메인 또는 이의 단편이나 부분을 조합함으로써, 공지의 분자 클로닝 기법을 사용하여 이중 특이적 구조체를 만들어 모노클로날 항체를 생성하는 단계를 수반한다.
제2 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 그리고 선택적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
"약학적으로 허용 가능한"이란 어구는, 어떤 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여형이 건전한 의학적 판단 범위 안에 있는 것이고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제나 합병증을 보이지 않는 채 인간 또는 동물 조직과의 접촉에 사용되기 적합하며, 합리적인 이익/위험 비(benefit/risk ratio)에 비례하는 경우를 지칭한다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 보통 약학적으로 허용 가능한 농도만큼의 염, 완충제, 보존제, 보충적 면역증강제, 예컨대 아주반트 및 시토카인를 추가로 포함할 수 있고, 선택적으로는 기타 치료제를 포함할 수 있다. 본 조성물은 또한 항산화제 및/또는 보존제를 포함할 수 있다. 항산화제로서는 티올 유도체(예컨대 티오글리세롤, 시스테인, 아세틸시스테인, 시스틴, 디티오에리트레이톨, 디티오트레이톨, 글루타치온), 토코페롤, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 황산 염(예컨대 황산나트륨, 중아황산나트륨, 아세톤중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산나트륨, 포름알데히드설폭실산나트륨, 티오황산나트륨) 및 노르디하이드로구아이아레트산이 예시될 수 있다. 적합한 보존제는, 예를 들어 페놀, 클로로부탄올, 벤질알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 염화벤잘코늄 및 염화세틸피리디늄일 수 있다.
본원에 제공된 특정 구현예들에서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은, 재조합 수단, 예컨대 숙주 세포에 형질감염되어 도입된 재조합 발현 벡터를 통해 발현된 항체, 재조합 조합 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 서열을 암호화하는 DNA 서열의 합성, 유전자 조작, 또는 인간 면역글로불린을 암호화하는 서열, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 서열의, 이와 같은 다른 서열에의 스플라이싱(splicing)을 통한 생성을 수반하는 기타 임의의 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체에 의해 단리, 제조, 발현 또는 생성될 수 있다.
그러므로 제3의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단에 관한 것이다.
"핵산"이란 용어는 본원에서 "폴리뉴클레오티드"란 용어와 호환되어 사용되고 있으며, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드와 이것들의 중합체(단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태)를 지칭한다. 이 용어는 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본(backbone) 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함하는데, 이것들은 합성, 자연발생 및 비 자연 발생의 것이고, 기준 핵산의 결합 특성과 유사한 결합 특성을 가지며, 기준 뉴클레오티드의 대사 방식과 유사한 방식으로 대사된다. 이러한 유사체의 예들로서는 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포레이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 달리 명시되지 않는 한, 특정의 핵산 서열은 또한 암묵적으로 (예컨대 축퇴성 코돈 치환으로 인한) 자체의 보존적 변형 변이체와 상보성 서열을 포함할 뿐만 아니라, 명백하게 명시된 서열을 포함하기도 한다. 특히 이하에 기술된 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택 코돈(또는 모든 코돈)의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
제4의 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단을 포함하는 벡터 또는 벡터 집단에 관한 것이다. "벡터" 또는 "발현 벡터"란 용어는 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 숙주 세포, 바람직하게는 포유류 세포 내에서의 발현을 도모하기 위한 폴리뉴클레오티드, 가장 일반적으로는 DNA 플라스미드를 의미한다. 벡터는 세포 내에서 복제할 수 있거나 복제할 수 없다. 일단 본원에 기술된 항체 또는 이의 단편의 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 수득되면, 항체 분자의 제조를 위한 벡터는 당 분야에 널리 공지된 기법을 이용하는 재조합 DNA 기법에 의해 제조될 수 있다. 그러므로 항체 암호화 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 단백질을 제조하기 위한 방법이 본원에 기술되어 있다. 당 업자들에게 널리 공지된 방법은 항체 암호화 서열, 적당한 전사 및 번역 제어 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법으로서는, 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체 내 유전자 재조합법을 포함한다.
발현 벡터는 종래의 기법에 의해 숙주 세포에 옮겨질 수 있고, 이로부터 말미암는 세포는 이후 종래의 기법에 의해 배양될 수 있으며, 이로써 본원에 기술된 항체 또는 이의 단편이 제조될 수 있다. 그러므로 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단을 포함하는 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포에 관한 것이다. 임의의 구현예들에서, 숙주 세포는, 본 발명의 항체 또는 이것들의 단편의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유한다. 특정의 구현예들에서, 숙주 세포는 상이한 벡터 2가지를 함유하는데, 이 벡터 2가지 중 제1 벡터는 상기 항체 또는 이의 단편의 가변 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터는 상기 항체 또는 이의 단편의 가변 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예들에서, 제1 숙주 세포는 상기 항체 또는 이의 단편의 가변 중쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 벡터를 포함하고, 제2 숙주 세포는 상기 항체 또는 이의 단편의 가변 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다.
토끼 항체 또는 설치류 항체의 인간화를 위한 방법은 임의의 당 업자에게 널리 공지되어 있다(예컨대 문헌(Borras, loc. cit.; Rader et al, The FASEB Journal, 발간 논문 10.1096/fj.02-0281fje, 2002년 10월 18일 온라인 발행; Yu et al (2010) "A Humanized Anti-VEGF Rabbit Monoclonal Antibody Inhibits Angiogenesis and Blocks Tumor Growth in Xenograft Models". PLoS ONE 5(2): e9072. doi:10.1371/journal.pone.0009072) 참조). 토끼 또는 설치류의 면역화는 보통 말하는 그런 관심 항원, 예컨대 단백질로 수행될 수 있거나, 펩티드 또는 단백질 항원의 경우에는 관심 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산, 예컨대 플라스미드로 토끼를 DNA 면역화하여 수행될 수 있다.
제5의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단을 포함하는 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포에 관한 것이다.
"숙주 세포"란 용어는, 내부에 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포뿐만 아니라, 그러한 세포의 자손까지 지칭하도록 의도되는 것으로 이해되어야 할 것이다. 돌연변이 또는 환경의 영향으로 말미암아 다음 세대에 임의의 변형이 일어날 수 있으므로, 사실 이러한 자손은 모 세포와 동일할 수 없지만, 여전히 본원에 사용되는 바와 같은 "숙주 세포"라는 용어의 범위 안에 포함된다.
제6의 측면에서, 본 발명은, 본 발명의 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 본 발명의 벡터 또는 벡터 집단, 또는 본 발명의 숙주 세포, 구체적으로 발현 숙주 세포를 발현시키는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
제7의 측면에서, 본 발명은, 본 발명에 따르는 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 1개 이상을 1개 이상의 단계에서 적어도 제2의 생물활성 도메인과, 선택적으로는 1개 이상의 추가 생물활성 도메인을 포함하는 다중 특이적 구조체에 클로닝하는 단계를 포함하는, 다중 특이적 구조체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
제8의 측면에서, 본 발명은 (i) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편과; (ii) 제2의 생물활성 도메인; 그리고 선택적으로 (iii) 추가 생물활성 도메인 1개 이상을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체에 관한 것이다.
제7의 측면 또는 제8의 측면의 특정 구현예들에서, 제2 생물활성 도메인은 제2 항체 또는 이의 기능성 단편이다.
특정 구현예들에서, 상기 선택적 추가 생물활성 도메인들 중 적어도 1개가 존재하는데, 구체적으로 상기 추가 생물활성 도메인은 제3의 항체 또는 이의 기능성 단편이다.
특정의 구현예들에서, 본 다중 특이적 폴리펩티드 구조체는 폴리펩티드 링커 1개 이상을 추가로 포함한다.
특정의 구현예들에서, 상기 다중 특이적 폴리펩티드는 단량체 폴리펩티드, 구체적으로 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능성 단편이 링커를 통해, 구체적으로 제2 scFv 항체 단편인 상기 제2 생물활성 도메인에 결합된 scFv 항체 단편인 단량체 폴리펩티드이다.
특정의 구현예들에서, 상기 다중 특이적 폴리펩티드는 이량체 폴리펩티드, 구체적으로 폴리펩티드 2개의 결합이 상기 다중 특이적 폴리펩티드에 포함된 항체 단편의 상보성 VL 도메인 및 VH 도메인의 결합에 의해 유발되는 이량체 폴리펩티드이다. 이와 같은 특정의 구현예들에서, 다중 특이적 폴리펩티드는 WO 2016/202457의 교시에 따르는 다중 특이적 항체 구조체이다. 또 다른 특정의 구현예들에서, 다중 특이적 폴리펩티드는 단일 사슬 다이아바디 구조체(scDb)이다. 또 다른 특정의 구현예들에서, 다중 특이적 폴리펩티드는, VL-CL 및 VH-CH1으로 이루어진 Fab 단편(단 불변 도메인 중 하나는 스캐폴드를 형성함)의 헤테로이량체성 조립을 이용하는 (Fab-scFv)n 구조체[여기서 n은 1, 2, 3 또는 4로부터 선택되는 정수이고, scFv 단편 1개 이상은 가요성 링커를 통해 부착됨]이다.
제9의 측면에서, 본 발명은 의약품으로서 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 질환, 구체적으로 인간의 질환을 치료하는데 사용하기 위한, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체(단 상기 다중 특이적 폴리펩티드 구조체는 대응 질환과 치료적으로 관련된 표적과 특이적으로 상호작용할 수 있는 제2의 생물활성 도메인을 포함함)에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료", "치료하는 것", "치료하다", "치료된" 등과 같은 용어는, 요망되는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 수득하는 것을 지칭한다. 이 효과는 어떤 질환 및/또는 해당 질환으로 인할 수 있는 부작용을 부분적으로나 완전히 치유하거나, 해당 질환의 진행을 지연시킨다는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "치료"는, 포유류, 예컨대 인간에서 어떤 질환에 대한 임의의 치료를 포괄하며, (a) 해당 질환을 억제하는 것, 예컨대 이 질환의 발현을 중단시키는 것; 그리고 (c) 해당 질환을 완화시키는 것, 예컨대 이 질환의 퇴행을 유발시키는 것을 포함한다.
제10의 측면에서, 본 발명은 의약품을 제조함에 있어 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 항체 또는 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
제11의 측면에서, 본 발명은 어떤 질환, 구체적으로 인간의 질환이 발병한 대상체를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체 유효량만큼을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명은 어떤 질환, 구체적으로 인간의 질환이 발병한 대상체를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체 유효량만큼을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 다중 특이적 폴리펩티드 구조체는 대응 질환과 치료적으로 관련된 표적과 특이적으로 상호작용할 수 있는 제2의 생물활성 도메인을 포함하는 방법에 관한 것이다.
"대상체"란 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 비인간 동물은 모든 척추동물, 예컨대 포유류 및 비포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 명시된 경우를 제외하고, "환자" 또는 "대상체"란 용어들은 본원에서 호환되어 사용된다.
"유효량" 또는 "치료적 유효량" 또는 "효과적 양"이란 용어들은, 어떤 질환을 치료하기 위해 포유류 또는 기타 대상체에 투여될 때 해당 질환의 이와 같은 치료를 달성하기 충분한, 어떤 제제의 양을 지칭한다. "치료적 유효량"은 제제, 질환 및 이의 심각성, 치료받을 대상체의 나이, 체중 등에 따라서 달라질 것이다.
제12의 측면에서, 본 발명은 어떤 질환, 구체적으로 인간의 질환을 치료함에 있어 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 본 발명의 항체 또는 이의 기능성 단편을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체[단 이 다중 특이적 폴리펩티드 구조체는 대응 질환과 치료적으로 관련된 표적과 특이적으로 상호작용할 수 있는 제2의 생물활성 도메인을 포함함]의 용도에 관한 것이다.
실시예
하기 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 설명한다.
실시예 1: 선택 및 인간화
HSA 결합 도메인의 선두 후보를 제조하기 위해 15개의 토끼 모노클로날 항체 클론을 선택하였다.
선택한 클론의 인간화는, WO 2014/206561에 기술된 바와 같이 Vλ 틀 IV 서열을 포함하는 Vκ1/VH3 유형의 scFv 수용 틀 상에 토끼 CDR을 옮기는 단계를 포함하였다. 이 과정에서 CDR 영역 6개의 아미노산 서열이 공여 서열(토끼 mAb)상에서 동정되었고, 이를 수용 스캐폴드 서열에 그래프팅하였다.
토끼 공여개체로부터 유래한 것으로서, 임의의 틀 위치에 있으며, CDR 위치선정에 영향을 미치는 관계로 항원 결합에도 잠재적으로 영향을 미친다고 기술된(Borras et al., 2010; J. Biol. Chem., 285:9054-9066) 추가의 아미노산을 최종 구조체에 포함시켰다(표 1 참조). 이와 같은 구조체들에 대한 특성규명 데이터를 비교한 결과, CDR 그래프팅만이 단독으로 수행된 경우에 비하여 유의미한 이점이 확인되었다. 이로부터 생성된 가변 도메인들의 서열을 표 2에 제시하였다.
일단 이전 섹션에 기술된 컴퓨터에 의한 구조체 디자인이 완료되면, 대응 유전자를 합성하고, 세균 발현 벡터를 구성하였다. 발현 구조체의 서열을 DNA 수준으로 확인하였으며, 구조체를 일반적인 발현 및 정제 프로토콜에 따라서 제조하였다.
이.콜라이(E.coli) 내에서 단백질의 불용성 봉입체로서의 이종 발현을 수행하였다. 지수 성장용 출발 배양액을 발현 배양액에 접종하였다. 궤도 진탕기 내 진탕 플라스크에서 시판중인 풍부 배지를 사용하여 배양을 수행하였다. 세포를, 규정 OD600 2가 되도록 성장시키고 나서, 1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)와 함께 밤새도록 발현시켜 유도하였다. 발효의 막바지에 원심분리와 초음파처리에 의한 균질화를 통해 세포를 수득하였다. 이 시점에서 상이한 구조체들의 발현 수준을, 세포 용해물의 SDS-PAGE 분석으로 확정하였다. 세포 파편 및 기타 숙주 세포 불순물을 제거하기 위한 수 회의 세척 단계를 포함하는 원심분리 프로토콜에 의해, 균질화 세포 펠릿으로부터 봉입체를 단리하였다. 정제한 봉입체를 변성 완충제(100 mM Tris/HCl pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA) 중에 용해하였으며, scFv를 계층 리폴딩(scalable refolding) 프로토콜에 의해 리폴딩하여, 원산대로 폴딩된 단량체 scFv를 밀리그램 단위의 양만큼 생성하였다. 하기 단계들을 포함하는 표준화 프로토콜을 이용하여 scFv를 정제하였다. 리폴딩 후 생성물을, Capto L 아가로스(GE Healthcare)를 이용하는 친화성 크로마토그래피로 포획하여, 정제된 scFv를 얻었다. 초기 검정에서 친화성 기준 및 효능 기준을 충족하였던 선도 후보물질을, HiLoad Superdex75 컬럼(GE Healthcare)을 이용하는 광내기 크기별 배제 크로마토그래피(polishing size-exclusion chromatography)에 의해 추가로 정제하였다. 정제 프로토콜 이후, 완충 염수 용액 중에 단백질을 제제화하여 특성규명하였다.
실시예 2: 인간화된 scFv의 특성규명
2.1 pH 7.4 및 pH 5.5에서의 혈청 알부민에 대한 친화성
상이한 종의 혈청 알부민(SA)에 대한 인간화 scFv의 친화성을, MASS-1 디바이스(Sierra Sensors)를 사용하는 SPR 측정법으로 확정하였다. 아민 커플링 화학을 이용하여 SA를 고용량 아민 센서 칩에 직접 커플링(coupling)하였다. 재생 정탐 및 표면 성능 검정을 수행하여 최선의 검정 조건을 찾은 후, scFv의 용량 반응을 측정하였으며, 이로부터 얻어진 결합 곡선을 이중 참조(double-referencing)한 다음(공 기준 채널 및 제로 피분석물 주입), 1:1 랑뮈르(Langmuir) 모델을 이용하여 피팅함으로써, 동력학적 매개변수를 검색하였다. 검정법을 상이한 pH 값에서 2회 진행하였는데; 한 번은 1 X PBS-Tween 완충제(pH 5.5)에서, 그리고 나머지 한 번은 1 X PBS-Tween 완충제(pH 7.4)에서 진행하였다.
인간화 구조체에 대한 결합 동력학 측정은, 클론 2개의 종간 교차 반응성(cross-species reactivity)의 차이와, 검정된 CDR 및 STR 그래프트의 정량적 차이를 보였다. 두 구조체 쌍의 경우, 기술된 구조적 잔기들의 통합은 친화성의 개선을 달성하였다. 클론 19-01-H04 구조체의 경우, 친화성의 개선 정도는 검정된 종과 pH에 따라서 20배 이하 ~ 300배까지에 이르렀다. 클론 23-13-A01 구조체의 경우, 약 3배라는 보통의 개선이 달성되었다(표 3 참조).
종간 교차반응성의 관점에서, 클론 19-01-H04는 인간 및 비인간 영장류 혈청 알부민에 대해 강한 친화성 결합을 보였던 한편, 설치류 SA와의 결합은 관찰되지 않았다. 클론 23-13-A01의 경우, 인간 및 비인간 영장류 SA에 대해 강한 친화성 결합이 관찰되었으며, 게다가 이 분자는 설치류 SA와는 감소한 친화성으로 결합하였다(표 4 참조).
2.2 항체 결합
HSA의
FcRn과의
결합
scFv 결합 HSA가 여전히 FcRn과 결합할 수 있는지를 확인하기 위해, pH 5.5에서 검정을 구성하였다. 이는, 항 HSA scFv 또는 이의 유도체가 HSA 및 FcRn간의 상호작용을 통해 HSA와 함께 재이용되는 것을 허용함에 있어 필요하다. HSA-부동화 칩을 사용하여 검정을 진행하였다: 1. 90nM scFv를 주입한 다음, 낮은 pH에서 상호작용을 측정하였다; 2. 90nM FcRn을 주입한 다음, 낮은 pH에서 상호작용을 측정하였다; 3. scFv 및 FcRn의 1:1 혼합물(각각 90nM씩)을 주입하여, 개별 주사시 결합 수준의 합이, 혼합물이 주입되었을 때의 결합 수준과 비슷한지 여부를 살펴보았다. 만일 scFv 결합 HSA가 더 이상 FcRn과 결합하지 않으면, 혼합물의 결합 수준은 scFv 단독일 때의 결합 수준과 동일할 것이다.
이 검정법을 이용함으로써, HSA는 클론 19-01-H04 및 23-13-A01의 scFv들에 의해 결합될 때 FcRn과 완전히 결합할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예
3: 단일 사슬
다이아바디
(
scDb
) 포맷의 생성
αHSA 도메인 특성을 추가로 특성규명함에 있어 바람직한 도메인을 다중 특이적 구조체에 통합하였다.
두 도메인에 대해, 단일 사슬 다이아바디 내 이중 특이적 구조체를 제조하였다. 이전에 기술된 바와 같이 단일 사슬 다이아바디(scDb) 포맷으로의 구조체 디자인을 수행하였다[Holliger et al., "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448]. 요약하면, 표 1에 나열한 바와 같은 가변 도메인을 VLA-S1-VHB-L1-VLB-S2-VHA 형태[단 S1 및 S2는 짧은 G4S 링커이고, L1은 긴 (G4S)4 링커임]로 배열하였다. αHSA 도메인 및 제2 항원에 대한 제2 특이성을 보유하도록 제조된 구조체를, 도메인 19-01-H04-sc02의 경우에는 PRO462라, 그리고 도메인 23-13-A01-sc02의 경우에는 PRO480이라 명명하였다.
뉴클레오티드 서열을 새로이 합성한 다음, 이.콜라이 발현에 대해 적응시킨 벡터(pET26b(+) 백본(Novagen)을 기반으로 함)에 클로닝하였다. 발현 구조체를 이.콜라이 균주 BL12(DE3)(Novagen)에 도입하여 형질전환을 진행한 다음, 출발 배양액인 2YT 배지에서 배양하였다(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual). 발현 배양액을 접종한 다음, 진탕 플라스크에서 항온처리하였다(37℃ 및 200 rpm). 일단 OD600nm 1에 도달하면, 여기에 IPT를 최종 농도 0.5 mM가 되도록 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 밤새도록 발현시키고 나서, 세포를 원심분리(4000 g)로 수득하였다. 봉입체를 제조하기 위해, 세포 펠릿을 IB 재현탁 완충제(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100) 중에 재현탁하였다. 세포 슬러리에 1 mM DTT, 0.1 mg/mL 리소자임, 10 mM루펩티드, 100 μM PMSF 및 1 μM 펩스타틴을 보충하였다. 세포를 얼음으로 냉각시키면서 초음파 균질화를 3주기 실행하여 용해하였다. 그 다음, DNAse 0.01 mg/mL를 첨가하고, 균질화물을 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 원심분리(15000 g, 4℃)에 의해 봉입체를 침강시켰다. IB를 IB 재현탁 완충제 중에 재현탁한 다음, 초음파처리로 균질화하고 나서, 또 다시 원심분리를 수행하였다. IB 재현탁 완충제로 세척 단계를 적어도 총 3회 수행하고 나서, IB 세척 완충제(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA)로 2회 세척한 결과, 최종 IB가 수득되었다.
단백질 리폴딩을 위해, 단리한 IB를 가용화 완충제(100 mM Tris/HCl pH 8.0, 6 M Gdn-HCl, 2 mM EDTA) 중에 습윤 IB 1 g당 5 mL 비율로 재현탁하였다. 실온에서 30분 동안 항온처리하여 가용화를 진행한 다음, DTT를 최종 농도 20 mM이 되도록 첨가한 후, 항온처리를 30분 더 계속 진행하였다. 가용화를 완료한 후, 10분 동안 원심분리(21500 g 및 4℃)하여 용액을 청징화하였다. 리폴딩 완충제(통상적으로 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 5.0 M 우레아, 5 mM 시스테인, 1 mM 시스틴) 중에 가용화된 단백질을 신속하게 희석시켜 최종 단백질 농도 0.3 g/L가 되도록함으로써 리폴딩을 수행하였다. 리폴딩 반응물을 보통 적어도 14시간 동안 항온처리하였다. 생성된 단백질 용액을 10분 동안 원심분리(8500 g 및 4℃)하여 청징화하였다. 리폴딩된 단백질을, Capto L 수지(GE Healthcare) 상 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 단리한 단량체 분획을 크기별 배제 HPLC로 분석하였고, 순도 확인을 위해서는 SDS-PAGE를, 그리고 단백질 함량 확인을 위해서는 UV/Vis 분광분석법을 수행하였다. 완충제를 투석에 의해 원산 완충제(50 mM 시트르산염-인산염, pH 6.4, 200 mM NaCl)로 교체하였다. 단백질 농도를, 안정성 분석에 의도되는 값으로 조정하였다.
실시예
4: 단일 사슬
다이아바디
(
scDb
) 구조체의 기능에 관한 특성규명
4.1 열
언폴딩
검정된 구조체의 열 언폴딩에 있어 전이의 중간점을, 본질적으로는 Niesen에 의해 기술된 바(Niesen et al., Nat Protoc. 2 (2007) 2212-21)와 같이 시차주사형광측정법(DSF)으로 확정하였다. DSF 검정법을 qPCR 기기(예컨대 MX3005p, Agilent Technologies) 내에서 수행하였다. 시료를, 5x SYPRO 오렌지를 최종 농도로 함유하는 완충제(시트르산염-인산염, pH 6.4, 0.25 M NaCl) 중에 희석하였다(총 부피 25 μL). 시료를 3회 측정한 다음, 온도를 프로그램에 따라 25℃에서 96℃로 승온시켰다. 형광 신호를 획득한 다음, 미가공 데이터를 GraphPad Prism(GraphPad Software Inc.)으로 분석하였다.
본 출원에 개시된 것들과 밀접하게 관련된 구조체들을 사용하여 얻은 데이터 중 대표적인 데이터를 표 5에 보였다.
4.2
스트레스 안정성 연구
4주간의 기간에 걸쳐 37℃에 보관하면서, 크기별 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)에 의해 올리고머화에 관하여, 그리고 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해서는 분해에 관하여 단백질을 분석하였다. 본 연구에 들어가기 앞서서, 시료들을 하나로 합하였으며, 이때를 출발 시점으로 확정하였다. Shodex KW-402.5-4F(Showa Denko) 상에서 시료들을 분리하고, 얻어진 크로마토그램을 평가함으로써 단량체 함량을 정량하였다. 단백질 단량체의 상대적 퍼센트를 산정하기 위해, 단량체가 보이는 피크의 면적을, 시료 매트릭스로 인해 보일 수 없는 피크들의 총 면적으로 나누었다. AnykD Mini-Protean TGX 겔(Bio-Rad Laboratories)을 사용하고, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색이 행해지는 SDS-PAGE 분석으로 단백질 분해를 평가하였다. 상이한 시점에서의 단백질 농도를, Nanoquant 평판이 장착된 Infinity 리더 M200 Pro(Tecan Group Ltd.)가 사용되는 UV-Vis 분광분석법으로 모니터링하였다.
SPR에 의한 항원 결합의 확인 결과와 아울러 PRO462 및 PRO480의 안정성 데이터는, 다중 특이적 항체 포맷 중 αHSA 도메인 각각의 안정성과 구조적 일체성을 보여준다(표 6 참조).
실시예
5: 구조체
PRO497(Fab-scFv)
2
의
생성
Fab-(scFv)2 포맷은 VL-CL 및 VH-CH1으로 이루어진 Fab 단편(단 불변 도메인 중 하나는 스캐폴드를 형성함)의 헤테로이량체성 조립을 이용하고, 가요성 링커를 통해 추가의 결합 도메인, 예컨대 scFv가 통합될 수 있는 다기능성 재조합 항체 유도체이다(Schoonjans, Willems et al. 2001) (Schoonjans, Willems et al. 2000). 이 분자는 포유류 숙주 세포, 예컨대 CHO-S 중에서 공동 발현될 수 있는데, 여기서는 결합 면역글로불린 샤페론(chaperon)이, 사슬 연장이 일어날 때조차, VL-CL 도메인 및 VH-CH1 도메인의 헤테로이량체화를 구동한다. 이러한 헤테로이량체는 안정적이고, 결합체 각각은 자체의 특이적 친화성을 보유한다. Fab-(scFv)2 분자의 CL 위치 및 CH1 위치에서의 ScFv 융합은 동등한 것으로 간주된다. 분자내 오로지 비천연 서열 단편만이 scFv 도메인 내 가변 도메인들을 결합시켜주는 펩티드 링커이고, Fab 불변 도메인을 가지는 scFv 도메인은 항원성도 아니고 면역원성도 아닌 것으로 간주되는 글리신-세린 중합체로 구성된다. PRO497은 CL 도메인에 융합된 항 HSA 특이적 scFv 도메인(23-13-A01-sc02) 및 CH1 도메인에 융합된 항 IL23R 특이적 scFv 도메인(14-11-D07-sc04)과 아울러, 항 CD3 특이적(09-24-H09-sc04) Fab 일부분을 포함하는 Fab-(scFv)2 분자이다. scFv 도메인 내부의 도메인들은 20개의 아미노산으로 이루어진 (G4S)4 링커를 통해 결합되어 있음과 동시에, 개별 scFv 도메인들은 15개 아미노산으로 이루어진 (G4S)3 펩티드 링커를 통해 Fab 단편에 융합되어 있다(Schoonjans, R., A. Willems, J. Grooten and N. Mertens (2000). "Efficient heterodimerization of recombinant bi- andtrispecific antibodies."Bioseparation 9(3): 179-183; 및 Schoonjans, R., A. Willems, S. Schoonooghe, W. Fiers, J. Grooten and N. Mertens (2000). "Fab chains as an efficient heterodimerization scaffold for the production of recombinant bispecific and trispecific antibody derivatives." J Immunol 165(12): 7050-7057).
실시예 6: 생체 내 PK 연구에 의한 구조체 PRO497 기능의 특성규명
마우스 내 PRO497의 약물 동태학
본 연구의 목적은, PRO497이 수컷 CD-1 마우스에 정맥내 투여된 후 이 PRO497의 약물 동태학적 특성을 확정하는 것이다. 12마리의 동물에게 PRO497 5 mg/kg씩을 정맥내 경로로 투여하였다. 투여 전과, 투여 후 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 96시간 및 144시간이 되었을 때 혈액 시료를 수집하였다. 혈액 수집 후, 혈청을 얻기 위해 전혈을 혈청 분리기 튜브에 넣은 후, 혈병이 생성되도록 하였다. 혈병 수축이 일어나는지에 대해 시료를 관찰한 다음, 원심분리하였다(2200 x g, 10분, 상온). 혈청 시료를 개별 폴리프로필렌 바이알에 옮긴 직후 드라이아이스에 올려놓아 -70±10℃에 보관하여 두었다.
혈청 중 PRO497 농도를 정량적 ELISA를 이용하여 분석함으로써, 마우스 혈청 중 PRO479를 검출하였다(도 2). 정맥내 투여 경로와 부합하는 비구획 접근법을 이용하는 Watson 약물 동태학 소프트웨어(Thermo Electron Corporation, Version No. 7.2.0.02)를 이용하여 약물동태학적 매개변수를 추산하였다.
실시예 7: 생체 내 PK 연구에 의한 구조체 PRO462 기능의 특성규명
사이노몰거스 원숭이에서 PRO462의 약물 동태학
PRO462를 수컷 사이노몰거스 원숭이에 정맥내 투여하여 이 PRO462의 약물 동태학적 특성을 확정하였다. 비 처녀 동물 총 3마리에게 PRO462를 목표 용량 수준 3 mg/kg으로 1회 투여하였다. 다음과 같은 시점, 즉 투여 전, 그리고 투여 후 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 36시간, 48시간, 72시간, 94시간, 144시간, 192시간, 240시간, 288시간, 336시간, 384시간, 432시간 및 504시간이 되었을 때 수집한 혈액 시료로부터 혈청을 제조하였다.
정량적 ELISA를 사용하여 혈청 중 PRO462의 농도를 분석하였다(도 1). 비구획 접근법을 이용하는 WinNonlin 약물 동태학적 소프트웨어(Phoenix 버전 1.4)를 사용하여 약물 동태학적 매개변수를 추산하였다.
본 발명은, 본원에 기술된 특정의 구현예들에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실상 본원에 기술된 본 발명의 변형예들 이외에도 다수의 변형예가 전술된 발명의 설명으로부터 당 업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형예들은 첨부된 특허청구의범위 안에 포함되도록 의도된다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허출원, 공보, 검정 방법, 문헌 및 기타 자료들은 각각의 특허법 하에서 가능한 정도로 본원에 참조로 인용되어 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Numab Innovation AG
<120> NOVEL ANTI-HSA ANTIBODIES
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<223> recombinant antibody sequence
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65 70 75 80
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Claims (15)
- 인간 혈청 알부민에 특이적이고,
(a) 가변 경쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 LFW1-LCDR1-LFW2-LCDR2-LFW3-LCDR3-LFW4을 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 LFW는 경쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 LCDR은 경쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 LCDR들은 함께 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 따르는 VL 서열로부터 취하여진 대응 LCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]; 그리고
(b) 가변 중쇄, 즉 N-말단에서 C-말단 방향으로 영역 HFW1-HCDR1-HFW2-HCDR2-HFW3-HCDR3-HFW4를 포함하는 가변 경쇄 [단 각각의 HFW는 중쇄 틀 영역을 지칭하고, 각각의 HCDR은 중쇄 상보성 결정 영역을 지칭하며, 상기 HCDR들은 함께 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 따르는 VH 서열로부터 취하여진 대응 HCDR들에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보임]
를 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편. - 제1항에 있어서, 상기 가변 경쇄는 Vκ1 경쇄이고/이거나 상기 가변 중쇄는 VH3 사슬인 항체 또는 이의 기능성 단편.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 가변 경쇄는 서열 번호 1 또는 서열 번호 3에 따른 VL 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이고/보이거나, 상기 가변 중쇄는 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 따른 VH 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 항체 또는 이의 기능성 단편.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 (i) 서열 번호 1에 따른 VL 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄와, 서열 번호 2에 따른 VH 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 VH 사슬; 또는 (ii) 서열 번호 3에 따른 VL 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 가변 경쇄와, 서열 번호 4에 따른 VH 서열에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 보이는 VH 사슬을 포함하는 항체 또는 이의 기능성 단편.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 기능성 단편은 하기 매개변수들 중 1개 이상에 의해 특징지어지는 항체 또는 이의 기능성 단편:
(i) 인간 혈청 알부민과의 결합에 대한 KD 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 50 nM 미만, 구체적으로 3 nM 미만, 더욱 구체적으로 1 nM 미만임;
(ii) pH 값 약 5.5 및 약 7.4 둘 다에서 인간 혈청 알부민과의 결합에 대한 KD 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 50 nM 미만, 구체적으로 3 nM 미만, 더욱 구체적으로 1 nM 미만임;
(iii) 비인간 영장류 및/또는 설치류 혈청 알부민과의 결합에 대한 KD 값이, 구체적으로 표면 플라스몬 공명법에 의해 측정될 때, 250 nM 미만, 구체적으로 100 nM 미만, 더욱 구체적으로 50 nM 미만임;
(iv) 항체 결합 HSA가 FcRn과 결합하는 능력은 보존됨;
(v) 시차주사형광측정법(DSF)에 의해 확정되는 바에 따르면, 구체적으로 시료들이 pH 값 3.5 내지 7.5 범위, 구체적으로 pH 6.4이고, 0.15 M ~ 0.25 M NaCl, 구체적으로 0.15 M NaCl, 더욱 구체적으로 0.25 M NaCl을 함유하는 인산염-시트르산염 완충제 중에 희석될 때, scDb 항체 포맷(단일 사슬 다이아바디 포맷) 또는 scFv 항체 포맷(단일 사슬 가변 단편 포맷)으로 발현될 때, 바람직하게 scFv 항체 포맷으로 발현될 때의 열 언폴딩 온도(Tm)의 평균 중간점은 적어도 60℃를 초과함; 그리고
(vi) 구체적으로 본 발명의 항체가 출발 농도 10 mg/ml로 존재할 때, 37℃ 및 28일 동안 스트레스 연구에서의 단량체 함량 감소율이 3% 미만, 구체적으로 감소율이 2% 미만임. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편과, 선택적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단.
- 제7항에 의한 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단을 포함하는 벡터 또는 벡터 집단.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 제조하기 위한 방법으로서, 제6항에 의한 핵산 서열 또는 핵산 서열 집단, 또는 제7항에 의한 벡터 또는 벡터 집단을 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
- (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편을 암호화하는 핵산 서열 1개 이상을 1개 이상의 단계에서 적어도 제2의 생물활성 도메인과, 선택적으로는 1개 이상의 추가 생물활성 도메인을 포함하는 다중 특이적 구조체에 클로닝하는 단계를 포함하는, 다중 특이적 구조체를 제조하는 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 제2 생물활성 도메인은 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 방법.
- (i) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편과; (ii) 제2 생물활성 도메인; 그리고 선택적으로 (iii) 1개 이상의 추가 생물활성 도메인을 포함하는 다중 특이적 폴리펩티드 구조체.
- 제12항에 있어서, 상기 제2 생물활성 도메인은 제2 항체 또는 이의 기능성 단편인 다중 특이적 폴리펩티드 구조체.
- 의약품으로 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 제6항에 의한 약학 조성물, 또는 제12항 또는 제13항에 의한 다중 특이적 폴리펩티드 구조체.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 의한 항체 또는 이의 기능성 단편, 또는 제6항에 의한 약학 조성물, 또는 제12항 또는 제13항에 의한 다중 특이적 폴리펩티드 구조체의, 의약품 제조에 있어서의 용도.
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