CN113817686B - 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2020105，能够分泌抗人血清白蛋白的单克隆抗体，单克隆抗体的腹水间接ELISA效价大于10^‑5，IAC纯化的纯度高达99.971％。利用本发明获得的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，可用于极微量白蛋白的检测、残留量白蛋白的检测、制备纯化亲和层析柱和免疫学检测试剂盒等，稳定性好，保质期长。

Description

一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体制备领域，具体地，是一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用。

背景技术

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子量约66.5KD。HSA于肝脏中合成，是血浆中含量最丰富的蛋白质(血浆中的HSA下文简称pHSA)，约占血浆总蛋白的60％。其主要功能是运输脂肪酸、氨基酸等营养物质，同时能够维持血液渗透压的平衡，稳定血浆内环境。临床上用于治疗休克、烧伤以及大出血导致的血液流失，同时也是国家的储备药物之一。一直以来HSA的生产是以人血液为原料通过低温乙醇法进行提取的，但是人血来源有限，且血液可能携带乙肝、艾滋等病毒，引发病毒传染的安全性问题。

DNA重组与合成技术的发展，使重组人血清白蛋白(rHSA)的生产和应用得到实现。以毕赤酵母作为蛋白表达系统，高密度发酵生产白蛋白，不仅可以避免原料紧张和病毒污染等问题，还可以实现大规模生产。HSA的临床使用剂量很大，每针剂通常达到10～25g，因此对重组白蛋白的纯度要求非常严格。通常以基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵所得的rHSA为原料，通过各种纯化方法将发酵液中的杂质一一去除。当rHSA纯度大于99％时，进一步的纯化操作异常艰难。免疫亲和层析(IAC)依靠抗原与抗体结合的特异性，能够准确捕获混合物中的目标蛋白，获得高纯度产物。

杂交瘤细胞是由脾细胞和骨髓瘤细胞融合而成，但是其基因表达不稳定，容易在传代培养和冻存中逐渐丢失染色体，导致抗体产生能力减弱或丧失(李莉等，抗人血白蛋白单克隆抗体的制备及其免疫金标试纸条的研制，中国卫生检验杂志，2007，017(011):2028-2029,2051.及余健等，牛血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定，微生物学免疫学进展，2007(01):32-36.)，因此急需一种能稳定生产HSA抗体的杂交瘤细胞。免疫亲和层析柱的制备和纯化技术虽已有报道(王迪等，莱克多巴胺免疫亲和柱的制备与应用研究，分析测试学报，2010(08):58-62.及徐燕等，去氢甲睾酮多克隆抗体免疫亲和柱的制备研究，中国食品学报，2011(07):201-205.)，但是其柱容量多为纳克级，已知最高柱容量的是草鱼生长激素单抗免疫亲和柱，柱容量为70μg/ml，且重复性和稳定性都不高，数据显示免疫亲和柱一般可使用3次，4℃只可存放三个月。柱容量、重复性和稳定性是免疫亲和层析柱存在的主要问题，严重影响免疫亲和层析的使用和推广。本领域急需一种具有较大柱容量，并可重复性和稳定性均较高的可除去HSA中杂质的层析柱。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为了克服现有杂交瘤细胞制备单克隆抗体中细胞和分泌的抗体稳定性低，亲和层析柱柱容量、重复性和稳定性低导致单克隆抗体纯度难以进一步提高的缺陷，提供一种人血清白蛋白单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及其应用，杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体在亲和层析柱中可以实现不正确空间结构的重组人血清白蛋白的去除，提高人血清白蛋白的纯度。

本发明的第一方面涉及一种可分泌抗人血清白蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2020105。

本发明的第二方面涉及上述第一方面的杂交瘤细胞株分泌的抗人血清白蛋白的单克隆抗体。

本发明的第三方面涉及上述第一方面的杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：

1)将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞，与用人血清白蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠的脾脏细胞融合，在选择培养基中进行杂交瘤细胞筛选；

2)将步骤1)中筛选出的阳性杂交瘤细胞在含FBS的基础培养基中进行筛选，获得稳定分泌抗人血清白蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

所述的选择培养基可为本领域常规，例如HAT培养基。

所述的基础培养基可为本领域常规，例如HAT培养基。

所述的步骤2)中的FBS的体积分数大于等于20％。

所述的步骤2)中的筛选的次数大于等于二次、小于等于六次。

本发明的第四方面涉及一种纯化HSA的免疫亲和层析方法，其基于本发明第二方面所述的单克隆抗体制备，包括以下步骤：

(1)将单克隆抗体与琼脂糖凝胶，优选CNBr-Sepharose 4B，偶联后装柱、封闭并洗涤，获得制备好的免疫亲和层析柱；

(2)平衡后，将含有人血清白蛋白的上样液上样至制备好的免疫亲和层析柱，洗涤并洗脱获得含高纯度目标蛋白的洗脱液；其中，所述人血清白蛋白例如血浆人血清白蛋白或重组人血清白蛋白；

(3)将获得的含高纯度目标蛋白的洗脱液用中和缓冲液调整pH为中性并浓缩即得。

在所述步骤(1)中，所述单克隆抗体优选用偶联缓冲液透析过夜；所述偶联缓冲液为0.1M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH 8.3；

和/或，所述装柱后，用偶联缓冲液洗去未偶联的单克隆抗体，并用封闭缓冲液封闭，所述偶联缓冲液的体积为5～10倍柱体积，所述封闭缓冲液的体积为5倍柱体积的0.1MTris-HCl，pH 8.0；

和/或，所述洗涤为用醋酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替洗涤填料，重复4～5次，然后用PBS缓冲液反复洗涤至填料为中性，其中所述醋酸缓冲液优选为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L醋酸缓冲液，pH 4.0，5倍柱体积，所述Tris-HCl缓冲液优选为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0，所述PBS缓冲液优选为10倍柱体积；

和/或，在步骤(2)中，所述上样液使用的上样缓冲液、平衡和洗涤使用的缓冲液为20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+0.1M NaCl，pH为7.5；所述洗脱使用的洗脱液为20mM甘氨酸-HCl，pH为2.5；

和/或，在步骤(3)中，所述中和缓冲液为3M Tris-HCl，pH为9.0。

本发明的第五方面涉及一种用于免疫学检测的试剂盒，包括如本发明第一方面所述的杂交瘤细胞株，或者如本发明第二方面所述的单克隆抗体；

优选地，所述试剂盒还包括检测板、酶标抗体、显色液和终止液。

所述的试剂盒可为本领域常规，例如极微量或残留量白蛋白检测试剂盒、尿微量白蛋白/尿肌酐检测试剂盒或糖化血清白蛋白检测试剂盒。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)通过小鼠杂交瘤技术筛选获得效价较高的杂交瘤细胞，其中7H5产生的抗人血来源白蛋白(pHSA)的单克隆抗体效价最高，将纯化的小鼠腹水中7H5杂交瘤细胞分泌的抗体与CNBr-Sepharose 4B偶联，应用于免疫亲和层析中去除重组人血清白蛋白中空间结构不正确的白蛋白，在优化的层析条件下可将重组白蛋白(rHSA)的纯度从99.6％提高到99.971％。

(2)通过优化IAC的上样pH和洗脱pH，获得了较高的柱容量和回收率，可将柱容量提高至101.47μg/ml，高于已报道的柱容量，且稳定性良好。

生物材料保藏信息

本发明的杂交瘤细胞系，于2020年6月10日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学邮编430072，保藏编号为CCTCCNO：C2020105，培养物名称为杂交瘤细胞株7H5。

附图说明

图1为本发明单克隆抗体制备流程示意图。

图2为实施例中杂交瘤细胞株相对亲和力测定示意图。

图3为实施例中抗HSA单抗纯化的SDS-PAGE电泳检测示意图。

图4为实施例中抗HSA单抗与pHSA的Western Blotting检测示意图。

图5为实施例中IAC层析上样pH优化SDS-PAGE电泳示意图。

图6为实施例中IAC层析洗脱pH优化SDS-PAGE电泳示意图。

图7为实施例中IAC层析中蛋白的Western Blotting检测示意图。

图8为实施例中IAC层析上样液的HPLC检测示意图。

图9为实施例中IAC层析洗脱液的HPLC检测示意图。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

1材料与方法

1.1药品与试剂

免疫用抗原：人血清白蛋白(pHSA)(中国食品药品检定研究院，280023-201501)

细胞系：骨髓瘤细胞SP2/0(上海图翎公司)；

实验动物：4只6～8周龄的雄性Balb/c小鼠(上海杰思捷实验动物有限公司，批号2018-0004)；

其他试剂：弗氏完全佐剂(SF550602)、弗氏不完全佐剂(SLBV6904)、PEG1500(货号：P7777-5g)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶(T)和次黄嘌呤(H)(Sigma公司)；羊抗鼠IgG-HRP(碧云天公司，A0216)；生长因子(北京安必奇生物科技有限公司，CDN-SF1)；FBS、BSA、Tris、Novel One Step Western Blot KitⅡ(货号：C500052-0010)、甘氨酸(上海生工)；PBS、DMEM、CNBr-Sepharose 4B(GE-healthcare)；ECL显色液(ThermoFisher)；BCA ProteinAssay Kit(南通柯侎克生物科技有限公司，PC0020-50T)；其余试剂均为国药试剂。

仪器：Synergy2型多功能酶标仪(美国Biotek)；色谱柱TSK gel SW3000XL(7.8mm*300mm，5μm)(日本TOSOH)；ProteinA-Sepharose 4B，(GE-healthcare)。

1.2方法

1.2.1人血清白蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

1.2.1.1免疫程序

如图1所示，免疫流程如表1所示，pHSA作为抗原与等量的弗氏佐剂充分乳化，对4只小鼠分别进行皮下多点注射，每只动物100μg抗原。初次免疫乳化使用弗氏完全佐剂(CFA)乳化，加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)，每次免疫间隔2周。第3次免疫一周后，眼眶取血并检测血清效价，若血清效价＞1:1000，则认为免疫成功，不需要继续加强免疫；否则要进行第三次加强免疫。用间接ELISA方法检测免疫小鼠的血清效价，确定最终与SP2/0细胞融合的小鼠脾细胞。收获脾细胞前3天对小鼠腹腔注射不加弗氏佐剂的抗原。

表1免疫接种时间表

1.2.1.2间接ELISA法测定抗体效价

将抗原pHSA用PBS缓冲液稀释至5μg/ml，按100μl/孔分别加入酶标板中，4℃包被过夜；用含3％BSA的PBST缓冲液37℃封闭2小时；将待测抗体样品10倍梯度稀释后，按100μl/孔分别加入酶标板37℃孵育2小时；酶标二抗为羊抗鼠IgG-HRP，稀释250倍后按100μl/孔分别加入酶标板37℃孵育50分钟(一抗、二抗均用含0.3％BSA的PBS缓冲液稀释)；TMB显色，在酶标仪上检测各孔在450nm处的吸光值(A₄₅₀)。阴性对照为空白小鼠血清，当样品A₄₅₀值大于阴性对照的2.1倍时判定为阳性。

1.2.1.3骨髓瘤细胞的准备

将骨髓瘤细胞从液氮中取出，于37℃水浴锅中快速解冻，并在1min内完成。1000rpm离心5min除去上清，重新加入新鲜的含FBS血清基础培养基。于37℃，5％CO₂培养箱中培养1～2周，使骨髓瘤细胞在融合前达到生长状态良好的对数增长期。

1.2.1.4细胞融合

将免疫后的小鼠处死，于超净台中取出脾脏滴加PBS缓冲液研磨，获得免疫B细胞。脾细胞与骨髓瘤细胞按4:1混合均匀，滴加50％PEG1500诱导细胞融合，铺板。细胞融合后在HAT培养基中进行多次筛选，获得与抗原具有高亲和力的单克隆细胞。

所述的HAT培养基中氨基蝶呤(A)为0.4μmol/L，胸腺嘧啶(T)为16μmol/L，次黄嘌呤(H)为100μmol/L。

1.2.5杂交瘤细胞的筛选

采用间接ELISA法检测融合细胞培养上清的效价，筛选阳性杂交瘤细胞。包被抗原pHSA浓度为5μg/ml，空白对照孔为PBS，阴性对照为HAT培养基，阳性对照为免疫后小鼠的血清。在酶标仪上，450nm处检测各孔的吸光值(A₄₅₀)，最终值减去空白对照孔，当样品A₄₅₀值大于阴性对照的2.1倍时判定为阳性。在含FBS血清基础培养基上多次筛选选出抗体生产能力较强且稳定的杂交瘤细胞。

所述的含FBS血清基础培养基中的FBS的体积分数为20％。

所述的筛选的次数等于或大于四次。

用5μg/ml pHSA包被酶标板，各抗体从100μg/ml开始以2倍系列稀释后添加，孵育后加入羊抗鼠IgG-HRP，经TMB显色，测定450nm处吸光值。以抗体浓度为横坐标，A₄₅₀为纵坐标作图。以各曲线上部接近平坦的A值为100％，查出A值为50％的抗体浓度，用来表示抗体的相对亲和力；对应浓度越低，抗体的相对亲和力越强。

1.2.2单克隆抗体的制备

1.2.2.1腹水的制备

腹水的制备流程如表2所示，小鼠注射杂交瘤细胞前先用弗氏不完全佐剂预刺激，促进腹腔内营养物质的分泌和聚集。将杂交瘤细胞扩增至所需个数，离心，小心洗涤，用无菌PBS缓冲液重悬后对小鼠进行腹腔注射。一周左右小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，1000rpm离心10min，小心地取出上清(待测样品)待用。采用间接ELISA法检测小鼠腹水效价，空白对照孔为PBS缓冲液，阴性对照为免疫前小鼠血清，阳性对照为免疫后小鼠血清(稀释梯度同待测腹水相同)，当样品A₄₅₀值大于阴性对照的2.1倍时判定为阳性。

表2腹水制备时间表

1.2.2.2单克隆抗体的纯化

收集的小鼠腹水使用Protein A亲和层析柱进行纯化。上样前腹水先离心除去细胞碎片和大的蛋白聚集物，用定性滤纸过滤，再经0.22μm微孔滤膜过滤，即可作为层析上样液。使用亲和层析A液(20mM KPB+0.15M NaCl，pH＝7.5)平衡Protein A柱，通过泵头将上样液上样到层析柱，平衡后，使用亲和层析B液(20mM KPB+0.15M NaCl，pH＝2.5)进行洗脱，收集富含抗体的洗脱液。洗脱液为酸性，应立即用中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)调整pH为中性，以防止抗体失活。

1.2.2.3单克隆抗体的特异性检测

采用Western Blotting鉴别抗体所识别的靶抗原及其分子量。采用12％分离胶和5％浓缩胶对两种不同来源的白蛋白(pHSA、rHSA)进行常规SDS-PAGE；NC膜转膜在200mA下电转70min完成，封闭处理；将膜与1:1000稀释的单抗孵育30～40min，洗涤，再与1:500稀释的羊抗鼠IgG-HRP孵育30～40min，洗涤；采用ECL法显色并拍摄。

1.2.2.4稳定性检测

对筛选的杂交瘤细胞7H5连续体外培养3个月以上，观察生长状态并制备腹水，采用间接ELISA法检测其抗体效价；将杂交瘤细胞于液氮中冻存7月以上，复苏后扩大培养并按照上述操作检测其产生的抗体效价。将纯化获得的单克隆抗体-20℃存放半年后，采用间接ELISA法检测其抗体效价。

1.2.3抗HSA单克隆抗体免疫亲和柱的制备

将纯化后的抗HSA单克隆抗体(以下简称单抗)与CNBr-Sepharose 4B偶联制备IAC柱。

参照CNBr-Sepharose 4B产品使用说明书并按实际情况稍作修改，步骤如下：

纯化后的单抗用偶联缓冲液(0.1M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH 8.3)透析过夜，并调整至所需浓度。准确称取冻干粉0.4mg，于10ml 1mM HCl溶液中充分溶胀20min。在砂芯漏斗中抽滤溶胀后的湿胶，用溶胀试剂洗涤3～5次。再用10倍体积的偶联缓冲液快速抽滤湿胶2次。洗涤后的湿胶约2ml，立即加入2ml含一定浓度的单抗溶液中，密封，于室温(或25℃)下温和振摇(120rpm)1h。偶联结束后，将填料转移至5ml柱管中，用5～10倍体积的偶联缓冲液洗去未偶联的单抗。洗涤后的填料转移至含5倍体积封闭缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH 8.0)的50ml离心管中，室温振摇2h，封闭未偶联位点。

用5倍体积的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4.0，含0.5mol/L NaCl)和0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.0，含0.5mol/L NaCl)交替洗涤填料，重复4～5次。然后用10倍体积的PBS缓冲液反复洗涤至填料为中性。装柱，用20％乙醇保存于4℃冰箱。保存得当，可使用十次左右。

1.2.4免疫亲和层析(IAC)

1.2.4.1免疫亲和层析上样和洗脱pH的优化及免疫亲和层析

分别配置pH为6.5和7.5的上样缓冲液(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+0.1M NaCl)，rHSA含量为0.2mg的上样液经透析后，上样到平衡好的IAC柱中，洗脱液为pH为3.0的20mM甘氨酸-HCl。收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳，确定最优上样pH值。

rHSA含量为0.2mg的上样液经上样缓冲液(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+0.1M NaCl，pH＝7.5)透析后，上样到平衡好的IAC柱，分别用pH为3.0和2.5的洗脱缓冲液(20mM甘氨酸-HCl)洗脱。收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳，确定最优洗脱pH值。

疏水层析洗脱液(富含rHSA)用IAC层析的A液(20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄+0.1M NaCl，pH＝7.5)透析，作为上样液。使用IAC层析的A液进行柱平衡后，通过泵头将上样液上样到层析柱。使用IAC层析B液(20mM甘氨酸-HCl，pH＝2.5)将目标蛋白洗脱下来，收集含高纯度目标蛋白的洗脱液并用中和缓冲液(3M Tris-HCl，pH＝9.0)调整pH为中性并浓缩。按照该亲和层析流程上样，与免疫亲和填料特异性结合的是各属性与pHSA完全一致的白蛋白，构象不正确或其他属性不一致的白蛋白则流穿出来。

1.2.4.2柱容量的测定

应用优化后的上样和洗脱条件，以0.5mg完全过饱和的HSA量过柱，收集洗脱液利用SDS-PAGE电泳计算洗脱液中HSA含量。

1.2.4.3IAC柱重复性的检测

稳定性用柱容量和回收率来衡量。通过对同一个IAC柱多次使用，检测柱容量的下降情况和回收率。

1.2.4.4IAC柱稳定性的检测

将制备好的IAC柱在4℃存放5个月后，取出检测其柱容量。

将IAC柱在4℃存放5个月，分别在第4月和第5月纯化同一批次rHSA，观察其稳定性。

1.2.5HPLC法检测白蛋白纯度

色谱柱为TSK gel SW3000XL(7.8mm*300mm，5μm)，流动相为50mM KPB+0.3M NaCl(pH 6.5)，经0.22μm滤膜过滤并超声脱气10～20分钟，待测样品经10000rpm、4℃离心10min以上方可走样检测；进样量20μl/针，每个样品进样2次，分析时长40min，检测波长215nm，柱温20℃；待测样品依次为IAC层析的上样液和洗脱液。

2结果分析

2.1免疫小鼠血清中抗体效价的测定

第二次加强免疫一周后，用ELISA法检测小鼠血清的抗体效价，检测结果如表3所示。结果表明4只小鼠(小鼠#1、小鼠#2、小鼠#3和小鼠#4)的血清在稀释十万倍后，结果均为阳性。血清稀释滴度大于1:1000，本次免疫较为成功，选择#1、#4小鼠进行后续的细胞融合。

表3免疫小鼠血清抗体效价检测结果

2.2阳性杂交瘤细胞株的筛选结果

将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后进行多次筛选，最终检测结果如图2和表4所示，其中杂交瘤细胞3H2、6C10、7H5和9G12产生的抗体A₄₅₀值和第二次加强免疫后眼眶取血的血清相当，7H5的抗体生产能力较强，相对亲和力顺次为7H5＞9G12＞3H2＞6C10，所以选择该细胞株作为后续抗体生产的杂交瘤细胞株。

表4阳性杂交瘤细胞株的筛选结果

2.3小鼠腹水抗体效价的测定

用ELISA法检测注射7H5细胞的小鼠腹水的抗体效价，结果如表5所示，腹水中的抗体效价大于10^-5。

表5腹水抗体效价检测结果

2.4腹水中抗体的纯化及检测

经纯化后浓缩的单抗，用BCA试剂盒检测蛋白含量为1.91mg/ml，纯化后抗体效价仍能达到10^-5。SDS-PAGE电泳结果如图3所示，原始腹水中的蛋白成分较为复杂，经纯化后得到的抗体经灰度扫描纯度为95％(图中：M为Marker；1为原始腹水中的单抗；2为纯化后单抗)。

如图4所示，Western Blotting检测显示人血浆来源白蛋白和重组白蛋白均能与抗HSA单克隆抗体反应(图中：M为Marker；1为重组人血清白蛋白；2为血浆来源人血清白蛋白)。

2.5稳定性检测

该杂交瘤细胞连续培养3个月后，生长状态良好，将其注射小鼠腹腔制备腹水，经间接ELISA法检测抗体效价大于6.25×10^-5，保持稳定；液氮冻存7个月后的杂交瘤细胞复苏后扩大培养并重复上述操作，检测可知抗体效价大于7.29×10^-5，保持稳定。

单克隆抗体在-20℃存放半年后取出，经间接ELISA法检测抗体效价大于6.25×10^-5，保持稳定。该稳定性检测结果高于现有技术中的杂交瘤细胞和单克隆抗体。

2.6免疫亲和层析

2.6.1免疫亲和层析上样和洗脱pH的优化及免疫亲和层析

按照1.2.3方法将纯化后的抗HSA单克隆抗体与CNBr-Sepharose 4B偶联制备免疫亲和柱，将0.2mg的HSA分别用不同pH值透析、上样，洗脱液SDS-PAGE电泳如图5所示(图中：M为Marker；1-5分别为100、300、500、700和900mg/L BSA标准品；6为上样pH为6.5时的洗脱液；7为上样pH为7.5时的洗脱液)；增加上样pH后，免疫亲和柱对HSA的结合能力增加，故选择pH为7.5作为后续的上样pH。

用不同pH的洗脱液进行洗脱，洗脱液SDS-PAGE电泳如图6所示(图中：M为Marker；1-5分别为100、300、500、700和900mg/L BSA标准品；6为洗脱pH是3.0时的洗脱液；7为洗脱pH是2.5时的洗脱液)，以3.0洗脱时洗脱不彻底，且花费时间较长，降低pH可将柱中结合的抗原快速彻底地洗脱下来，抗原与抗体结合较牢固，降低pH值才能将柱上结合的HSA完全洗脱下来，故选择pH为2.5作为后续的洗脱pH。因洗脱液pH较低，洗脱后应立即中和并透析洗脱产物，同时洗涤并再生IAC柱。

将经过蓝胶层析和疏水层析纯化的人血清白蛋白进行上样，收集富含目标蛋白的洗脱液。将洗脱液进行Western Blotting检测，免疫印迹检测显示，洗脱液中的抗体与NC膜上相对分子量为66.5KD的重组人血清白蛋白有特异性结合，如图7所示(图中：M为Marker；1为IAC层析上样液；2为IAC层析洗脱液；3为血浆来源人血清白蛋白)。

2.6.2柱容量的测定

IAC柱容量约为101.47μg/ml填料，该柱容量高于已报道的免疫亲和层析柱的柱容量70μg/ml。

2.6.3IAC柱重复性的检测

表6IAC柱重复性检测结果

使用次数	1	2	3	4	5	6
							柱容量μg	100.9	100.7	99.79	97.36	93.51	86.16
回收率％	99.44	99.24	98.34	95.95	92.16	84.91

如表6所示，IAC柱重复使用5次，柱容量下降为93.51μg，回收率仍高于90％。重复使用次数高于现有报道的IAC柱使用情况。

2.6.4IAC柱稳定性的检测

将其在4℃存放5个月后，柱容量约95.42μg，无明显降低，较稳定。

IAC柱在4℃存放4个月和5个月后，分别纯化同一批rHSA，纯化效果不变。该IAC柱的稳定性高于现有报道的IAC柱。

2.7HPLC检测白蛋白纯度

将经过免疫亲和层析洗脱的重组人血清白蛋白HPLC检测如图8和图9所示，结果显示经免疫亲和层析后去除了空间结构不正确的重组白蛋白，使重组白蛋白纯度在99.6％的基础上提高了0.371％。

Claims (11)

1.一种可分泌抗人血清白蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2020105。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗人血清白蛋白的单克隆抗体。

3.一种纯化人血清白蛋白的免疫亲和层析方法，其特征在于，所述的免疫亲和层析方法包括以下步骤：

(1)将如权利要求2所述的单克隆抗体与琼脂糖凝胶偶联后装柱、封闭并洗涤，获得制备好的免疫亲和层析柱；

(2)平衡后，将含有人血清白蛋白的上样液上样至制备好的免疫亲和层析柱，洗涤并洗脱获得含高纯度目标蛋白的洗脱液；

(3)将获得的含高纯度目标蛋白的洗脱液用中和缓冲液调整pH为中性并浓缩即得。

4.如权利要求3所述的免疫亲和层析方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶为CNBr-Sepharose 4B；所述人血清白蛋白为血浆人血清白蛋白或重组人血清白蛋白。

5.如权利要求3所述的免疫亲和层析方法，其特征在于，

在步骤(1)中，所述单克隆抗体用偶联缓冲液透析过夜；和/或，所述装柱后，用偶联缓冲液洗去未偶联的单克隆抗体，并用封闭缓冲液封闭，所述偶联缓冲液的体积为5～10倍柱体积，所述封闭缓冲液的体积为5倍柱体积的0.1M Tris-HCl，pH 8.0；和/或，所述洗涤为用醋酸缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替洗涤填料，重复4～5次，然后用PBS缓冲液反复洗涤至填料为中性；

和/或，在步骤(2)中，所述上样液使用的上样缓冲液、平衡和洗涤使用的缓冲液为20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄+0.1M NaCl，pH为7.5；所述洗脱使用的洗脱液为20mM甘氨酸-HCl，pH为2.5；

和/或，在步骤(3)中，所述中和缓冲液为3M Tris-HCl，pH为9.0。

6.如权利要求5所述的免疫亲和层析方法，其特征在于，所述偶联缓冲液为0.1MNaHCO₃，0.5M NaCl，pH 8.3；所述醋酸缓冲液为含0.5mol/LNaCl的0.1mol/L醋酸缓冲液，pH4.0，5倍柱体积，所述Tris-HCl缓冲液为含0.5mol/L NaCl的0.1mol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0；所述PBS缓冲液为10倍柱体积。

7.一种如权利要求3-6任一项所述的免疫亲和层析方法中制得的免疫亲和层析柱。

8.一种用于免疫学检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的杂交瘤细胞株，或者如权利要求2所述的单克隆抗体。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测板、酶标抗体、显色液和终止液。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为极微量或残留量白蛋白检测试剂盒、尿微量白蛋白/尿肌酐检测试剂盒或糖化血清白蛋白检测试剂盒。

11.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株或权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测人血清白蛋白的试剂中的应用。