CN104407148A - 一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒 - Google Patents

一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN104407148A
CN104407148A CN201410448416.XA CN201410448416A CN104407148A CN 104407148 A CN104407148 A CN 104407148A CN 201410448416 A CN201410448416 A CN 201410448416A CN 104407148 A CN104407148 A CN 104407148A
Authority
CN
China
Prior art keywords
detection kit
human albumin
human
hsa
detection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410448416.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN104407148B (zh
Inventor
齐智
史洁
陈培泽
齐晓龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201410448416.XA priority Critical patent/CN104407148B/zh
Publication of CN104407148A publication Critical patent/CN104407148A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104407148B publication Critical patent/CN104407148B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒。其特征在于，使用了一株杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体，能够特异性的识别人白蛋白。该检测试剂盒对人白蛋白检测灵敏度可以达到0.0012pg/ml（1.2fg/ml）的水平。据文献报道，目前最为灵敏的检测试剂盒，是美国Cloud-CloneCorp公司生产的高灵敏人白蛋白ELISA检测试剂盒，其检测灵敏度为48pg/ml。本发明的优点还在于，本发明涉及的检测试剂盒，可以用于人极微量尿液白蛋白或药物中残留白蛋白的检测，也可用于医药级基因重组人血清白蛋白的含量和纯度的直接检测。

Description

一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于检测人白蛋白的试剂盒。
背景技术
人白蛋白（human serum albumin, HSA）是人体血液中最为重要成份，含量达到42 g/L的水平。其主要功能是维持血液渗透压的平衡、运输人体营养物质、保持细胞中内含物的稳定性等多种功能。白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿是指尿中白蛋白含量超出健康人参考范围，但不能用常规的方法检测出这种微量的变化。微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白作为糖尿病、肾病、心血管疾病等慢性病的早期诊断指标，对尿中白蛋白定量检测具有重要的临床意义。因此，建立特异、灵敏的检测尿微量白蛋白的方法具有重要的应用价值。
目前，用于检测尿中白蛋白含量的方法主要是酶联免疫吸附实验（ELISA），该方法检测白蛋白要比溴甲酚紫（BCP）法和溴甲酚绿（BCG）（这两种方法的灵敏度为1 μg/ml）、蛋白质电泳法（0.5 μg/ml）的灵敏度和特异性要高的多，是目前检测尿中微量白蛋白早期诊断的主要方法。据报道，专利ZL2009201520440所述的一种人极微量白蛋白ELISA检测试剂盒，其灵敏度可以达到0.15 ng/ml（150 pg/ml）的水平。目前开发出的ELISA检测试剂盒中，最为灵敏的检测人白蛋白试剂盒是美国Cloud-Clone Corp公司生产的高敏人白蛋白检测试剂盒（货号HEB028Hu），其灵敏度可以达到0.048 ng/ml（48 pg/ml）的水平，其灵敏度是专利ZL2009201520440试剂盒的3.13倍，这对于尿中微量白蛋白的检测水平明显的提高了一个台阶。但是，在临床上，检测白蛋白灵敏度在pg级水平（48 pg/ml）仍然难于达到一些慢性疾病的早期检测要求，如妊娠子痫前期、2型糖尿病等疾病。在一些药物中，如人的细胞因子中残留的白蛋白的检测，要求其检测试剂盒具有更高的灵敏度。
另一方面，医药级基因重组人血清白蛋白纯度的检测，没有一种有效的办法对白蛋白的纯度直接进行检测，这是由于2个方面的因素：1）用蛋白质电泳法、HPLC法、目前开发最为灵敏的ELISA法，其最低检测限度只能达到48 pg/ml的水平，即检测灵敏度不够，达不到白蛋白纯度检测的要求；2）医药级人白蛋白要求检测纯度要求达到99.999999%的水平。因此，目前在检测医药级基因重组人血清白蛋白只能采用间接推算的办法：把总蛋白质含量定义为100%，而且假设医药级白蛋白药物中只含2种蛋白质，即人白蛋白和宿主细胞蛋白质，如果检测出宿主细胞蛋白质的含量，就可以推算出人白蛋白的含量，公式如下。
人白蛋白的含量=总蛋白质-宿主细胞蛋白质。
目前多数生产厂家采用Cygnus Technologies公司生产的Pichia pastoris Host Cell Proteins Kit检测试剂盒（简称PPC检测试剂盒，Cat. NO.: F140）检测宿主细胞蛋白质的含量。但是，显然这种计算方法是有缺陷的、不全面的，因为在纯化后的医药级基因重组人血清白蛋白中，理论上讲，应该含有三种成份，公式如下。
总蛋白质=人白蛋白+宿主细胞蛋白质+其他杂质蛋白质。
在这个公式中，其他杂质蛋白质包括：人白蛋白降解的小片段、来源于培养基的残留蛋白质和生产过程中外界污染的蛋白质。
按照美国药典（USP35 N27）的定义和日本三菱制药公司厂标的要求，医药级基因重组人血清白蛋白的含量要达到99.999999%。所以，直接检测白蛋白的含量是最佳的办法。本发明所涉及的人白蛋白检测试剂盒的灵敏度达到了0.0012 pg/ml的水平，比目前最为灵敏检测试剂盒的检测灵敏度（48 ng/ml，美国Cloud-Clone Corp公司生产）整整提高了4万倍。经过实验发现，本发明涉及的超级灵敏人白蛋白检测试剂盒，可以直接检测医药级基因重组人血清白蛋白的含量。
综上所述，本发明涉及一种人白蛋白超敏ELISA检测试剂盒具有很好的实用价值。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种人白蛋白超级灵敏的ELISA检测试剂盒。
本发明的目的是这样实现的：涉及到一种杂交瘤细胞株11A2，其特征在于：在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏编号：CGMCC NO.9243。保藏日期：2014年5月28日。保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明中，涉及到一种杂交瘤细胞株11A2的制备方法，其特征如下所述。
① 将免疫抗原人白蛋白（HSA, Sigma公司生产）与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射Bal B/c小鼠，每次注射体积为0.2 ml，HSA用量为50 μg/只，对小鼠实施基础免疫。
② 将免疫抗原HSA与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔2周腹腔注射1次，重复4次，每次注射体积为0.2 ml，HSA用量为40 μg/只。将HSA与浓度为0.9%的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射，HSA用量为100 μg/只。
③ 按常规技术收集免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按6:1的比例，用PEG3350进行融合；用HAT培养液选择培养。融合后7-14天，取细胞培养上清，采用间接ELISA方法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
④ 重复进行6次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株分泌HSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株11A2。
本发明中，涉及到一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，其特征在于是通过如下方法获得的。
① 通过细胞培养液获得：将杂交瘤细胞株11A2按1×106接种量接种到6 ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37oC含5% CO2的细胞培养箱中培养3-5天，然后将细胞培养液在500×g离心5分钟，收集上清液，通过Protein A或Protein G亲和层析纯化，获得单克隆抗体。
② 通过动物腹水获得：将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射上述①所得的细胞1-2×106个，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4oC下，8000×g离心20分钟，收集上清，通过Protein A或Protein G亲和层析纯化，获得单克隆抗体。
本发明中，涉及到一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，其特征在于是通过如下方法进行鉴定抗体亚型的。
① 抗体纯度鉴定：将单克隆抗体用12% SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定，如图1所示。通过Quantity-One（版本4.62）软件计算，抗体纯度为95%。
② 抗体亚型鉴定：采用小鼠抗体分型试剂盒（Sigma公司生产）鉴定抗体亚型，测定结果表明，抗体亚型为IgG1 κ型。
本发明中，一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于检测人体液中极微量人白蛋白、药物中残留的人白蛋白或医药级基因重组人血清白蛋白的含量，如下所述。
① 本发明涉及的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒检测灵敏度实验（即最低检测限度实验）。
采用抗原HSA直接包被96孔板（Corning公司生产），直接ELISA法测定杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）对HSA最低检测限度。
A、用HSA直接包被96孔板，浓度依次为1 ng/ml，100 pg/ml，10 pg/ml，1 pg/ml，100 fg/ml，10 fg/ml，1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中设有空白对照，即用PBS代替HSA；设有阴性对照，即用小牛血清白蛋白（BSA），浓度为50 mg/ml。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体（Sigma公司生产）为阳性对照。4oC包被过夜。
B、用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）于37oC封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。依次加入mAb 11A2抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1）、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP），在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。加入TMB显色液后，用1 N硫酸终止反应，最后在酶标仪450nm比色。结果表明（图2），本发明涉及的一种检测试剂盒，最低检测限（灵敏度）可以达到0.0012 pg/ml（1.2 fg/ml HSA）的水平。
② 用本发明涉及的试剂盒检测人体液中极微量白蛋白或人细胞因子等药物中残留白蛋白的含量检测。
采用两种线路（线路1或线路2）实现的。
线路1：采用商业化的人血清白蛋白（HSA）单克隆抗体（Sigma公司生产）包被ELISA检测用96孔板。用3%脱脂奶粉封闭。加入检测样品为人尿样（微量HSA）或人细胞因子溶液（残留HSA）。然后加入本发明涉及到的一种检测抗体mAb 11A2，浓度为0.5 μg/ml。再依此加入生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1）、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）。然后用TMB显色和硫酸终止反应，在450 nm的酶标仪上读数。根据不同浓度对应不同的OD值，绘制HSA标准曲线。结果显示，该微量检测试剂盒可以检测到经过稀释后的尿液HSA的含量为1.4 fg/ml；人细胞因子溶液中HSA的残留量为2.6 fg/ml。
线路2：采用商业化的人血清白蛋白（HSA）单克隆抗体（Sigma公司生产）包被ELISA检测用96孔板。用3%脱脂奶粉封闭。加入检测样品为人尿样（微量HSA）或人细胞因子溶液（残留HSA）。然后加入本发明涉及到的一种生物素化的抗体mAb 11A2（Biotin-mAb 11A2），浓度为0.5 μg/ml。再依此加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）。然后用TMB显色和1N 硫酸终止反应，在450 nm的酶标仪上读数。结果显示，该微量检测试剂盒可以检测到经过稀释后的尿液HSA的含量为1.9 fg/ml；人细胞因子溶液中HSA的残留量为3.1 fg/ml。
③ 医药级基因重组人血清白蛋白的含量检测。
本发明是通过如下方法实现的。
医药级基因重组人血清白蛋白样品购于日本三菱制药公司（Medway®，25 g包装）。将25 g白蛋白溶于注射用水中，充分溶解。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体1（Sigma公司生产）包被ELISA用96孔板（Corning公司生产）。用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）封闭96孔板。然后加入待检测的样品，即医药级基因重组人血清白蛋白样品。用不同浓度的HSA做蛋白质标准曲线。检测中设有空白对照、阴性对照和阳性对照。依次加入本发明涉及的mAb 11A2抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1）、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）。最后加入TMB显色，用硫酸终止反应，在酶标仪450 nm读数。结果显示，该医药级基因重组人血清白蛋白的含量为99.9999995%。
附图说明
图1：杂交瘤细胞株11A2产生的特异性单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE电泳图。1表示低分子量蛋白质标准；2为单克隆抗体（不加还原剂DTT，也不加热煮沸）；3为单克隆抗体在还原剂DTT的存在下，煮沸10分钟后，单克隆抗体分成了两个大小的片段。
图2：本发明涉及的一种人白蛋白超敏ELISA检测试剂盒的灵敏度（最低限度的检测值）实验。图中横坐标表示不同的浓度的HSA。其中，1是阳性对照；2是阴性对照；3是空白对照。4-12表示不同浓度的HSA。4是1 ng/ml；5是100 pg/ml；6是10 pg/ml；7是1 pg/ml；8是100 fg/ml；9是10 fg/ml；10是1 fg/ml；11是0.1 fg/ml和12是0.01 fg/ml。
具体实施方式
实施例 1 杂交瘤细胞株的建立。
一、材料与试剂。
1、材料：Bal B/c小鼠，6-8周龄，雌性。购自北京医科大学动物中心。Sp2/0-Ag14骨髓瘤细胞购自美国ATCC。人白蛋白（HSA，用做免疫原）购自Sigma公司。
2、试剂：RPMI-1640、胎牛血清、双抗（青霉素和链霉素）、DMEM、HAT和HT培养液购自Invitrogen公司。弗氏完全、不完全佐剂、石油醚、PEG3350、HRP-羊抗鼠抗体购自Sigma公司。其他试剂为分析纯，均购自国药集团公司。
二、杂交瘤细胞株的建立。
1、动物免疫：基础免疫是将免疫原HSA与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射Bal B/c小鼠。每只每次注射体积为0.2 ml，HSA的用量为50 μg/只。加强免疫是将免疫抗原HSA与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔2周腹腔注射1次，重复4次，每次注射体积为0.2 ml，HSA用量为40 μg/只。在进行细胞融合前3天，将免疫原HSA与浓度为0.9%的生理盐水混合，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射，HSA用量为100 μg/只。
2、杂交瘤细胞的制备。
① Sp2/0骨髓瘤细胞的准备：选择生长状态良好，浑圆透亮，排列整齐的细胞，用培养液洗涤一次后，用10 ml培养液将Sp2/0骨髓瘤细胞轻轻吹下。
② 脾细胞的准备：取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒小鼠体表5分钟，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。无菌打开腹腔取出脾脏，用DMEM培养液洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM培养液的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。
③ 饲养细胞的制备：取一只健康的小鼠，摘眼球采血，颈脱臼处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10 ml注射器，12号针头，注射5-10 ml HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。
④ 细胞融合：将上述制备的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50 ml的带盖的无菌离心管中，500×g离心5分钟，上清要充分吸净，以免影响PEG3350的作用。将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，使两种细胞充分混匀。用1 ml吸管将预热的PEG3350在60秒内缓慢加到融合管中，轻轻摇匀，立即滴加37oC预热的DMEM，使PEG3350失去作用。加入5 ml的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50 ml。分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37oC，5% CO2细胞培养箱内培养。5天后用HAT培养基换出一半培养基。融合后7-14天，观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清，采用间接ELISA法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
⑤ 杂交瘤细胞株的筛选：经过上述6次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为11A2，并于2014年5月28日在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCC NO.9243。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
三、杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体的效价测定。
将11A2细胞在含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到20代后进行单克隆抗体测定。
① 细胞培养液上清效价测定：将20代细胞按1×106接种量接种到6 ml含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在37oC含5% CO2细胞培养箱中培养3-5天，然后将细胞培养液在500×g离心5分钟，收集上清，用间接ELISA法测定上清中单克隆抗体效价，结果表明上清效价为1:10,000-1:80,000。
② 小鼠腹水效价测定：将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射上述①所得的细胞1-2×106个，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4oC下，8000×g离心20分钟，收集上清。用间接ELISA法测定上清中单克隆抗体，效价为1:1×105-1:4×105。
四、杂交瘤细胞株的传代培养。
将细胞株11A2在含有20%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到90代后，细胞株11A2仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10,000-1:80,000的水平。可见，本发明所得的细胞株11A2能够稳定传代，可以持续、稳定产生抗HSA的单克隆抗体。
实施例 2 应用细胞株 11A2 制备抗 HSA 的单克隆抗体。
一、单克隆抗体的制备。
将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射1-2×106个杂交瘤11A2细胞，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4oC下，8000×g离心20分钟，收集上清。然后，用nProtein A Sepharose 4 Fast Flow填料（GE Healthcare公司生产）纯化腹水上清。弃掉流穿液和冲洗液，然后用甘氨酸-HCl，pH3.0洗脱液洗脱。收集洗脱液，用Tris-HCl，1M，pH9.0缓冲液中和至pH7.0，最后得到抗HSA的单克隆抗体（mAb 11A2）。
二、单克隆抗体mAb 11A2的鉴定。
1、抗体纯度鉴定：用12%SDS-PAGE电泳鉴定mAb 11A2的纯度。电泳图如图1所示，1表示低分子量蛋白质标准；2为单克隆抗体（不加还原剂DTT，也不加热煮沸）；3为单克隆抗体在还原剂DTT的存在下，煮沸10分钟后，单克隆抗体分成了两个大小的片段。电泳凝胶照片通过Quantity-One（版本4.62；BioRad公司）软件计算，单克隆抗体mAb 11A2的纯度为95%。
2、抗体亚型鉴定：采用小鼠抗体分型试剂盒（Sigma公司生产）鉴定抗体亚型，具体操作参照厂家提供的说明书进行。测定结果表明，抗体亚型为IgG1 κ型。
3、抗体与抗原的灵敏度和特异性鉴定：采用抗原HSA直接包被96孔板（Corning公司生产），直接ELISA法测定单克隆抗体mAb 11A2对HSA的最低检测限度。本实验重复3次，每个样品有3个复孔。具体方法如下所述。
① 用HSA直接包被96孔板，浓度依次为1 ng/ml，100 pg/ml，10 pg/ml，1 pg/ml，100 fg/ml，10 fg/ml，1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中设有空白对照，即用PBS代替HSA；设有阴性对照，即用小牛血清白蛋白（BSA），浓度为50 mg/ml。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体（Sigma公司生产）为阳性对照。4oC包被过夜。
② 用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）于37oC封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。加入浓度为0.5 μg/ml的mAb 11A2抗体，在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。然后，加入生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1, 1:50,000稀释），在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。再加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP, 1:5,000稀释），在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
③ 加入100 μl TMB显色，用1 N硫酸终止反应，最后在酶标仪450 nm比色。
结果判断标准采用：P／N值（阳性孔OD值／阴性孔OD值）大于2.1为阳性；P／N值小于或等于2.1为阴性。
根据以上结果判断的标准和进一步数据分析显示（图2），杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）对抗原HSA识别的灵敏度和特异性可以达到0.0012 pg/ml（1.2 fg/ml HSA）的水平，而与小牛血清白蛋白（BSA）没有任何反应。可见，mAb 11A2识别HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。
实施例 3 人白蛋白超级灵敏 ELISA 检测试剂盒（线路 1 ）。
由于本发明基于所述的细胞株11A2产生的单克隆抗体（mAb 11A2）对抗原HSA具有超高灵敏度和超强的特异性，可应用于检测极其微量或残留的HSA的含量。具体方法叙述如下。
1、检测试剂盒的具体组成。
① 包被抗体：商业化的人血清白蛋白（HSA）单克隆抗体1和2（Sigma公司生产），抗体浓度为1 μg/ml。
② 检测样品：人尿样（微量HSA）或人细胞因子溶液（残留HSA）。
③ 检测抗体：本发明所述的一种mAb 11A2单克隆抗体，浓度为0.5 μg/ml。
④ 底物：四甲基联苯胺（TMB）：100 ml/瓶。
⑤ 封闭液：3%脱脂奶粉。
⑥ TBS缓冲液：Tween-20为0.05%，Na2HPO4和NaH2PO4缓冲液，pH7.4， 20 mM。
⑦ 生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1）：1:50,000稀释。Thermo Fisher公司生产。
⑧ 链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）：1:5,000稀释。Thermo Fisher公司生产。
2、检测试剂盒的检测方法。
① 用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体1（Sigma公司生产）包被96孔板（Corning公司生产）。包被量为1 µg/ml。4oC包被过夜。
② 用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）于37oC封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。
③ 加入待检测的样品，人尿液或人细胞因子溶液用0.9%生理盐水稀释，上样量为100 µl。用不同浓度的HSA做蛋白质标准曲线，分别是1 ng/ml，100 pg/ml，10 pg/ml，1 pg/ml，100 fg/ml，10 fg/ml，1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中空白对照：用PBS代替HSA；阴性对照：用小牛血清白蛋白（BSA），浓度为50 mg/ml；阳性对照：商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2（Sigma公司生产）。37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
④ 加入浓度为0.5 μg/ml的mAb 11A2抗体在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
⑤ 加入生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1），在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
⑥ 加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP），在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
⑦ 加入100 μl TMB显色，用1 N硫酸终止反应，最后在酶标仪450 nm比色。
本实验重复3次，每个样品有3个复孔。结果判断标准采用：P／N值（阳性孔OD值／阴性孔OD值）大于2.1为阳性；P／N值小于或等于2.1为阴性。根据不同浓度对应不同的OD值，绘制HSA标准曲线。
根据以上结果判断标准、HSA标准曲线，结果显示，该微量检测试剂盒可以检测到经过稀释后的尿液HSA的含量为1.4 fg/ml；人细胞因子溶液中HSA的残留量为2.6 fg/ml。
实施例 4 人白蛋白超级灵敏 ELISA 检测试剂盒（线路 2 ）。
1、检测试剂盒的具体组成。
① 包被抗体：商业化的人血清白蛋白（HSA）单克隆抗体1和2（Sigma公司生产），抗体浓度为1 μg/ml。
② 检测样品：人尿样（微量HSA）或人细胞因子溶液（残留HSA）。
③ 生物素标记的检测抗体：本发明所述的一种mAb 11A2单克隆抗体，用生物素标记（Biotin-mAb 11A2），浓度为0.5 μg/ml。
④ 底物：四甲基联苯胺（TMB）：100 ml/瓶。
⑤ 封闭液：3%脱脂奶粉。
⑥ TBS缓冲液：Tween-20为0.05%，N2HPO4和NaH2PO4缓冲液，pH7.4， 20 mM。
⑦链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）：1:5,000稀释。Thermo Fisher公司生产。
2、检测试剂盒的检测方法。
① 用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体1（Sigma公司生产）包被96孔板（Corning公司生产）。包被量为1 µg/ml。4oC包被过夜。
② 用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）于37oC封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。
③ 加入待检测的样品，人尿液或人细胞因子溶液用0.9%生理盐水稀释，上样量为100 µl。用不同浓度的HSA做蛋白质标准曲线，分别是1 ng/ml，100 pg/ml，10 pg/ml，1 pg/ml，100 fg/ml，10 fg/ml，1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中空白对照：用PBS代替HSA；阴性对照：用小牛血清白蛋白（BSA），浓度为50 mg/ml；阳性对照：商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2（用Biotin标记，Sigma公司生产）。37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
④ 加入浓度为0.5 μg/ml的Biotin-mAb 11A2抗体，在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
⑤ 加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP），在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
⑥ 加入100 μl TMB显色，用1 N硫酸终止反应，最后在酶标仪450 nm比色。
本实验重复3次，每个样品有3个复孔。结果判断标准采用：P／N值（阳性孔OD值／阴性孔OD值）大于2.1为阳性；P／N值小于或等于2.1为阴性。根据不同浓度对应不同的OD值，绘制HSA标准曲线。
根据以上结果判断标准、HSA标准曲线，结果显示，该微量检测试剂盒可以检测到经过稀释后的尿液HSA的含量为1.9 fg/ml；人细胞因子溶液中HSA的残留量为3.1 fg/ml。
实施例 5 直接检测医药级基因重组人血清白蛋白的含量。
一、实验目的：采用本发明涉及的一种人白蛋白超敏ELISA检测试剂盒与Cygnus Technologies公司生产的Pichia pastoris Host Cell Proteins Kit（简称PPC检测试剂盒）比较实验。以上两者的区别如下所述。
1、本发明涉及的一种检测试剂盒：直接检测白蛋白的含量。
2、PPC检测试剂盒：先检测出宿主细胞蛋白质的含量，然后通过公式：白蛋白的含量=总蛋白质-宿主细胞蛋白质。因此，该试剂盒采用间接推算的办法检测白蛋白的含量。宿主细胞是指用于高效表达基因重组人血清白蛋白的巴斯德毕赤酵母细胞。该细胞在表达基因重组人血清白蛋白的同时，也表达一些宿主细胞蛋白质（包括酶蛋白），以帮助完成宿主细胞的初级代谢和次级代谢，但这些宿主细胞蛋白质对人体是有害的，容易引起人体的过敏反应。所以，美国药典和日本三菱制药公司严格控制宿主细胞蛋白质在医药级基因重组人血清白蛋白中的含量。
二、实验方法。
（一）本发明所涉及的一种试剂盒直接进行人白蛋白含量检测。
1、材料和试剂。
（1）材料：医药级基因重组人血清白蛋白购于日本三菱制药公司（Medway®，25 g包装）。将25 g 白蛋白溶于注射用水中，充分溶解。
（2）ELISA检测试剂。
① 包被抗体：商业化的人血清白蛋白（HSA）单克隆抗体1和2（Sigma公司生产），抗体浓度为1 μg/ml。
② 检测样品：医药级基因重组人血清白蛋白溶液，检测前稀释。
③ 检测抗体：本发明所述的一种mAb 11A2单克隆抗体，浓度为0.5 μg/ml。
④ 底物：四甲基联苯胺（TMB）：100 ml/瓶。
⑤ 封闭液：3%脱脂奶粉。
⑥ TBS缓冲液：Tween-20为0.05%，N2HPO4和NaH2PO4缓冲液，pH7.4， 20 mM。
⑦ 生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1）：1:50,000稀释。Thermo Fisher公司生产。
⑧ 链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP）：1:5,000稀释。Thermo Fisher公司生产。
2、方法。
① 用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体1（Sigma公司生产）包被96孔板（Corning公司生产）。包被量为1 µg/ml。4oC包被过夜。
② 用3%脱脂奶粉（Non-fat milk）于37oC封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。
③ 加入待检测的样品，医药级基因重组人血清白蛋白样品，上样量为100 µl。用不同浓度的HSA做蛋白质标准曲线，分别是1 ng/ml，100 pg/ml，10 pg/ml，1 pg/ml，100 fg/ml，10 fg/ml，1 fg/ml、0.1 fg/ml和0.01 fg/ml。检测中空白对照：用PBS代替HSA；阴性对照：用小牛血清白蛋白（BSA），浓度为50 mg/ml；阳性对照：商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2（Sigma公司生产）。37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
④ 加入浓度为0.5 μg/ml的mAb 11A2抗体在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
⑤ 加入生物素标记的羊抗鼠抗体（Biotin-Goat anti-mouse IgG1），在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
⑥ 加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶（Avidin-HRP），在37oC培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
⑦ 加入100 μl TMB显色，用1 N硫酸终止反应，最后在酶标仪450 nm比色。
本实验重复3次，每个样品有3个复孔。结果判断标准采用：P／N值（阳性孔OD值／阴性孔OD值）大于2.1为阳性；P／N值小于或等于2.1为阴性。根据不同浓度对应不同的OD值，绘制HSA标准曲线。结果显示，该医药级基因重组人血清白蛋白的含量为99.9999995%。
（二）PPC检测试剂盒进行检测。
采用Cygnus Technologies公司生产的PPC检测试剂盒（Cat. NO.: F140）。该检测试剂盒的灵敏度为0.03 ng/250 mg HSA（要求为1 ng/250 mg HSA），达到了检测要求。
具体方法：将该检测试剂盒从4oC冰箱取出，放置与室温一致。打开试剂盒，取出ELISA 96孔平板，取25 µl PPC标准品、对照和检测样品分别加入到样品孔中，再分别加入100 µl anti-P. pastoris: HRP （F141），盖上平板盖子，在室温下（24±4oC）摇床培养（转速180 rpm）3个小时。弃掉每个孔的内容物，并倒置过来，在厚纸巾上用力拍打，并用350 µl 1×Wash Solution（20×Wash Concentration）冲洗4次，小心吸掉每个孔的残留液。加入100 µl TMB substrate（F005），在室温下静置30分钟，加入100 µl Stop Solution（F006）。然后在450/650nm ELISA读板机上读取数据。经过计算，结果显示，PPC检测试剂盒检测的医药级人血清白蛋白样品中宿主细胞蛋白质的含量为5×10-8 %。
三、结果比较和分析。
PPC试剂盒检测的宿主细胞蛋白质的含量为5×10-8 %。按照公式：白蛋白含量=总蛋白质-宿主细胞蛋白质的含量。即：白蛋白的含量（%）=100%-5×10-8 %=99.99999995%。而本发明涉及的检测试剂盒的检测结果是：白蛋白的含量是99.9999995%。由此可见，PPC检测试剂盒把白蛋白的纯度计算的过高（白蛋白的纯度提高了一个数量级），而没有把其他杂质计算进去。根据以上两者的检测结果，推算出其他杂质蛋白质的含量如下所述。
数据一：白蛋白的含量（%）=99.9999995%（按照本发明所述的检测试剂盒）。
公式一：总蛋白质含量=白蛋白+宿主细胞蛋白质+其他杂质蛋白质（理论上）。
数据二：宿主细胞蛋白质含量（%）=5×10-8 %（按照PPC检测试剂盒）。
公式二：其他杂质蛋白质含量（%）=总蛋白质-白蛋白-宿主细胞蛋白质。
计算，其他杂质蛋白质含量（%）=100 %-99.9999995 %-5×10-8 %=4.5×10-9 %。
因此，在病人每次用量为25 g白蛋白/100 ml注射液中，摄入的总其他杂质蛋白质含量是112.5 pg。
可见，日本三菱制药公司生产的医药级基因重组人血清白蛋白注射液中，不仅含有宿主细胞蛋白质，也含有112.5 pg的其他杂质蛋白质，该含量的杂质蛋白质可能对临床病人构成潜在的风险，完全依赖于这些杂质蛋白质的性质、构象和人体的免疫响应等因素，也有可能因人而异。
四、结论。
① 本发明涉及的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒，可以直接的检测到医药级基因重组人血清白蛋白的含量。
② PPC检测试剂盒可以检测到宿主细胞蛋白质的含量，进而推算出白蛋白的含量。这样的推算是不准确的，因为没有考虑到其他杂质蛋白质的含量。
③ 如果采用本发明涉及的检测试剂盒和PPC检测试剂盒联合使用，则可以准确的计算出其他杂质蛋白质的含量，这对于临床上病人用药的安全性提供了重要的参考价值和警示作用。
④ 本发明涉及的检测试剂盒弥补了医药级基因重组白蛋白在纯度检测上的缺陷，在医药级基因重组白蛋白的生产质量控制上提供了可靠的检测手段。

Claims (8)

1.一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒，其特征在于，使用了一种来源于杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，该单克隆抗体对人白蛋白具有超强特异性和超高的灵敏度。
2.根据权利要求1所述的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒，其特征在于，使用的单克隆抗体是由一种杂交瘤细胞株11A2产生的，该细胞株11A2在中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，其保藏编号为CGMCC NO. 9243。
3.根据权利要求1所述的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒，其特征在于，对人白蛋白的灵敏度可以达到0.0012 pg/ml（1.2 fg/ml）的水平，即最低检测限可达到0.0012 pg/ml（1.2 fg/ml）的水平。
4.根据权利要求1所述的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒具有多种应用。
5.根据权利要求4所述的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒具有多种应用，其特征在于，可以检测人体液中极微量白蛋白的含量。
6.根据权利要求4所述的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒具有多种应用，其特征在于，可以检测人细胞因子、激素等药物中残留的极其微量的人白蛋白。
7.根据权利要求4所述的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒具有多种应用，其特征在于，可以检测医药级基因重组人血清白蛋白的含量和纯度。
8.根据权利要求1所述的一种人白蛋白超级灵敏ELISA检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒具有工业化生产的实用价值。
CN201410448416.XA 2014-09-04 2014-09-04 一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒 Active CN104407148B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410448416.XA CN104407148B (zh) 2014-09-04 2014-09-04 一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410448416.XA CN104407148B (zh) 2014-09-04 2014-09-04 一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104407148A true CN104407148A (zh) 2015-03-11
CN104407148B CN104407148B (zh) 2016-08-24

Family

ID=52644794

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410448416.XA Active CN104407148B (zh) 2014-09-04 2014-09-04 一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104407148B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105273079A (zh) * 2015-11-26 2016-01-27 张癸荣 人血白蛋白优势抗原表位的筛选及应用
CN112876562A (zh) * 2019-11-30 2021-06-01 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗人血清白蛋白抗体及其应用
CN113817686A (zh) * 2020-06-18 2021-12-21 上海医药工业研究院 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60239662A (ja) * 1984-05-15 1985-11-28 Raifu Technol Kenkyusho 免疫センサー及びその作成方法
WO1998040469A1 (en) * 1997-03-13 1998-09-17 Cardiac Crc Nominees Pty. Ltd. Haemocompatible surfaces
CN201408194Y (zh) * 2009-04-23 2010-02-17 武汉优尔生科技股份有限公司 人极微量白蛋白elisa检测试剂盒
CN101666803A (zh) * 2009-09-17 2010-03-10 北京市药品检验所 一种鉴别人血白蛋白药品真伪的方法
CN102539786A (zh) * 2011-12-31 2012-07-04 上海凯创生物技术有限公司 微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒及其制备工艺
CN103163301A (zh) * 2011-12-09 2013-06-19 中山大学达安基因股份有限公司 一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的人血清白蛋白(hsa)定量检测试剂盒
CN103923211A (zh) * 2014-05-08 2014-07-16 齐智 一种医药级重组人血清白蛋白的纯化方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60239662A (ja) * 1984-05-15 1985-11-28 Raifu Technol Kenkyusho 免疫センサー及びその作成方法
WO1998040469A1 (en) * 1997-03-13 1998-09-17 Cardiac Crc Nominees Pty. Ltd. Haemocompatible surfaces
CN201408194Y (zh) * 2009-04-23 2010-02-17 武汉优尔生科技股份有限公司 人极微量白蛋白elisa检测试剂盒
CN101666803A (zh) * 2009-09-17 2010-03-10 北京市药品检验所 一种鉴别人血白蛋白药品真伪的方法
CN103163301A (zh) * 2011-12-09 2013-06-19 中山大学达安基因股份有限公司 一种基于时间分辨荧光免疫分析技术的人血清白蛋白(hsa)定量检测试剂盒
CN102539786A (zh) * 2011-12-31 2012-07-04 上海凯创生物技术有限公司 微量尿白蛋白胶体金检测试剂盒及其制备工艺
CN103923211A (zh) * 2014-05-08 2014-07-16 齐智 一种医药级重组人血清白蛋白的纯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. OMIDFAR 等: "Production and Characterization of Monoclonal Antibody Against Human Serum Albumin", 《HYBRIDOMA》, vol. 26, no. 4, 31 December 2007 (2007-12-31) *
马政辉等: "人血清白蛋白单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用", 《中国输血杂志》, vol. 23, no. 5, 31 May 2010 (2010-05-31) *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105273079A (zh) * 2015-11-26 2016-01-27 张癸荣 人血白蛋白优势抗原表位的筛选及应用
CN105273079B (zh) * 2015-11-26 2018-07-06 张癸荣 人血白蛋白优势抗原表位的筛选及应用
CN112876562A (zh) * 2019-11-30 2021-06-01 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗人血清白蛋白抗体及其应用
CN112876562B (zh) * 2019-11-30 2022-05-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 抗人血清白蛋白抗体及其应用
CN113817686A (zh) * 2020-06-18 2021-12-21 上海医药工业研究院 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用
CN113817686B (zh) * 2020-06-18 2023-11-14 上海医药工业研究院 一种杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104407148B (zh) 2016-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102174474B (zh) 西地那非单克隆抗体及用于检测西地那非的胶体金层析试纸条
CN106556701B (zh) 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
CN103278635A (zh) 动物布鲁氏菌病竞争elisa 抗体检测试剂盒
CN104407148B (zh) 一种人白蛋白超级灵敏elisa检测试剂盒
CN106405095A (zh) 采用间接竞争elisa法检测动物源性过敏原牛血清白蛋白
CN103333864B (zh) 抗弓形虫mic3蛋白单克隆抗体及其应用
CN108192875A (zh) 杂交瘤细胞株及基于杂交瘤细胞株的甘胆酸单克隆抗体和检测试剂盒
CN104130978B (zh) 一种杂交瘤细胞株11a2及其应用
CN104530240A (zh) 用于检测苯二氮卓类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒
CN104977415A (zh) Metrnl蛋白作为炎症性肠病诊断血清标志物的应用及其试剂盒
CN105717293B (zh) 一种用于检测猪圆环病毒2型的试剂盒
CN108998424A (zh) 一株马兜铃酸a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN108148814A (zh) 一种用于检测牛轮状病毒的双抗体夹心elisa诊断试剂盒及其应用
CN109507421B (zh) 抗水牛IgG单克隆抗体细胞株及其制备方法和应用
Sengupta et al. The possible role of fluoxetine in adenomyosis: an animal experiment with clinical correlations
CN107677807A (zh) 一种吉他霉素磁免疫化学发光检测试剂盒
CN106075468A (zh) Gps2用于制备软组织肿瘤预后、诊断或防治的药物的用途
CN101318015A (zh) 老年性痴呆重组蛋白疫苗及其制备方法
CN102818896B (zh) 一种基于特异抗体的硝基化修饰位点的检测方法及特异识别scot硝基化位点的抗体
CN206387810U (zh) 一种破伤风疫苗接种效果快速评价试剂盒
CN105017425B (zh) 抗her2中和活性单克隆抗体及其应用
CN108472372A (zh) 结合不动杆菌的抗体结合剂及其用途
CN103175961B (zh) 用于检测21种磺胺药物和11种喹喏酮药物的酶联免疫试剂盒及其应用
CN102146138B (zh) 一种抗氯霉素单克隆抗体及其应用
CN106399257A (zh) 抗a群脑膜炎球菌荚膜多糖结合物单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant