CN104530240A

CN104530240A - 用于检测苯二氮卓类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

Info

Publication number: CN104530240A
Application number: CN201410829641.8A
Authority: CN
Inventors: 袁宗辉; 彭大鹏; 王涓; 潘源虎; 王玉莲; 冯亮; 刘振利
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: CN104530240B

Abstract

本发明公开了一种能识别地西泮、硝西泮等苯二氮卓类药物的特异性单克隆抗体和一种用于检测地西泮、硝西泮等苯二氮卓类药物的酶联免疫方法及试剂盒。本发明的单克隆抗体是由保藏号为CCTCC NO:201352的杂交瘤细胞3D7所分泌的。与现有技术相比，本发明制备的单克隆抗体可同时识别地西泮、硝西泮等多种苯二氮卓类药物。本发明的酶联免疫方法及试剂盒具有检测效率和灵敏度高，精密度和准确度好等优点。

Description

用于检测苯二氮卓类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒

技术领域

本发明属于药物残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种用于检测苯二氮卓类药物的单克隆抗体，本发明还涉及用于检测苯二氮卓类药物的酶联免疫方法与试剂盒。

背景技术

苯二氮卓类(Benzodiazepines)是一类作用于中枢神经系统的镇静剂，能够引起动物镇静、嗜睡，或对周围的环境冷漠等作用。药物种类很多，多为1，4-苯并二氮卓的衍生物，其基本结构是由两个苯环和一个含有7个原子的杂环组成。通常用于将生产食品动物运往屠宰场过程中，以减少压力，降低动物的死亡率。此外，由于其使动物嗜睡，起到间接促进动物生长的作用。因此在利益的驱使下大量或者不遵守休药期的使用这类药物会导致药物残留，人长期摄入苯二氮卓类药物，可产生依赖性或成瘾性，突然停药可产生停药反应，表现为抑郁，精神激动，失眠等，由于这类药物易通过胎盘屏障，会对婴儿或幼畜会产生呼吸抑制作用。欧盟未制定此类药物的最大残留限量(MRL)，但禁止这类药物用于所有食品动物。英国也仅批准用于伴侣动物的治疗。我国农业部、卫生部、国家药品监督管理局于2002年联合发布的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中明确指出：严禁地西泮(安定)及其盐、酯及制剂在动物饲料和饮水中添加，允许治疗剂量，禁止作为食品动物的促生长使用，在动物性食品中不得检出。

仪器分析方法的优点在于灵敏、准确、分离度高并且可进行多残留检测的定性、定量研究，但需要昂贵的仪器、繁琐的前处理、熟练的专业操作员。免疫分析方法克服了仪器分析方法的缺陷，尤其是ELISA方法操作简单、成本低、灵敏度高、只需要简单的仪器。现有的ELISA方法的报道，大多为多克隆抗体的制备，变异性大、稳定性差，或者单残留检测。所以，建立一种能同时检测多个苯二氮卓类药物残留的酶联免疫方法很有必要。

CN101315374公开了一种地西泮残留分析酶联免疫检测试剂盒，以3-半琥珀酸酯地西泮为半抗原，与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，所制备的多克隆抗体仅能特异性识别地西泮。CN102565409 A公开了一种苯二氮卓类药物的检测试剂盒，采用购自美国美迪生物技术有限公司的抗苯二氮卓单克隆抗体，该抗体能识别奥沙西泮、地西泮、阿普唑仑等多种苯二氮卓类药物，但是不能识别去甲西泮、替马西泮、艾司唑仑。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能同时识别去甲西泮、替马西泮、艾司唑仑等多个苯二氮卓类药物的单克隆抗体。

本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，制备一种检测苯二氮卓类药物的酶联免疫试剂盒。

本发明的第三个目的是利用该试剂盒，建立一种用于苯二氮卓类药物非诊断目的检测的酶联免疫方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种能同时识别多个苯二氮卓类药物的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞3D7所分泌的，所述杂交瘤细胞3D7保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201352。

所述的苯二氮卓类药物，指的是地西泮、硝西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑。

进一步，本发明提供了一种能同时检测肉类产品中多个苯二氮卓类药物残留的酶联免疫方法，该方法包括包被原、抗体的制备以及样品前处理和检测等步骤，具体如下：

(1)将半抗原7-氨基硝西泮通过碳二亚胺(EDC)法与卵清蛋白(OVA)偶联得到包被原；

(2)用保藏号为CCTCC NO:201352的杂交瘤细胞3D7制备单克隆抗体；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。

进一步优选地，所述待测样品的提取方法是：将待测样品先用0.1M NaOH提取，再加入乙酸乙酯离心，取乙酸乙酯层，氮气吹干，用PBS缓冲液复溶后加入正己烷去脂，取下清液。

本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其它试剂组合，制成了能检测苯二氮卓类药物的酶联免疫检剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对苯二氮卓类药物的酶联免疫检测。

本发明的主要优点是：

1.本发明以7-氨基硝西泮为半抗原，制备的单克隆抗体能够识别地西泮、硝西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑，而现有技术无法同时识别以上苯二氮卓类药物。

2.本发明制备的单克隆抗体对以上苯二氮卓类药物有较高的识别灵敏度，地西泮的IC₅₀仅为8.88μg/L，去甲西泮的IC₅₀仅为6.36μg/L，硝西泮为17.94μg/L，识别灵敏度优于现有的苯二氮卓类单克隆抗体。而且对以上几种苯二氮卓类药物有较高的交叉反应率，对其它的苯二氮卓类药物交叉反应率很低，说明具有较好的特异性。

3.本发明建立的ELISA方法和试剂盒能同时检测肉类产品中地西泮、硝西泮等多种苯二氮卓类药物的残留，方法准确度高，精密度好、检测效率高，成本低。

4.方法中所涉及的样品前处理方法简单，快速，所使用的有机溶剂为乙酸乙酯，对人体及环境危害较小，正己烷去脂能减少干扰，更利于检测。

附图说明

图1为本发明制备的半抗原(7-氨基硝西泮)、牛血清白蛋白(BSA)、免疫原(7-氨基硝西泮-BSA偶联物)的紫外扫描图谱。

图2为本发明制备的半抗原(7-氨基硝西泮)、卵清蛋白(OVA)、包被原(7-氨基硝西泮-OVA偶联物)的紫外扫描图谱。

图3为本发明的单克隆抗体与地西泮标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为地西泮标准溶液浓度对数值，Y轴为地西泮标准品溶液的光密度值除以“零”孔光密度值(B/B0)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。

实施例1免疫原和包被原的制备

1.1免疫原的制备

称取硝西泮28mg于圆底烧瓶中，溶于甲醇10mL，加入钯碳2.8mg，通入氢气反应30mim，滤掉钯碳，反应液蒸干，即得到半抗原7-氨基硝西泮，加入N,N-二甲基甲酰胺1mL复溶。

称取牛血清白蛋白(BSA)70mg溶解于硼酸盐缓冲液10ml中，将上述半抗原滴加到载体蛋白中。

吸取25％的戊二醛溶液0.2ml用PBS 1.8ml的稀释10倍后，缓慢滴加滴加到半抗原与载体蛋白的混合液中，4℃反应过夜。

1.2包被原的制备

称取卵清蛋白(OVA)120mg溶解于硼酸盐缓冲液10ml中。称取碳二亚胺(EDC)1g和NHS 0.5g溶解于硼酸盐缓冲液1ml中后，缓慢加到载体蛋白中，反应30min。

将半抗原缓慢滴加到上述活化好的载体蛋白中，4℃反应过夜。

实施例2单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞的制备：参照杜念兴《兽医免疫学》。

以实施例1制备的免疫原免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序为：基础免疫用与等体积的弗氏完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液注射于小鼠的颈背部皮下；以后每隔15天用弗氏不完全佐剂乳化的含100μg免疫原的蛋白乳液进行加强免疫。从免疫三次起，每次免疫后第8天采尾血，分离血清，间接ELISA法检测血清抗体效价。免疫合格的小鼠(效价高、灵敏度好)停止免疫以备融合。

融合时，取经最后强化免疫的Balb/C小鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞。取2～5×10⁷个骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合，1700r/min离心10min，弃上清，倒扣于灭菌吸水纸控干水份后，制得混合细胞，置于水浴中。吸取37℃温育的融合剂(50％PEG)0.8mL缓慢加至混合细胞，边滴加边轻轻搅拌，融合作用时间不超过1min。缓慢加入预温至37℃的RPMI-1640基础培养基40mL终止融合反应，800r/min离心5min，弃上清。将下层融合细胞层转移至含饲养细胞的完全培养基中，轻轻搅拌使细胞均匀分布。将融合细胞悬液按每孔2滴接种于96孔细胞培养板，置于37℃CO₂培养箱中培养。

融合当天记为第0d，第3d每孔补加1滴1％HAT完全培养液，观察集落生长情况。第5d跟踪观察融合细胞，每孔吸出100μL上清，补加2滴0.5％HAT完全培养液。以后每隔2d换液一次。

根据细胞的生长情况，当细胞生长至占孔底1/5～1/3时检测上清(通常第7～8d)。取细胞培养上清，用间接竞争ELISA方法进行筛选，设置0孔和药物孔。与0孔OD值相比，药物孔OD值能显著被抑制的孔判定为阳性孔。根据抑制率和细胞集落生长状况，选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。

经过3～4次克隆，直至克隆阳性率为100％，最终筛选出分泌抗地西泮、硝西泮等苯二氮卓类药物的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经染色体计数，该杂交瘤细胞的染色体数目为102.4。申请人将其命名为杂交瘤细胞3D7，并于2013年4月16日送位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:201352。

腹水单抗制备与鉴定：将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。按照ThermoScientific公司鼠单克隆抗体快速ELISA同型检测试剂盒的操作要求，对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG₁，轻链为Kappa。

实施例3间接竞争ELISA检测方法的建立

3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)

磷酸盐缓冲液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

包被液：取Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6；

洗涤液：NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KCl 0.2g，Tween 200.5mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；

封闭液：卵清蛋白1g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；

底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

底物液B：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至1000mL；

底物混合液：将A液和B液按体积比1:1混合即得，现配现用；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

选择上述合成的作为包被原，用包被液稀释成16mg/L、8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L等8个浓度，在96孔酶标板，从第一至第八列依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液250μL，37℃封闭1h；洗涤3次，拍干，在酶标板的第一行至第八行依次加入100μL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为500、1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入1:3200倍磷酸盐缓冲液稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，购自武汉飞弈生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干；各孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。结果表明，初步确定包被原的包被浓度为1mg/L或2mg/L，抗体工作浓度为1:4000或1:8000。

表1包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定

3.3最佳包被原浓度的确定

以地西泮为竞争物，设置为32μg/L、16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、0μg/L 6个浓度梯度，分别以3.2方阵滴定法选择的包被浓度及对应的抗体稀释度组合进行间接竞争ELISA。以竞争物浓度的对数值作为横坐标、B/B0(以无药物抑制时的OD值为B0，相应浓度药物抑制时的OD值为B值)作为纵坐标绘制抑制曲线。结果见表2，以“0”孔OD值和IC₅₀值作为判定指标，确定最佳包被原浓度。随着包被浓度降低，IC₅₀也逐渐降低，因此由数据可见，最佳包被浓度为1μg/mL，抗体稀释度初步确定为1:3000。

表2最佳包被原浓度的确定

包被原浓度	抗体稀释倍数(1:X)	0孔OD值	IC₅₀值(μg/L)
				2	7000	1.905	13
1	3000	1.899	11

3.4最佳抗体稀释度和二抗稀释度确定

二抗的浓度对IC₅₀也有影响，为了得到最佳的二抗稀释度，以最佳包被浓度1μg/mL包被酶标板，用磷酸盐缓冲液将抗体稀释为1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000，横向加入酶标板中，用二抗稀释液将二抗稀释为1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800等5个浓度，纵向加入酶标板中。通过0孔值选择抗体体于二抗的稀释度组合为(8000,3200)、(4000,6400)。按照组合中抗体与二抗的稀释度进行间接竞争ELISA，0孔与IC₅₀值见表3。选择抗体稀释度为1:8000，二抗稀释度为1:3200。

表3最佳抗体工作浓度的确定

抗体稀释倍数(1:X)	二抗稀释倍数	0孔OD值	IC₅₀(μg/L)
				8000	3200	2.135	8.5
4000	6400	1.779	12

3.5标准曲线的建立

用甲醇将地西泮药物配制成1mg/mL的母液，然后用PBS将其依次稀释至0、2、4、8、16、32μg/L等6个浓度，进行间接竞争ELISA，绘制标准曲线，计算IC₅₀。如图3所示，标准曲线的回归方程为y＝-0.510x+0.981，R²＝0.997，IC₅₀值为8.88±0.67μg/L(n＝5)，线性范围为2～32μg/L。

3.6交叉反应试验

分别将地西泮、硝西泮等苯二氮卓类药物标准品倍比稀释成适当的浓度梯度进行间接竞争ELISA，每个药物3个重复，绘制标准曲线，计算IC₅₀值，与地西泮标准品IC₅₀值对比得到交叉反应率，结果(表4)表明，本发明建立的间接竞争ELISA对地西泮、硝西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮的交叉反应率分别为100％、49％、140％、32％、17％。

表4本发明试剂盒对各种苯二单桌类药物的交叉反应率

化合物名称	IC₅₀(μg/L)	交叉反应率(％)
			地西泮	8.88	100
去甲西泮	6.36	140
			硝西泮	17.94	49
替马西泮	27.67	32
			奥沙西泮	53.04	17
艾司唑仑	118.45	7.5
			阿普唑仑	368.82	2.4
氟硝西泮	>1000	<1
			氯硝西泮	>1000	<1
劳拉西泮	>1000	<1
			三唑仑	>1000	<1
氯氮卓	>1000	<1

实施例4苯二氮卓类多残留检测ELISA试剂盒的组装

4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：

(1)包被有包被原的固相载体(酶标板)；

(2)地西泮标准溶液6瓶，浓度分别为32μg/L、16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、0μg/L；

(3)保藏号为CCTCC NO:201352的杂交瘤细胞株3D7分泌的单克隆抗体；

(4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；

(5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄.12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，加双蒸水至1000mL；

(6)浓缩洗涤液：NaCl 80.0g，KH₂PO₄2.0g，Na₂HPO₄.12H₂O 29.0g，KCl 2.0g，Tween205mL，加双蒸水至1000mL；

(7)底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

8)底物液B：Na₂HPO₄14.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；

9)终止液：2mol/L硫酸溶液。

4.2酶标板的制备

用包被液将稀释成1mg/L，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育60min，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。

实施例5酶联免疫试剂盒的测定程序

5.1试剂的配制

(1)70％乙醇溶液：量取无水乙醇70mL，加双蒸水至定容1000mL。

(2)0.1M NaOH溶液：称取4.2g分析纯氢氧化钠，加双蒸水定容至1000mL。

(3)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。

(4)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。

(5)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1:1混匀，现配现用。

5.2组织样品前处理

猪饲料样品处理方法：

(1)称取饲料样品2.0±0.02g于50mL离心管中，加入70％乙醇8mL，涡旋5min后，室温4000rpm离心10min。

(2)取上清液0.5mL与PBS 0.5mL混匀，供试剂盒测定，本处理对饲料样品的稀释系数为8。

猪肌肉样品处理方法：

(1)称取猪肌肉样品均质物2.0±0.02g于50mL离心管中，加入8mL 0.1M NaOH涡旋5min后，再加入10mL乙酸乙酯涡旋混匀，室温4000rpm离心10min。

(2)取乙酸乙酯层5mL，50℃氮气吹干，加入PBS 1mL充分溶解后，加入正己烷1mL去脂，取下清液进行酶联免疫检测，本处理对肌肉样品的稀释系数为1。

5.3测定程序

(1)加样：向酶标板微孔中加入地西泮系列浓度标准溶液或样品溶液50μL，然后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

(2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；

(3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；

(4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；

(5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；

(6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；

(7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。

5.4结果判定

标准曲线：

以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，地西泮浓度的对数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。

样品中地西泮、硝西泮或去甲西泮浓度计算：

计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线的回归方程中，并乘以稀释系数，计算出待测样品中地西泮的浓度(μg/kg)，按照公式1折算成硝西泮或去甲西泮的浓度。

实施例6试剂盒的灵敏度、精密度和准确度

6.1本发明试剂盒的灵敏度

以标准曲线的IC₅₀值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指标。将地西泮标准品稀释成为32μg/L、16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、0μg/L 6个浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，取5次测定的IC₅₀的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白猪饲料和猪肌肉的OD值，根据标准曲线的回归方程计算出相应的地西泮浓度，然后计算出地西泮浓度的平均值和标准差(SD)，根据公式2：计算出猪饲料样品的最低检测限为8μg/L，猪肌肉样品的最低检测限为1.8μg/L。

6.2本发明试剂盒的精密度

将地西泮标准品稀释成32μg/L、16μg/L、8μg/L、4μg/L、2μg/L、0μg/L 6个浓度，每浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回归方程计算出各浓度地西泮标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表5。

表5标准曲线的板内与板间变异系数

6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验

在2g饲料样品中加入地西泮、去甲西泮、硝西泮标准溶液，使其中浓度分别为15μg/kg、30μg/kg、60μg/kg；在2g肌肉样品中加入地西泮、去甲西泮、硝西泮标准溶液，使其中浓度分别为2μg/kg、4μg/kg、8μg/kg，每个浓度5个重复，重复测定3次。测定添加组织中的地西泮、去甲西泮、硝西泮的浓度，按照下述公式计算回收率，考核试剂盒的准确度；计算批内和批间变异系数，考核试剂盒的重复性。饲料样品中，其添加回收率在71.5％-105.6之间，批内与批间变异系数≤9.8％；猪肌肉样品中，其添加回收率在78.9％～108.6％之间，批内与批间变异系数≤11.1％。测定结果见表6、7。表明该试剂盒具有可靠的准确度、重复性好。

表6饲料中的添加回收率

表7猪肌肉中的添加回收率

Claims

1.一种能识别苯二氮卓类药物的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCC NO:C201352的杂交瘤细胞3D7所分泌的，所述苯二氮卓类药物为地西泮、硝西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑。

2.权利要求1中所述的杂交瘤细胞3D7，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:C201352。

3.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测苯二氮卓类药物的酶联免疫试剂盒中的应用。

4.包含权利要求1所述单克隆抗体的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，该试剂盒是检测地西泮、硝西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑的酶联免疫试剂盒。

6.权利要求4或5所述的试剂盒在地西泮、硝西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑非诊断目的检测中的应用。

7.一种检测肉类产品中地西泮、硝西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑药物残留的酶联免疫方法，包括以下步骤：

(1)将7-氨基硝西泮与卵清蛋白偶联得到包被原；

(2)用保藏号为CCTCC NO:201352的杂交瘤细胞3D7制备单克隆抗体；

(3)用步骤(1)的包被原包被固相载体；

(4)将待测样品提取后进行酶联免疫检测。

8.根据权利要求7所述的检测肉类产品中地西泮、硝西泮、去甲西泮、替马西泮、奥沙西泮、艾司唑仑、阿普唑仑药物残留的酶联免疫方法，其特征在于：所述待测样品的提取方法是：将待测样品先用0.1M NaOH提取，再加入乙酸乙酯离心，取乙酸乙酯层，氮气吹干，用PBS缓冲液复溶后加入正己烷去脂，取下清液。