CN112961235B - 一种氯硝西泮全抗原及其制备方法 - Google Patents

一种氯硝西泮全抗原及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及全抗原合成技术领域，公开了一种氯硝西泮全抗原及其制备方法。过该氯硝西泮全抗原的制备方法包括以下步骤：（1）用氰基硼氢化钠对氯硝西泮中的亚胺基进行还原，获得4,5‑二氢‑7‑硝基‑5‑(2‑氯苯基)‑1H‑l,4‑苯并二氮杂䓬‑2(3H)酮；（2）将4,5‑二氢‑7‑硝基‑5‑(2‑氯苯基)‑1H‑l,4‑苯并二氮杂䓬‑2(3H)酮与丁二酸酐进行反应，获得氯硝西泮半抗原；（3）将氯硝西泮半抗原与载体蛋白偶联后，获得氯硝西泮全抗原。本发明实现了氯硝西泮与载体蛋白的偶联，且获得的氯硝西泮全抗原较为完整地保留了氯硝西泮分子结构，故具有较高的特异性和灵敏度。

Description

一种氯硝西泮全抗原及其制备方法
技术领域
本发明涉及全抗原合成技术领域，尤其涉及一种氯硝西泮全抗原及其制备方法。
背景技术
氯硝西泮(Clonazepam)又名氯安定，学名“1,3-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-2H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000012
-2酮”，其结构式如下式：
Figure BDA0002952335400000011
氯硝西泮，为一种高效苯二氮
Figure BDA0002952335400000013
类镇定剂。临床上主要用于治疗癫痫、惊厥、焦虑、失眠等作用，另外对药物引起的多动症、慢性多发性抽搐、僵人综合征、各类神经痛也有一定疗效。但同时氯硝西泮会引起嗜睡、无力、头痛、晕眩、恶心、便秘、甚至会出现皮疹、肝损害及骨髓抑制等不良反应。氯硝西泮曾用作动物饲料添加剂，作为生长促进剂，具有使动物嗜睡少动，生长快且有改变肉质的作用。若随意在饲料中添加此类药物，蓄积的药物通过食物链进入人体，将造成巨大的危害。为此许多国家将其列入禁用药物名单。
氯硝西泮常用检测分析方法主要有：气相色谱法(GC)、气-质联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液-质联用法(LC-MS)等。仪器分析方法具有极高的灵敏度和精密度，但需要昂贵的仪器、设备和经过专门培训的技术人员，不适于批量样品的筛选检测和现场即时检测。近年发展起来的免疫检测法具有操作简便、高效、灵敏、适合大规模检测等优点，已被广泛应用于各类违禁品等的检测。而要建立氯硝西泮的免疫检测方法，必须获得具有抗原活性的氯硝西泮全抗原。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种氯硝西泮全抗原及其制备方法。本发明实现了氯硝西泮与载体蛋白的偶联，且获得的氯硝西泮全抗原较为完整地保留了氯硝西泮分子结构，故具有较高的特异性和灵敏度。
本发明的具体技术方案为：
一种氯硝西泮全抗原，其结构式为：
Figure BDA0002952335400000021
其中，R为载体蛋白。
作为优选，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、鸡卵白蛋白(OVA)、牛丙种球蛋白(BGG)中的一种或多种。
一种所述氯硝西泮全抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)用氰基硼氢化钠对氯硝西泮(I)中的亚胺基进行还原，获得4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000024
-2(3H)酮(II)，反应过程如下：
Figure BDA0002952335400000022
(2)将4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000025
-2(3H)酮(II)与丁二酸酐进行反应，获得氯硝西泮半抗原(III)，反应过程如下：
Figure BDA0002952335400000023
(3)将氯硝西泮半抗原(III)与载体蛋白偶联后，获得氯硝西泮全抗原(IV)，反应过程如下：
Figure BDA0002952335400000031
本发明制备氯硝西泮全抗原的机制如下：利用氰基硼氢化钠对氯硝西泮中的亚胺进行还原，得到含有活泼氢的仲胺，将还原生成的仲胺基与丁二酸酐反应，得到接枝有羧基的半抗原，再利用该羧基与载体蛋白中的氨基进行反应，实现氯硝西泮与载体蛋白的偶联，获得具有免疫原性的氯硝西泮全抗原。利用本发明的方法制得的全抗原中，较完整地保留了氯硝西泮的分子结构，因而具有较强的特异性和较高的灵敏度。
此外，采用本发明的制备方法，能使整个制备流程中的反应条件较温和，具有较高的收率，且无需使用毒性和腐蚀性较强的试剂。
作为优选，步骤(1)中，所述氯硝西泮由氯硝西泮片提取获得，具体过程如下：将氯硝西泮片捣碎后，加入乙酸乙酯进行超声处理，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液减压浓缩，获得氯硝西泮。
作为优选，步骤(1)的具体过程如下：将氯硝西泮溶于乙醇，加入冰乙酸，再加入氰基硼氢化钠，在20-30℃下反应12-18h后，分离产物，获得4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4- 苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000032
-2(3H)酮。
作为优选，步骤(1)中，所述氯硝西泮与氰基硼氢化钠的质量比为1:0.3-0.5。
作为优选，步骤(1)中，所述氯硝西泮与冰乙酸的质量比为1:0.5-1。
作为优选，步骤(2)的具体过程如下：将4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000033
-2(3H)酮溶于吡啶，加入丁二酸酐，在100-110℃下反应12-18h后，分离产物，获得氯硝西泮半抗原。
作为优选，步骤(2)中，所述4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000034
-2(3H) 酮与丁二酸酐的质量比为1:0.8-1.2。
作为优选，步骤(3)的具体过程如下：将氯硝西泮半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)，在10-30℃下反应15-24h，离心后取清液，加入到载体蛋白的PBS溶液中，在4-20℃下反应15-24h，分离产物，获得氯硝西泮全抗原。
作为优选，步骤(3)中，所述氯硝西泮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺的质量比为1:0.27-0.30:0.49-0.52。
NHS和DCC相对于氯硝西泮半抗原的用量会影响产品收率和效价：若NHS和DCC 的相对用量过大，则易造成载体蛋白之间相互偶联，导致沉淀过多，致使产品效价及产品收率降低；若NHS和DCC的相对用量过小，则易造成半抗原中的羧基活化不完全，产品效价降低。
作为优选，步骤(3)中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白，所述氯硝西泮半抗原与牛血清白蛋白的质量比为1:1.5-2.5。
载体蛋白相对于氯硝西泮半抗原的用量也会影响产品收率和效价：若载体蛋白的相对用量过小，则会导致产品收率过低；若载体蛋白的相对用量过大，则会导致过多的氯硝西泮分子被载体蛋白包裹，影响抗原与抗体的结合，进而导致产品效价过低。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明的氯硝西泮全抗原较完整地保留了氯硝西泮分子结构，因而具有较强的特异性和较高的灵敏度；
(2)本发明中氯硝西泮全抗原的整个制备过程反应条件较温和，且未使用毒性和腐蚀性较强的试剂；
(3)通过将氯硝西泮半抗原、N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺、载体蛋白BSA的质量比控制在1:0.27-0.30:0.49-0.52:1.5-2.5的范围内，能获得较高的收率，且制得的氯硝西泮全抗原具有较高的效价。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种所述氯硝西泮全抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取氯硝西泮：
将氯硝西泮片捣碎后，加入乙酸乙酯进行超声处理，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液减压浓缩，获得氯硝西泮。
(2)制备4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000041
-2(3H)酮：
将氯硝西泮溶于乙醇，加入冰乙酸，再加入氰基硼氢化钠，所述氯硝西泮、冰乙酸与氰基硼氢化钠的质量比为1:0.5-1:0.3-0.5，在20-30℃下反应12-18h后，分离产物，获得4,5-二氢-7- 硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000042
-2(3H)酮。
(3)制备氯硝西泮半抗原：
将4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000051
-2(3H)酮溶于吡啶，加入丁二酸酐，所述 4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000052
-2(3H)酮与丁二酸酐的质量比为1:0.8-1.2，在100-110℃下反应12-18h后，分离产物，获得氯硝西泮半抗原。
(4)制备氯硝西泮全抗原：
将氯硝西泮半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)，所述氯硝西泮半抗原、NHS、DCC的质量比为1:0.27-0.30:0.49-0.52，在10-30℃下反应15-24h；离心后取清液，加入到载体蛋白的PBS溶液中，所述载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白(KLH)、鸡卵白蛋白(OVA)、牛丙种球蛋白(BGG)中的一种或多种(当载体蛋白为牛血清白蛋白时，所述氯硝西泮半抗原与牛血清白蛋白的质量比为1:1.5-2.5)，在4-20℃下反应15-24h，分离产物，获得氯硝西泮全抗原。
实施例1
一种所述氯硝西泮全抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)提取氯硝西泮：
将120片氯硝西泮片(每片含量4mg)捣碎后，加入350mL乙酸乙酯，超声处理5min，将获得的悬浊液过滤，滤饼用80mL乙酸乙酯洗涤，滤液减压浓缩，获得413mg氯硝西泮(用于实施例1-3和对比例1有关氯硝西泮全抗原的制备)。
(2)制备4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000053
-2(3H)酮：
取160mg氯硝西泮溶于25mL乙醇，加入100mg冰乙酸，再加入65mg氰基硼氢化钠，在室温下反应15h；反应完成后，减压浓缩至干，加入100mL水，用1N氢氧化钠溶液调pH8.5，再加入250mL乙酸乙酯，萃取分层，有机层依次用2×100mL水洗，而后将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，获得130mg 4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000054
-2(3H) 酮。
(3)制备氯硝西泮半抗原：
将130mg 4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000055
-2(3H)酮溶于25mL吡啶，加入 130mg丁二酸酐，在100℃下反应12h；反应完成后，减压浓缩干溶剂，将浓缩物进行柱层析，获得93mg氯硝西泮半抗原(用于实施例1和对比例2-5有关氯硝西泮全抗原的制备)。
(4)制备氯硝西泮全抗原：
将18mg氯硝西泮半抗原溶于1mL DMF中，加入5.0mg NHS和8.9mg DCC，在室温下反应 15h；离心后取清液，加入到6mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为6mg/mL)中，在10℃下反应15h；反应完成后，将反应液置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h 换PBS溶液一次，将透析后的反应液离心，取上清液，获得6.3mL 4.0mg/mL氯硝西泮全抗原。
实施例2
一种所述氯硝西泮全抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000061
-2(3H)酮：
取32mg氯硝西泮(实施例1中制得)溶于5mL乙醇，加入22mg冰乙酸，再加入14mg氰基硼氢化钠，在室温下反应16h；反应完成后，减压浓缩至干，加入25mL水，用1N氢氧化钠溶液调pH8.2，再加入50mL乙酸乙酯，萃取分层，有机层依次用2×20mL水洗，而后将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，获得28mg 4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000062
-2(3H)酮。
(2)制备氯硝西泮半抗原：
将28mg 4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000063
-2(3H)酮溶于5mL吡啶，加入29mg 丁二酸酐，在100℃下反应15h；反应完成后，减压浓缩干溶剂，将浓缩物进行柱层析，获得 19mg氯硝西泮半抗原。
(3)制备氯硝西泮全抗原：
将19mg氯硝西泮半抗原溶于1mL DMF中，加入5.5mg NHS和9.5mg DCC，在室温下反应 15h；离心后取清液，加入到7mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为6mg/mL)中，在10℃下反应15h；反应完成后，将反应液置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h 换PBS溶液一次，将透析后的反应液离心，取上清液，获得7.2mL 3.8mg/mL氯硝西泮全抗原。
实施例3
一种所述氯硝西泮全抗原的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000064
-2(3H)酮：
取32mg氯硝西泮(实施例1中制得)溶于5mL乙醇，加入25mg冰乙酸，再加入15mg氰基硼氢化钠，在室温下反应16h；反应完成后，减压浓缩至干，加入25mL水，用1N氢氧化钠溶液调pH8.6，再加入50mL乙酸乙酯，萃取分层，有机层依次用2×20mL水洗，而后将有机层用无水硫酸钠干燥，减压浓缩，获得25mg 4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000065
-2(3H)酮。
(2)制备氯硝西泮半抗原：
将25mg 4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂
Figure BDA0002952335400000071
-2(3H)酮溶于5mL吡啶，加入27mg 丁二酸酐，在100℃下反应15h；反应完成后，减压浓缩干溶剂，将浓缩物进行柱层析，获得 17mg氯硝西泮半抗原。
(3)制备氯硝西泮全抗原：
将17mg氯硝西泮半抗原溶于1mL DMF中，加入5.0mg NHS和8.8mg DCC，在室温下反应 15h；离心后取清液，加入到6mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为6mg/mL)中，在 10℃下反应15h；反应完成后，将反应液置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h 换PBS溶液一次，将透析后的反应液离心，取上清液，获得6.5mL 3.9mg/mL氯硝西泮全抗原。
对比例1
一种氯硝西泮全抗原的制备方法，包括以下步骤：
将18mg氯硝西泮(实施例1中制得)溶于1mL DMF中，加入5.0mg NHS和8.9mg DCC，在室温下反应15h；离心后取清液，加入到6mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为6mg/mL)中，在10℃下反应15h；反应完成后，将反应液置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h换PBS溶液一次，将透析后的反应液离心，取上清液，获得6.3mL 4.0mg/mL氯硝西泮全抗原。
对比例2
一种所述氯硝西泮全抗原的制备方法，包括以下步骤：
将18mg氯硝西泮半抗原(实施例1中制得)溶于1mL DMF中，加入4.5mg NHS和8.5mgDCC，在室温下反应15h；离心后取清液，加入到6mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为6mg/mL) 中，在10℃下反应15h；反应完成后，将反应液置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h换PBS溶液一次，将透析后的反应液离心，取上清液，获得6.5mL 4.1mg/mL氯硝西泮全抗原。
对比例3
一种所述氯硝西泮全抗原的制备方法，包括以下步骤：
将18mg氯硝西泮半抗原(实施例1中制得)溶于1mL DMF中，加入5.8mg NHS和9.9mgDCC，在室温下反应15h；离心后取清液，加入到6mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为6mg/mL) 中，在10℃下反应15h；反应完成后，将反应液置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h换PBS溶液一次，将透析后的反应液离心，取上清液，获得6.2mL 3.3mg/mL氯硝西泮全抗原。
对比例4
将18mg氯硝西泮半抗原(实施例1中制得)溶于1mL DMF中，加入5.0mg NHS和8.9mgDCC，在室温下反应15h；离心后取清液，加入到4mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为6mg/mL) 中，在10℃下反应15h；反应完成后，将反应液置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h换PBS溶液一次，将透析后的反应液离心，取上清液，获得4.2mL 3.1mg/mL氯硝西泮全抗原。
对比例5
将18mg氯硝西泮半抗原(实施例1中制得)溶于1mL DMF中，加入5.0mg NHS和8.9mgDCC，在室温下反应15h；离心后取清液，加入到8mL BSA的PBS溶液(其中，BSA的浓度为6mg/mL) 中，在10℃下反应15h；反应完成后，将反应液置于pH为7.4的PBS溶液中透析72h，期间每24h换PBS溶液一次，将透析后的反应液离心，取上清液，获得8.3mL 5.0mg/mL氯硝西泮全抗原。
测试例
利用胶体金免疫层析法对实施例1-3和对比例1-5中最终制得的抗原进行活性检测，检测条件如下：用喷膜机以1.0μg/cm的喷量，将氯硝西泮全抗原以3.0mm的宽度喷在NC膜上，以氯硝西泮抗体标记胶体金，结合玻璃纤维纸及吸水纸，组装成试纸条，对试纸条进行检测。检测结果如表1和表2所示。
表1
Figure BDA0002952335400000081
表2
Figure BDA0002952335400000082
从表1可知：实施例1-3在本发明范围内调整制备氯硝西泮全抗原过程中的工艺参数，所得全抗原的阴性检测T线显色强度均达到G8.5，证明采用本发明的方法合成的氯硝西泮全抗原具有较高的活性，能被抗体所识别并发生高效结合；阳性检测证明氯硝西泮的PBS溶液对制得的氯硝西泮抗原有竞争性抑制且有较高灵敏度和梯度。
对比例1与实施例1的区别在于，对比例1未对氯硝西泮进行改性而直接与载体蛋白进行偶联，而实施例1则采用本发明的方法对氯硝西泮进行改性后再将其与载体蛋白偶联。从表1可知：对比例1所得抗原的阴性检测T线显色强度和阳性检测灵敏度均为0。说明氯硝西泮本身不能直接与蛋白质偶联，通过本发明的方法对氯硝西泮进行改性后，能使其实现与载体蛋白的偶联，制得的氯硝西泮抗原具有较强的特异性和较高的灵敏度。
对比例2与实施例1的区别在于，实施例1中氯硝西泮半抗原、NHS、DCC的质量比为1:0.28:0.50，对比例2中则为1:0.25:0.47。从表1和表2可知：对比例2所得氯硝西泮全抗原的阴性检测T线显色强度明显低于实施例1，阳性检测灵敏度也有所下降。原因在于：NHS 和DCC的用量过小，会造成半抗原中的羧基活化不完全，产品效价降低。
对比例3与实施例1的区别在于，实施例1中氯硝西泮半抗原、NHS、DCC的质量比为1:0.28:0.50，对比例3中则为1:0.32:0.55。从表1和表2可知：对比例3所得氯硝西泮全抗原的阴性检测T线显色强度明显低于实施例1，阳性检测灵敏度也有所下降。另外，相较于实施例1而言，对比例3中氯硝西泮全抗原的收率也有所降低。原因在于：NHS和DCC的用量过大，易造成载体蛋白之间相互偶联，导致沉淀过多，致使产品效价及产品收率降低。
对比例4与实施例1的区别在于，实施例1中氯硝西泮半抗原与载体蛋白BSA的质量比为1:2.0，对比例4中则为1:1.3。从表1和表2可知：对比例4所得抗原的阴性检测T线显色强度可达到G9.0，阳性检测结果与实施例1相同。但相较于实施例1而言，对比例4中氯硝西泮全抗原的收率较低。原因在于：相对较少的载体蛋白可让更多的氯硝西泮分子暴露在外，更易与抗体结合，从而使效价有所提高，但同时会造成产品收率过低。
对比例5与实施例1的区别在于，在步骤(4)中，实施例1中氯硝西泮半抗原与载体蛋白BSA的质量比为1:2.0，对比例5中则为1:2.7。从表1和表2可知：对比例5所得全抗原的阴性检测T线显色强度明显低于实施例1，阳性检测灵敏度也有所下降。原因在于：载体蛋白的相对用量过大，会导致过多的氯硝西泮分子被载体蛋白包裹，影响抗原与抗体的结合，进而导致产品效价过低。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (7)

1.一种氯硝西泮全抗原，其特征在于，其结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
其中，R为载体蛋白；所述载体蛋白为牛血清白蛋白、血蓝蛋白、鸡卵白蛋白、牛丙种球蛋白中的一种或多种。
2.一种如权利要求1所述氯硝西泮全抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）用氰基硼氢化钠对氯硝西泮中的亚胺基进行还原，获得4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂䓬-2(3H)酮；
（2）将4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂䓬-2(3H)酮与丁二酸酐进行反应，获得氯硝西泮半抗原；
（3）将氯硝西泮半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺，在10-30℃下反应15-24h，离心后取清液，加入到载体蛋白的PBS溶液中，在4-20℃下反应15-24h，分离产物，获得氯硝西泮全抗原；所述载体蛋白为牛血清白蛋白，所述氯硝西泮半抗原、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺和牛血清白蛋白的质量比为1:0.27-0.30:0.49-0.52:1.5-2.5。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述氯硝西泮由氯硝西泮片提取获得，具体过程如下：将氯硝西泮片捣碎后，加入乙酸乙酯进行超声处理，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，滤液减压浓缩，获得氯硝西泮。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）的具体过程如下：将氯硝西泮溶于乙醇，加入冰乙酸，再加入氰基硼氢化钠，在20-30℃下反应12-18h后，分离产物，获得4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂䓬-2(3H)酮。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中，所述氯硝西泮与氰基硼氢化钠的质量比为1:0.3-0.5；和/或
步骤（1）中，所述氯硝西泮与冰乙酸的质量比为1:0.5-1。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程如下：将4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂䓬-2(3H)酮溶于吡啶，加入丁二酸酐，在100-110℃下反应12-18h后，分离产物，获得氯硝西泮半抗原。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述4,5-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-1H-l,4-苯并二氮杂䓬-2(3H)酮与丁二酸酐的质量比为1:0.8-1.2。
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