RU2071058C1 - Способ получения аффинного сорбента для выделения с-реактивного белка - Google Patents
Способ получения аффинного сорбента для выделения с-реактивного белка Download PDFInfo
- Publication number
- RU2071058C1 RU2071058C1 SU5036548A RU2071058C1 RU 2071058 C1 RU2071058 C1 RU 2071058C1 SU 5036548 A SU5036548 A SU 5036548A RU 2071058 C1 RU2071058 C1 RU 2071058C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- reactive protein
- sorbent
- preparing
- glycosphosphocholine
- isolation
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Использование: изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано в медицине. Сущность изобретения: для выделения С-реактивного белка из асцитной жидкости человека используют аффинный сорбент, полученный на основе гликольфосфохолина, ковалентно связанного с аминозамещенной агарозной матрицей. Данный способ отличается от описанных ранее быстротой и простотой получения аффинного сорбента. 3 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано в медицине.
Известен способ получения аффинного сорбента для выделения С-реактивного белка (СРБ) путем присоединения n-диазонийфенилфосфохолина к модифицированной дипептидом глицилтирозин BrCN-активированной сефарозе 4В (1, 2).
К 20 мМ диметилэтаноламина в 10 мл эфира добавляют 2 мМ метилиодида, смесь перемешивают в течение 18 часов, добавляют 2 мМ n-нитрофенилдихлоридата и 2 мМ хинолина, растворенных в 0,5 мл ацетонитрила каждый, перемешивают в темноте при 0oC в течение 4-8 часов. После чего в смесь добавляют 1 мл пиридина, 0,2 мл дистиллированной воды, выдерживают 30 минут и упаривают. Сухой остаток растворяют в дистиллированной воде, пропускают через колонку содержащую 40 мл смолы Amberlite МВ-3, элюируют дистиллированной водой и лиофилизируют.
0,3 мМ полученного n-нитрофенилфосфохолина растворяют в метаноле и выдерживают 1 час при 1 атм Н2 в присутствии 10 мг 10% Pd/C, затем фильтруют на стеклянном фильтре и упаривают. Остаток немедленно растворяют в 2мл холодной 0,1 н НСl и обрабатывают NaNO 2 при 15oC.
К 500 мл BrCN-активированной сефарозы 4В ("Pharmacia") присоединяют 1,8 мМ глицилтирозина ("Sigma"). К гелю добавляют 0,5 мМ синтезированного n-диазонийфенилфосфохолина и перемешивают 20 часов.
Асцитную жидкость пропускают через аффинный сорбент, уравновешенный Ca2+-содержащим боратным буфером (рН 8,5), затем гель промывают этим же буфером до достижения близкого к нулю значения оптической плотности при 280 нм, после чего белок элюируют, используя боратный буфер с заменой хлористого кальция на этилендиаминтетрауксусную кислоту.
Однако недостатком данного способа получения аффинного сорбента для выделения СРБ является необходимость предварительного получения тирозинзамещенной матрицы и синтез сложного соединения - n-диазонийфенилфосфохолина.
Наиболее близким по своему техническому решению к предлагаемому способу является способ получения аффинного сорбента для выделения СРБ, заключающийся в присоединении к тиолзамещенной агарозе конъюгата гликольфосфохолина с бычьим сывороточным альбумином (3).
16 мМ кадмиевого комплекса sn-глицеро-3-фосфоолина ("Sigma") переводят в свободную форму с помощью ионообменной смолы AG 501 X-8 (Д). 14 мМ sn-глицеро-3-фосфохолина растворяют в 280 мл дистиллированной воды, добавляют 28 мМ сухого мета-периодата натрия и выдерживают 30 минут, после чего добавляют 28 мМ этиленгликоля и упаривают. Сухой остаток растворяют в 0,1 н уксусной кислоте, помещают на колонку, содержащую Sephadex G-15, элюируют 0,1 н уксусной кислотой. Фракции, содержащие гликольфосфохолин, объединяют и упаривают. 7,3 мМ гликольфосфохолина растворяют в 25 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7.0), добавляют 14,5 мкМ бычьего сывороточного альбумина и 36,3 мМ цианборогидрида натрия в том же буфере. Смесь инкубируют при 37oC в течение 24 часов, диализуют против дистиллированной воды, фильтруют и лиофилизируют.
90 г агарозы Тoyoperl HW 65 ("Toyo Soda") промывают дистиллированной водой и суспендируют в 90 мл диглицидилового эфира 1,4-бутандиола и 90 мл 0,6 М NaOH, содержащего 180 мг NaBH4. Гель перемешивают 8 часов, промывают дистиллированной водой, суспендируют в 270 мл 1, M Na2S2O3, устанавливая рН 7,0 с помощью 1 М HCl, смесь инкубируют 16 часов. Затем гель промывают дистиллированной водой, суспендируют в 270 мл 25 мМ трео-2,3-дигидрокси-1,4-дитандитиола и перемешивают 90 минут при 30oC. Гель промывают ледяным 0,1 М фосфатным буфером (рН 6,0), содержащим 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты.
10,1 мг конъюгата гликольфосфохолина с бычьим сывороточным альбумином растворяют в 10,1 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,0), содержащего 44,1 мг N, N-о-фенилендималеимида, растворенного в 1 мл диметилформамида, смесь инкубируют 90 минут при 37oC, наносят на колонку с Sephadex G-25, элюируют фосфатным буфером. Фракции, содержащие малеимидированной конъюгат, объединяют.
9 г тиолзамещенного агарозного сорбента суспендируют в объединенном растворе малеимидированного конъюгата гликольфосфохолина с бычьим сывороточным альбумином и перемешивают 10-12 часов при 4oC.
Колонку с аффинным сорбентом уравновешивают Са2+-содержащим фосфатным буфером (рН 7,2), пропускают СРБ-положительную сыворотку, промывают тем же буфером до нулевого значения оптической плотности при 280 нм. С-реактивный белок элюируют с помощью фосфатного буфера (рН 7,2), содержащего этилендиаминтетрауксусную кислоту.
Однако недостатком этого способа получения аффинного сорбента для выделения СРБ является сложность и многостадийность получения фосфохолинсодержащего лиганда и тиолзамещенной агарозы.
Целью изобретения является упрощение получения аффинного сорбента, используемого для выделения С-реактивного белка.
Цель достигается использованием в качестве лиганда гликольфосфохолина, иммобилизованного на аминозамещенной агарозной матрице. Способ получения аффинного сорбента для выделения СРБ на основе гликольфосфохолина и приготовленной или коммерческой аминозамещенной агарозы (фиг.1), а также его применение для выделения СРБ иллюстрируются следующими примерами.
ПРИМЕР 1. Sn-глицеро-3-фосфолин, являющийся исходным соединением для используемого в качестве лиганда гликольфосфохолина, получают из яичного фосфатидилхолина согласно методу (4).
К 3,5 мл 100 мМ водного раствора Sn-глицеро-3-фосфолина добавляют 1 мМ сухого мета-периодата натрия и выдерживают 1-2 часа, добавляют 3 мМ этиленгликоля или глицерина и выдерживают еще 1 час. Раствор упаривают до сухого остатка, растворяют его в 0,1 н уксусной кислоте и наносят на колонку, содержащую Sephadex G-15, элюируют 0,1 и уксусной кислотой. Содержащие гликольфосфохолин фракции объединяют, выход гликольфосфохолина составляет 55-60%
1 г сухой BrCN-активизированной сефарозы 4В ("Pharmacia") суспендируют в 1 мМ HCL, промывают на стеклянном фильтре 0,1 М карбонатным буфером (рН 8,2-8,4). К суспензии агарозы в 3-кратном объеме карбонатного буфера добавляют 3,5 мМ триэтилтетраамина или гексаметилендиамина и перемешивают 10-12 часов. Затем гель промывают карбонатным буфером, суспендируют в 3-кратном объеме карбонатного буфера, добавляют объединенные фракции, содержащие гликольфосфохолин, и перемешивают в течение 10-12 часов. Емкость аффинного сорбента по фосфату составляет 24-28 мкМ/г сухого сорбента.
1 г сухой BrCN-активизированной сефарозы 4В ("Pharmacia") суспендируют в 1 мМ HCL, промывают на стеклянном фильтре 0,1 М карбонатным буфером (рН 8,2-8,4). К суспензии агарозы в 3-кратном объеме карбонатного буфера добавляют 3,5 мМ триэтилтетраамина или гексаметилендиамина и перемешивают 10-12 часов. Затем гель промывают карбонатным буфером, суспендируют в 3-кратном объеме карбонатного буфера, добавляют объединенные фракции, содержащие гликольфосфохолин, и перемешивают в течение 10-12 часов. Емкость аффинного сорбента по фосфату составляет 24-28 мкМ/г сухого сорбента.
Пример 2. К 18 мл 50 мМ водного раствора Sn-глицеро-3-фосфохолина добавляют 1,8 мМ сухого мета-периодата натрия, смесь выдерживают 30 минут, после чего добавляют 310 мкл 1 мМ тиосульфата натрия. Разделение реакционной смеси проводят с помощью Sephadex G-15 как указано в примере 1.
2,5 г сухой АН-агарозы 4% ("Кемотех", Эстония) суспендируют в 1 мМ HCl, промывают 0,1 М карбонатным буфером (рН 8,2-8,4), суспендируют в 3-кратном объеме карбонатного буфера, добавляют объединенный раствор гликольфосфохолина и перемешивают 10-12 часов. После иммобилизации лиганда гель снова промывают карбонатным буфером. Емкость аффинного сорбента по фосфату составляет 24-28 мкМ/г сухого сорбента.
ПРИМЕР 3. Для выделения С-реактивного белка колонку, содержащую аффинный сорбент, уравновешивают Ca 2+ -содержащим трис-НСl буфером (рН 7,6-8,5), пропускают асцитную жидкость с содержанием СРБ не ниже 20 мкг/мл, промывают сорбент СА 2+ -содержащим трис-буфером до нулевого значения оптической плотности при 280 нм. С-реактивный белок элюируют трис-HCl буфером (рН 7,6-8,5) с заменой хлористого кальция на лимоннокислый натрий. Выход 60-75% чистота 90-95%
При анализе проб С-реактивного белка, выделенного с использованием описанных в примерах 1 и 2 сорбентов, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия выявлена одна полоса, соответствующая по молекулярной массе субъединице С-реактивного белка (фиг.1).
При анализе проб С-реактивного белка, выделенного с использованием описанных в примерах 1 и 2 сорбентов, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия выявлена одна полоса, соответствующая по молекулярной массе субъединице С-реактивного белка (фиг.1).
С помощью иммуноэлектрофореза показано, что пробы С-реактивного белка, выделенного с использованием описанных в примерах 1 и 2 сорбентов, реагируют с антисывороткой к нему с образованием одной линии преципитации, при использовании антисывороток к нормальным белкам человека линии преципитации отсутствуют (фиг.2).
Концентрацию выделенного С-реактивного белка определяют при помощи метода радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Стефани Д.В. с соавт.
Claims (1)
- Способ получения аффинного сорбента для выделения С-реактивного белка, включающий взаимодействие замещенной агарозной матрицы с лигандом на основе sn-глицеро-3-фосфохолина с последующей промывкой, отличающийся тем, что в качестве замещенной агарозной матрицы используют аминозамещенную агарозу, в качестве лиганда используют гликольфосфохолин при их соотношении 1,0 0,042 соответственно и взаимодействие проводят при pH 8,2 8,4.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5036548 RU2071058C1 (ru) | 1992-04-08 | 1992-04-08 | Способ получения аффинного сорбента для выделения с-реактивного белка |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5036548 RU2071058C1 (ru) | 1992-04-08 | 1992-04-08 | Способ получения аффинного сорбента для выделения с-реактивного белка |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2071058C1 true RU2071058C1 (ru) | 1996-12-27 |
Family
ID=21601471
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5036548 RU2071058C1 (ru) | 1992-04-08 | 1992-04-08 | Способ получения аффинного сорбента для выделения с-реактивного белка |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2071058C1 (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2578387C2 (ru) * | 2014-05-27 | 2016-03-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Балтийский государственный технический университет "ВОЕНМЕХ" им. Д.Ф. Устинова (БГТУ "ВОЕНМЕХ") | Устройство охлаждения лопаток турбины газотурбинной установки |
RU2700605C1 (ru) * | 2019-03-25 | 2019-09-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ кардиологии" Минздрава России) | Сорбент для сочетанного удаления из плазмы человека атерогенных липопротеидов и С-реактивного белка |
-
1992
- 1992-04-08 RU SU5036548 patent/RU2071058C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Osmand A.P., Mortensen R.F., Siegel, Hewurz H. - J.Exp.Med.- 1975, v. 142, p. 1065-1073. 2. Chesebro B., Metzger H. - Biochem., 1972, v. 11, p. 776-781. 3. Stultz N.L., Lee J.C., Hoppe C.A. et al. - Anal.Biochem. 1987, v. 161, p. 567 - 573. * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2578387C2 (ru) * | 2014-05-27 | 2016-03-27 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Балтийский государственный технический университет "ВОЕНМЕХ" им. Д.Ф. Устинова (БГТУ "ВОЕНМЕХ") | Устройство охлаждения лопаток турбины газотурбинной установки |
RU2700605C1 (ru) * | 2019-03-25 | 2019-09-18 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр кардиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ кардиологии" Минздрава России) | Сорбент для сочетанного удаления из плазмы человека атерогенных липопротеидов и С-реактивного белка |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4308254A (en) | Material able to fix reversibly biologial macromolecules, its preparation and its application | |
US5092992A (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
US4269605A (en) | Method and kit for separation of glycoproteins | |
US3966898A (en) | Method and reagent for determining immunologic materials | |
EP0040365B1 (en) | An assaying method involving biospecific affinity reactions | |
JP3174637B2 (ja) | 改質されたクロマトグラフィー用支持体材料 | |
JPH0672161B2 (ja) | アフイニテイクロマトグラフイ用材料の製法 | |
JPH032560A (ja) | 新規なクロマトグラフィー用固定担体 | |
US5085779A (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
US4647655A (en) | Method for splitting di-sulphide bonds and a compound obtained thereby | |
PT749435E (pt) | Agente anti-interferencias para utilizacao em testes imunologicos | |
US4757003A (en) | Method for the detection of cancer | |
HU215555B (hu) | Eljárás variánsok koncentrációjának meghatározására, valamint az eljárásban használható analitikai vizsgálati készlet | |
US5112952A (en) | Composition and method for isolation and purification of Immunoglobulin M | |
RU2071058C1 (ru) | Способ получения аффинного сорбента для выделения с-реактивного белка | |
EP0460576A1 (en) | Assay for cobalamins | |
EP0153763A2 (en) | Affinity chromatography matrix with built-in reaction indicator | |
US5227311A (en) | Intrinsic factor to determine B12 | |
JPH0476579B2 (ru) | ||
US5082929A (en) | Immobilization of glycocompounds and glycoconjugates | |
EP0403700B1 (en) | Polyethyleneimine matrixes for affinity chromatography | |
Larsson et al. | Isolation of concanavalin A by affinity precipitation | |
US5990274A (en) | Cyclosporine derivatives and uses thereof | |
EP0167152A2 (en) | Protease adsorbent and process for purifying TPA utilizing the same | |
EP0216162A2 (en) | A method of preparing indoles or indole derivatives, coupled via position 4, 5, 6, or 7, the indoles or indole derivatives concerned, as well as the use thereof |