JPH032560A - 新規なクロマトグラフィー用固定担体 - Google Patents

新規なクロマトグラフィー用固定担体

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JPH032560A
JPH032560A JP1210781A JP21078189A JPH032560A JP H032560 A JPH032560 A JP H032560A JP 1210781 A JP1210781 A JP 1210781A JP 21078189 A JP21078189 A JP 21078189A JP H032560 A JPH032560 A JP H032560A
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polyhydroxylated
silica
group
nucleophilic
backbone
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JP1210781A
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Tikam Jain
ティカム・ジェイン
Robert Shorr
ロバート・ショー
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AT Biochem
Original Assignee
AT Biochem
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ポリヒドロキシル化材料を、該材料に求核配
位子を共有結合させることにより改質する方法に関する
。更に特定するに、本発明は固定相として種々のクロマ
トグラフィー法に用いられる改良された担体材料および
斯かる担体材料の製造方法に関する。
クロマトグラフィーは、成る混合物に当初から存在した
個々の化合物を二つの不均質（不混和性）相間の選択的
分配により相互に分離する技法である。分離すべき化学
種の分配は、移動相と固定相との間の機能的プロセスで
生じる。固定相は、移動相の流通が許容される通常比較
的大きな表面積を有する分散媒体である。分離プロセス
に関する主な制御は固定相の化学的性質によってなされ
る。固定媒体に対する特定化合物（溶質と呼称）の親和
性が大きいほど、それが系内に保持される期間も長い。
移動相は気体であっても液体であってもよい。移動相が
気体のとき、クロマトグラフィー法はガスクロマトグラ
フィーと呼ばれ、液体のときはリキッドクロマトグラフ
ィーと呼ばれる。
例えば、移動ないし固定相、技法および溶質測定原理の
選定で変化する多種のクロマトグラフィー法がある。例
として、イオン交換クロマトグラフィーは、広く用いら
れている形態のリキッドクロマトグラフィーである。そ
れは、種々の帯電試料成分とイオン化クロマトグラフィ
ーマトリックスとの間の選択的イオン引力に基く。最も
普通に用いられているイオン交換体は、その多孔質表面
に酸性若しくは塩基性交換部位を有する有機重合体主鎖
からなる。帯電樹脂は、そのカチオン又はアニオンを、
マトリックスに対してより大きな親和性を有する液体相
のカチオン又はアニオンと交換することができる。種々
のイオンがカラムを通過する際に生じる交換相互作用に
よって、不連続イオン帯域への分離が惹起される。
薄層クロマトグラフィーは、プラスデック製着しくはガ
ラス製のプレート上に層を形成する懸濁物である。それ
は最も頻繁には、適当な溶剤に懸濁させた吸着剤（粒度
は数ミクロン）であって、プレート上に一様に塗布され
、乾燥せしめられる。移動相は該プレートを毛管作用に
よって遡る液体であり、試料混合物の成分は分配効果に
よって分離される。
逆相クロマトグラフィーは、非極性固定相と極性溶離相
との間で炭化水素および極性試料が分配される一種のク
ロマトグラフィーである。これらの条件下、極性の最も
高い物質が最も迅速に溶離する。これは、より普通の分
配クロマトグラフィーとは逆である。後者の場合、固定
相が極性、溶離相が非極性で、極性の最も低い物質が最
も迅速に溶離する。逆相クロマトグラフィーの場合、固
定相はしばしば、シリカ又はガラスの如き不活性表面に
化学的に結合した原子鎖よりなり、溶離相はしばしば水
性メタノール又は水性アセトニトリルである。
しばしばゲルクロマトグラフィーと呼称される分子篩ク
ロマトグラフィーは、生体巨大分子の化学に大きな進展
をもたらした。分子篩クロマトグラフィーにおける分離
は、寸法形状の異なる分子が多孔質ゲル媒体に選択的に
浸透する方法を基礎とする。混合物中量も大きな分子は
多孔質構造には全く浸透せず、中寸法分子がいくらかの
気孔にだけ浸透し、そして小さな分子が媒体内部でかな
り自由に拡散し得且つそこで相当長時間過ごしつる。そ
れ故、多孔質材料がカラムに内蔵されるなら、分子量の
異なる成分混合物を効果的に分離することができる。
どのクロマトグラフィー法でも、所定混合物の成る成分
は他の成分よりも固定相上により長く保持される。これ
によって、きわめて選択的なりロマトグラフィー分離が
可能となる。例えば、親和性クロマトグラフィーと呼ば
れる方法では、精製すべき分子が、固定相表面に固定さ
れた配位子と相互作用する。固定された配位子のカラム
に多成分抽出物を通ずとき、識別される材料が該カラム
に選択的に吸収されることになる。非相互作用性材料は
洗去され得、結合成分は競合的若しくは親和性の改質試
薬によって生物学上特異的に或は変性条件下溶離されつ
る。それ故、常に、所定の分離問題に対し適当な選択性
を有する固定相材料を捜すことが必要となる。
上記クロマトグラフィー法のすべてに共通なのは、移動
相の所期成分例えば親和性クロマトグラフィーでは固定
相に結合した高特異性配位子またイオン交換クロマトグ
ラフィーでは固定相上の酸性ないし塩基性交換部位と所
望態様で相互作用する相をその表面に有する固定相の使
用である。
様々なタイプのクロマトグラフィーに合った固定相の開
発は概ね、デキストラン（セファデックス）、アガロー
ス、ガラス、シリカおよび、ポリアクリルアミド、ポリ
メタクリレート若しくはラテックスの如き重合体材料に
種々の結合相を付着させることに焦点を合わせてきた。
更に特定するに、親和性クロマトグラフィての使用には
、臭化シアンによるアガロースの賦活を用いた配位子固
定化の化学が最も一般的な方法学であった。また、１，
１゛−カルボニルジイミダゾール又はクロロホルメート
とアガロース、ポリアクリルアミド、セルロース、ガラ
スピーズ若しくはヒドロキシル化ポリスチレン又は他の
重合体との反応によるカーボネートおよびカルバメート
の発生も用いられてきた。斯かる化学の主な欠点はアミ
ンとの反応で比較的不安定なアミド結合が生成し、その
結果緩徐なしかし測定可能な速度で絶えず配位子が漏出
することである。更に、恐らくはイソ尿素基の形成数の
、非特異的蛋白質吸収へのイオンの貢献も観察されてき
た。アミンとの反応でウレタン結合を形成するカルボニ
ルジイミジゾール賦活担体の使用および二官能価オキシ
ランの使用は非特異的蛋白質結合を排除しはしないが減
少させてきた。斯かる改良にもかかわらず、アガロース
は微生物攻撃に敏感なままであり、有機溶剤の存在では
有用性に制約があり、容易にはスケールアップされず、
また流量増加も受けにくい。ガラスの如き他の担体は、
有機溶剤中で十分性能するけれども、残留帯電機能およ
び非特異的結合をこうむる。ポリアクリルアミドは、ア
ガロースよりも微生物攻撃に強く抵抗するが、流れ容量
の高いカラムを形成しない。他の重合体材料はアガロー
スよりも高レベルの非特異的相互作用をこうむる。
理想的には、固定相又はクロマトグラフィー担体は良好
な機械的強度および流れ特性を有し、成る粒度、気孔寸
法および形状範囲内で有効であり、化学的に安定であり
、高度の親水性を保持し、多くの改質を受けやすく、分
離しようとする成分との非特異的相互作用をほとんど若
しくは全く有さない。シリカは斯かる基準をほとんど満
たすことが示された。親和性クロマトグラフィーに用い
られるシリカカラムの最適な賦活および性能は球形の１
０ミクロン粒子を以て達成されている。より小さな粒子
では有意な利益は得られず、２０ミクロンの材料を用い
たとき性能上の実質的減少が観察された。親和性クロマ
トグラフィーにおけるシリカ担体の使用からは、容易に
受は入れやすい容量、微生物攻撃に対する全き抵抗、固
定化化学の容易さおよび可転性、高い精製効率並びに優
れた流れ特性を含む重要な利益の得られることが見出さ
れている（　Ｈｏ１ｌｉｓ等のＪ、　Ｌｉｇ。
Ｃｈｒｏｍａｔ、、１ｏ、２３４９　（１９８７）を参
照のこと）。シリカの使用によって、溶離容量が最小限
に抑えられ、しかも手順が迅速で且つ容易に自動化され
る親和性クロマトグラフィー系がもたらされる。
以前、シリカは、クロマトグラフィーに用いられるべく
一連の反応を介し種々のオルガノシラン類似物および方
法学を用いて改質されてきた。
斯かる化学は酸、塩基および他の処理に対して敏感で且
つ不安定な５ｉ−０−３ｉ結合を介する結合相の付着を
もたらす。シリカのシラン賦活を示す一般式は下記の如
くである 式　　】 式１に示す如く、反応性オルガノシランは、シリカ表面
上の有効ヒドロキシル官能基へと方向付けられる。斯か
る担体の半減期は５ｉ−０−Ｓｉ結合の緩徐な分解故に
変化し得、しかも予測し得ない。特に、シラン賦活シリ
カは、約７．２より高いｐＨにおいて不安定である。こ
れは、２〜７．２範囲のｐＨを要求する用途でのシリカ
の使用を妨げないけれども、より高いｐＨを要求する用
途では重合体ビーズの如き異なる担体を用いねばならな
い。多くの重合体ビーズは、シリカと比較するとき高め
られたｐ　Ｈにおいて安定であるが、貧弱な流れ特性と
、より高い非特異的結合を示す。いくつかの例で、ジル
コニウム含浸され或は重合体被覆されたシリカが調製さ
れており、また該シリカより高いｐ　Ｈ安定性を保有す
ることがクレームに示されている。
斯くして、シリカは多くの点で他の材料と比較して有利
なりロマトグラフィー担体材料を供与するけれども、配
位子を結合する化学的方策に由来する化学的不安定性は
重大な欠点である。より高いｐＨ安定性を有するシリカ
担体を用いうることから益する多くの分離用途がある。
例えば、関連した生物学的活性のいずれをも保持すべく
企図されたフォーマットにおける蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、細胞又は細胞粒子の分離を含むバイオクロマトグラ
フィー法がある。斯かるバイオクロマトグラフィー法の
例は、イオン交換、疎水性相互作用、サイズイクスクル
ージョン分離および既述の親和性クロマトグラフィーで
ある。表面改質シリカの化学的不安定性故に、また最適
生物分離が通常アルカリ性ｐＨで観察される故に、斯か
る多くのバイオクロマトグラフィー法による分離は、シ
ワ力よりも効率の低い流れ特性および実質的に高い非特
異的相互作用を保有する重合体充填物を使用する。
斯くして、含浸若しくは重合体被覆材料の不存在で、分
離しようとする成分に対し非特異的相互作用をほとんど
又は全く示さず、またシリカの優れた流れ特性を保持す
るシリカ担体の調製方法が要望されている。加えて、今
日用いられている標準オルガノシラン賦活シリカよりも
高いｐＨ安定性を有するシリカ担体の調製方法が要望さ
れている。
上記目的に対して、本発明者等は、糖分子にみられる如
く、すべてでなくともいくつかのヒドロキシルが著しく
接近し、またｃｉｓ−配置にあるその多くのヒドロキシ
ル官能基を以てシリカ粒子が「ポリオール」とみなしつ
ると仮定した。
式２に例示される如く炭水化物ホスフェート化学の応用
により、リボースの如き１．２−ｃｉｓ　−ジオールに
求核物を導入しうることは知られている。
求−ノ （Ｎｕ　＝求核物） 斯くして、本発明者等は、式３で例示される如く、同じ
一般的化学を用いてシリカ表面に求核物を導入しつると
仮定した。
式　　３ ０キシル化材料の改質を包含すべく敷折することができ
る。
光貝Ｏｔａ要 それ故、本発明は、表面に複数のヒドロキシル基を有す
る有機若しくは無機主鎖を含むポリヒドロキシル化材料
であって、該ヒドロキシル基の少なくとも１個の前方部
位における上記主鎖への求核配位子の直接共有結合によ
り改質されている材料に関する。本発明はまた、斯かる
材料の製造方法であって、（ａ）表面に複数のヒドロキ
シル基を有するポリヒドロキシル化重合体材料と、該ヒ
ドロキシル基の少なくとも一つのＯ−Ｈ結合を開裂し且
つ求核置換に服しやすい成分を一〇−結合を介して導入
するのに有効な試薬とを反応させ、そして（ｂ）工程（
ａ）の生成物を求核配位子と反応さぜることを含む方法
に関する。
口の言　な言明 任意のポリヒドロキシル化材料の表面を改質させるのに
、すなわち該材料表面に求核物を直接斯かる化学は実際
にクロマトグラフィーに適した求核物を導入するのにシ
リカの表面で用いられうることがテストによって示され
ている。有利にも、このように調製された材料において
、求核物は主鎖のけい素原子に直接共有結合され、標準
オルガノシラン賦活シリカに生じる酸−塩基−過敏性Ｓ
　１−０−Ｓ　１−Ｎｕ結合（式１）よりも安定なＳ　
１−Ｎｕ結合（式３）を生成する。斯くして、今日まで
シリカクロマトグラフィー担体を用いる上で固有の主要
な問題の一つが排除される。
しかしながら、これは、単なるシリカ材料の改質よりも
はるかに広い意味を有する。もしも、シリカ担体の表面
上のヒドロキシル官能基の少なくとも一部が著しく接近
しまたｃｉｓ−配置にあるなら、そして上記の事柄がこ
の仮定を支持しているなら、他のポリヒドロキシル化担
体材料の表面上のヒドロキシル官能基の少なくとも一部
も亦そのように配列していると仮定されつる。斯くして
、上記の賦活／求核置換化学は、本明細書中に記載の如
く例示される様々な態様での多種のポリヒト共有結合さ
せるのに、本明細書に記載の方法を使用しうることがテ
ストによって示されている。ポリヒドロキシル化とは、
表面に複数のヒドロキシル基を有する材料を意味する。
しかしながら、本発明で用いられる種々の表面積を有す
る好ましい材料は、ヒドロキシル基をわずかな２個より
もはるかに過剰で有する。ヒドロキシル基の少なくとも
一部は担体材料の表面になければならず、例えば選定さ
れたクロマトグラフィー法に用いられる移動相の成分に
近づきやすくなければならない。
本明細書中、用語「主鎖」は、ヒドロキシル基が結合し
ているポリヒドロキシル化材料の主要構造を意味するの
に用いられる。本発明の範囲に含まれるポリヒドロキシ
ル化材料の例として、シリカおよびガラスの如き無機主
鎖を持つもの、ヒドロキシル化ポリスチレン／ポリビニ
ルベンゼンの如きアクリル樹脂を含む有機主鎖を持つも
の、セファロース、セルロース、アガロース、デキスＩ
〜ランの如き多糖類およびシクロデキストリンの如きオ
リゴ糖類が挙げられる。好ましい担体材料であるシリカ
は、粒子、任意寸法ないし形状のビーズ又はブロックを
含む多くの形態で用いられ、或は任意種類の紙材に含浸
せしめられつる。同様に、ガラスは粒子、ビーズ、チュ
ーブ、プレト、ウール、繊維、細管、紙又は含浸ガラス
繊維紙の形態で用いられつる。
ポリヒドロキシル化材料は、ポリヒドロキシル化材料の
意図された用途に必要とされる特性を有する求核配位子
の表面に直接共有結合することによって改質ないし賦活
される。用語「直接」結合は、エーテル結合を生じるヒ
ドロキシル酸素原子を介してよりもポリヒドロキシル化
材料の「主鎖」と求核配位子そのものの原子との間の結
合であることを意味する。本発明は、事実上求核物（す
なわち電子対供与体）でなければならないほかは配位子
の種類によって限定されない。例えば、もしも重合体材
料が親和性クロマトグラフィーの固定相として使用すべ
く企図されるなら、配位子は、クロマトグラフィーに付
される混合物中の成分と選択的に相互作用し、それにょ
って後続溶離のためその成分を固定相の表面に保持する
ことのできる拐料でありうる。本発明に従って改質され
るポリヒドロキシル化重合体材料の有用性および使用し
うる求核配位子の種類に関する他の無数の例がある。こ
れらの例として下記のものが含まれる： ポリブレン又は蛋白質色素の如きリキッド、ガス若しく
は気体流れ技法によるアミノ酸配列に有用な任意の化学
薬品、試薬基ないし材料或は蛋白質ペプチド固定化およ
び固体相配列に有用な官能基の共有結合。
電気泳動若しくは他の移動に有用な任意の化学薬品、試
薬基ないし材料の共有結合。斯かる基は分解しつる酸、
塩基不安定性ジスルフィド又は他の官能基を含有しつる
。例として、通常クロマトグラフィー、ポリブレン又は
蛋白質色素と関連づけられるジエチルアミノエチルアミ
ン、カルボキシメチルアミン、脂肪族ないし芳香族化合
物がある。
診断若しくは臨床目的に有用なポリヒトロキシル化材料
への任意の材料、試薬、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は化
学薬品の共有結合。例として、インビトロ若しくはイン
ビボでの免疫検定又は可視化用材料の小粒子への結合が
ある。
オリゴヌクレオチド若しくはペプチドないし蛋白質合成
、検出又は精製のための任意の化学薬品、試薬基、自然
産物、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡの共有結合。
任意用途向は酵素例えば蛋白質分解ないし合成酵素の固
定化。
任意用途向けＤＮＡ、ＲＮＡ又はヌクレオチドの固定化
。
任意用途向は抗原、抗体、抗体結合性蛋白質又は任意の
蛋白質ないしペプチドの固定化。
任意用途例えば分析目的、インビトロ若しくはインビボ
診断学、治療学又は任意の技法ないし電子顕微鏡による
分離された任意物質の検出目的に十分小さな粒子上での
色素（蛍光、着色、放射性、電子音、等）の固定化。
インビトロ若しくはインビボ診断学で特異的部位への薬
物放出又は標識強化用マーカーの放出の如き任意用途向
は材料、化学薬品、試薬、色素又は薬物の任意混合物を
含有する共結合ないし多結合粒子の形成。別の例示例は
、電子鏡検法、蛍光鏡検法、抗原ハブテン結合、免疫刺
激ないし抑制用抗体産生細胞、並びに診断学、薬物放出
、精製又は検出方法を含む任意用途向は任意物質の電磁
粒子への共有結合である。
親水性態様で疎水性材料を挙動させる該材料の固定化。
例として、外部増感スクリーンの交換用又はラジオフロ
ー検出用電気泳動ゲルに含まれる放射性発色団の固定化
が含まれる。
任意用途向は単糖類、三糖類又は多糖類への材料の結合
。該材料にはシクロデキストリン又は任意の分子量およ
び組成のポリオールが含まれる。例えば、薬物放出およ
び診断のため結合される材料として非制限的に配位子、
薬物、抗体、抗原、任意種の色素、任意種の特異的マー
カー、抗生物質および成長因子が含まれる。この方策（
又は実験上必要なら別の結合化学）を用いて、部位方向
分子と任意目的のため放出される官能価分子とのブリッ
ジとしてシクロデキストリン、単糖類、三糖類又は多糖
類を用いることができる。これらの分子は任意目的で個
々に或は任意の組合せないし割合で錯形成されつる。こ
の方策は、リボゾームを用いて放出用材料をパッケージ
し、また限られた数のケースで部位方向分子を用い共有
若しくは非共有相互作用により表面を被覆する従来法と
は実質的に異なる。
糖蛋白質（又は該糖蛋白質を含有する試料）と、糖蛋白
質上のヒドロキシル基少なくとも一つのＯ−Ｈ結合を開
裂し且っ求核置換に服されやすい成分を、−０−結合を
介し導入するのに有効な試薬（例　ホスホリル化剤）と
の接触後フルオレセイン、ダンジルアミン、ロダミンお
よびこれらの誘導体の如き求核、蛍光若しくは放射性色
素との反応による糖蛋白質の検出。このようにして、検
出可能な色素が糖蛋白質に結合することにより、後者の
検出か可能になる。
上記応用は典型的なものにすぎず、これらの叙述は本明
細書に記載された化学の適用の可能性を限定するもので
なく、むしろその化学の広い適用性および可転性を例示
するものである。
本発明の改質ポリヒドロキシル化重合体担体の別の例と
して、下記のものが」二足種々の応用のいずれかにおい
て改質担体上に固定されつるターゲットの例であるニ ゲリシン、ゼラチン、フコース、Ｎ−アセチルグルコサ
ミン、Ｄ−Ａ　１　ａ−Ｄ−Ａ　ｌ　ａ、アデノシン−
３゛、５°一環式モノホスフエート、アデノシン５゛−
モノホスフェート、アラニン、ε−アミノカプロイルグ
ルコサミン、ベンズアミジン、ω−アミノオクチル、ｐ
−アミノフェニル−２−アセトアミド−２−デオキシ−
β−チオグルコピラノシド、ｍ−アミノフェニルはう素
酸、ｐ−アミノフェニル−α−ガラクトピラノシド、ω
−アミノプロビルエボキシド、アビジン、ビトン、ブル
ーデキストラン、メチル、クロロアンフェニコールカプ
ロレート、コリン酸、コレステリルヘミスフシネ−１・
、補酵素−Ａ、コンカナバリンＡ（レクチン）、システ
アミン、シチジン５゛−モノホスフェ−１・、ヘモグロ
ビン、ヘパリン、Ｓ−ヘキシルグルタチオン、小麦胚芽
凝集素、ウリジン２′５°および３°、５゛−ジホスフ
ェート、ウリジン５°−モノホスフェ−１・、トリデル
、］・リプトフファン、ヂロシン、チロキシン、セリン
、スペルミン、オリゴｄＴ、蛋白質Ａ、プロタミン、ポ
リリボイノシン酸、ポリリシン、０−ホスホリルエタノ
ールアミン、ホスホジェステラーゼ３°、５°一環式ヌ
クレオチド活性剤、オクチル、α−メチルマンノシド、
インシュリン、ヒスデシン、α−ラクトアルブミン、β
−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、β−ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、α−ラ
クトース、（＋）メリビオーゼ、トリプシン抑制剤、Ｎ
−ヒドロキシスクシンンイミド、イミダゾリルカルバメ
ート又はカルボニルイミグゾール成分、アラキドン酸、
ポリミキシン（内毒素除去）、７．７−シメチルエイコ
サジエン酸、アクビシン（ＡＴ１２５）（γ−グルタニ
ルタランスベプチダーセの不可逆抑制剤）　フレグレラ
ーテ（Ｕ６３５５７Ａ）（トロンホキサンＡ２シンター
ゼ抑制剤）、ドパミン拮抗物質、旋光性異性体の分割用
キラル配位子、イミノジ酢酸（金属キレト）、ポリオキ
シン、ｐ−アミノベンズアミジン、オクタデシル、シブ
ラコンブルーＦ３Ｇａ、アミノアリール、８−ヒドロキ
シキノリン、プロキオンレッドＨＥ３Ｂ、（Ｎａ−ＣＢ
Ｚ）　−Ｄフェニルアラニン、ポリ−（Ｌ−リシン）、
ヒスタミン、メトトレキセート、ペプスタチン、ケクン
セイン、Ｌ−（＋）酒石酸、セロントニン、フェツイン
、β−エストラジオール１７−ヘミスクシネート、グリ
シル−し−チロシルアゾベンジルこはく酸、デオキシコ
リン酸、ジアミノジプロピルアミン、デキストランサル
フェート、ｐアミノベンジルホスボン酸、２−アミノエ
チルジ水素ホスフェート、ｐ−アミノフェニルホスロリ
ルコリン、はう素酸、ｐ−クロロメルクリベンゾエート
、Ｎ−アセチル−Ｄ、Ｌ−ホモシスティン、Ｌ−アラニ
ル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン、ｐ−アミノベンズア
ミジン、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン
、保護ピリミジン若しくはプリン塩基を有する３°−環
化デオキシリボース（オリゴデオキシヌクレオチド合成
担体）、蛋白質Ｇ、ポリブレン、メリチン、ジエチルア
ミノエチルアミンおよびコオマシエブル」二に列挙した
如きターゲットを固定するために本発明に従ってポリヒ
ドロキシル化担体材利の表面に導入することのできる多
くの求核配位子は概ね斯界に知られている。親和性クロ
マトグラフィーによる生体分子精製に群選択的ないし多
特異的配位子を用いることができる。群特異的配位子の
例としてレクチンおよび色素がある。コンカナバリンＡ
若しくは小麦胚芽凝集素の如きレクチンは、糖蛋白質の
炭水化物部分の特徴的糖残留物に結合する蛋白質である
。種々の給源からの多くのレクチンは異なる糖結合特異
性を以て同定されてきた。固定レクチンに結合した糖蛋
白質は適当な自由競争性の糖で溶離されつる。脱水酵素
、キナーゼ、ベプチターゼおよびホスファターゼの如き
酵素又は成長因子を必要とするヌクレオチドと選択的に
相互作用するいくつかの色素が見出されている。かかる
相互作用の性質は理解されていない。より高い選択性形
態の親和性クロマトグラフィーは固定化された蛋白質Ａ
、蛋白質Ｇ、種々の抗原、抗体又は抗抗体を用いる。こ
れらの方法は通常、免疫親和性クロマトグラフィーと呼
称される。オリゴヌクレオチド結合性色素などの如き固
定化材料はＤＮＡおよびＲＮＡの分離に用いることがで
きる。薬理学的配位子および毒素の如き、より高い特異
性配位子は神経伝達物質およびホルモン受容体の親和性
クロマトグラフィーに用いられてきた。
上首尾の親和性クロマトグラフィーで、配位子生体分子
相互作用は、保持および溶離を許容するのにＫｄが１〜
１１００ｎオーダーであるべきである。配位子の固定化
に適当な基は、特異性若しくは親和性の点で妥協するこ
となく有効であるべきである。樹脂の相互作用は質量作
用速度論に従うので、反応は、精製すべき生体分子の濃
度を高めることにより前進せしめられる。しかしながら
、絶対解離定数（Ｋｄ）は生体分子−配位子系の特性を
示す。吸収された種は典型的には、配位子−成分濃度お
よび系Ｋｄに従い解離および再解離する固定化配位子と
平衡結合状態にある。配位子の濃度は通常、精製すべき
材料よりも著しく過剰である。配位子の固定化は、立体
障害により或は結合化学を介して、観察される親和性を
高めたり或は低めたりできる。
生物学上特異的な溶離は、試料が樹脂より解離するとき
、再相互作用を防止することによって結合成分に対する
親和性の、より高い或は同様の配位子を（より高い或は
同様の濃度で）用いることにより達成されつる。これら
の条件下で、精製成分はカラム内に或はバッチ溶出液中
に収集される。成る場合には、固定化配位子に対する試
料の親和性は、アロステリック調節剤、改質剤又は移動
相の変化にＪ：り増減しつる。かかる性質の益は、親和
性樹脂からの溶離および結合の双方で得ることができる
。溶離性配位子は、透析、ゲル濾過又はもう一つのクロ
マトグラフィー工程によって取出される。成る場合には
、試料−配位子親和性は、生物学上特異的な溶離が僅か
に痕跡量の材料を生じる如きものである。試料の回収に
変性剤例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）又は尿
素或はイオン強度ないしｒ）Ｈ上の変化を用いることか
できる。注意しなければならないのは、この方法が樹脂
、特に固定化レクチン若しくは抗体、蛋白質Ａ又は蛋白
質Ｇの性質を変えないということである。
ポリヒドロキシル化担体材料の表面に求核配位子を直接
共有結合させることに含まれる第一工程は、Ｏ−Ｈ結合
の開裂および求核置換に服されやすい部分の導入による
材料表面上のヒドロキシル基の少なくとも一部の「賦活
」を包含する。これは、燐酸誘導体又はオキシ塩化燐の
如きホスホリル化剤、塩化スルホニル誘導体の如きスル
ホン化剤および後述の如き他の〇−誘導化剤よりなる群
から選ばれる剤をポリヒドロキシル化１ＪＩｌに接触さ
せることによって達成される。このようにして、ヒドロ
キシル水素は、燐酸エステル、環式ホスフェート、環式
酸無水物等の如き求核置換に服されやすい成分と置換さ
れる。使用することのできる試薬および、それによりポ
リヒドロキシル化材料の表面にヒドロキシル酸素との結
合を通して導入される部分の例は下記の如くである：試
薬 塩化ホスホリル 叶 Ｈａｔ−Ｐ−３Ｏ□ＯＨ Ｃｌ５Ｏ２−Ｐｈ−ＣＨ３ ＣＩｓＣＣＮ）ＩＣＯＣＩ Ｉ Ｆ３ＣＣＬＳＯ□Ｃ１ ＣＨ３ 部−一分 −ｐ　（ｏ）　３ −ｐ　（ｏ）　（ｏ旧ＳＯ□０■ ＳＯ□−Ｐｈ−Ｃ１１３ ＯＣＮＨＣ（０）ＣＣＩｓ −３Ｏ，Ｃ）１２ｃＦ。
Ｃ１（３ 評価すべきは、ここに特に列挙したものから誘導される
、求核置換に服されやすくまた、本発明での使用時担体
材料表面上の０−Ｈ結合を開裂しつる構造部分が見出さ
れ得たということである。斯かる部分をすべて列挙する
ことは不可能なので、ここに示したリストは全部を網羅
するものではない。本発明は、ここに列挙した部分と同
じようにして機能する構造上関連した他の部分の使用を
包含するのに十分広いとみなされる。
好ましい具体化において、ポリヒドロキシル化材料はホ
スホリル化される。これは、斯界で一般に知られている
ホスホリル化により達成されつる。好ましくは、ポリヒ
ドロキシル化材料を無水の条件下で、ピリジンの如き有
機塩基および、塩化ホスホリルの如きホスホリル化剤と
接触させる。反応は傾向として発熱性である。ホスホリ
ル化剤の除去および好ましくは有機塩基およびアルコー
ルによる洗浄後、ホスホリル化材料はそのまま求核配位
子の導入に供される。
求核配位子の導入は、適当な反応条件下、ホスボリル化
ないし他の方法で「賦活」されたポリヒドロキシル化担
体と求核配位子とを接触させることにより達成される。
斯かる条件は、選ばれる求核によって異なるが、しかし
一般に求核置換反応はかなり容易に生じ、何ら異常な反
応条件を必要としない。
本発明の材料および方法並びにその実用性については更
に下記例で例示されるが、これらの例は本発明の範囲を
限定するものではない。
例１および例３に記載の反応を式４に例示す式４ １−クロマトグラフィー用シリカ担　の製造シリカ（２
００μ、気孔寸法２００人）１００ｇをＨＣ，９（０，
６Ｎ）２００ｍｊ２と共に手動で規則的な間隔で攪拌し
、−晩装置した。蒸留水１０，０００ｍＩ２でデカンテ
ーションによって洗浄し、シリカを真空中での濾過によ
って採集し、６０℃において７日間乾燥させた。収量８
０ｇ０シリカ５０ｇをピリジン３００ｍ℃で処理し、厚
いスラッジが後に残るまで真空中でピリジンを留去した
。室温に冷却した後に、過剰量（５０ｍ℃）の塩化ホス
ホリルを添加し、この溶液を規則的間隔で攪拌した。こ
のフラスコを６０’Ｃに７日間放置し、シリカを真空中
で濾過し、ピリジンで洗浄した。洗浄後、このシリカを
大過剰量（５０００ｍで）のメタノールと共に激しく攪
拌し、メタノール中に一晩放置した。濾過によって改質
シリカ（Ｉ）が回収された。
分析　実測値　Ｐ　　Ｌ、０８％： ＦＴ−ＩＲ（Ｋ、Ｂｒ） １１０５ｃｍ−’　（Ｐ＝Ｏ及びｐ−ｏ伸縮）。
Ｂ　シスタミンとの「応 ホスホリル化シリカ（Ｉ）５ｇをシスタミン７ｍ、９と
混合し、６０℃において一晩放置した。
このスラリーにエタノール５０ｍｊ２を添加し、ゆっく
り電磁攪拌しながら６時間還流した。反応したシリカを
大過剰のエタノールで洗浄して、シスタミニル化シリカ
（ＩＴ）４ｇを得た。
分析・実測値； Ｃ１２，３２、Ｈ，０，６２、Ｎ、１．６０％Ｃ，シス
タミン−シリカのトシル シリカ（ＩＩ）２ｇを４−ペンテン−１−〇−トシレー
ト含有アセトニトリルと共に室温において一晩攪拌した
。濾過し、アセ１−二トリルで洗浄して、明黄色の生成
物（ｍ）を得た。
分析：実測値； Ｃ１２，０８，Ｈｌｏ、５１＋Ｎ、０．６７％Ｄ、シリ
カＩ■のオレフィン部分のエポキシド化４−ペンテン部
分を含有するシリカＩＩＩ　２　ｇをｍ−クロル過安息
香酸２ｇを含有するクロロホルム５０ｍｊ２中で攪拌し
、濾過し、クロロホルムで充分に洗浄して、所望のエポ
キシ環を含有する最終担体（ｒＶ）を得た。
分析・実測値。
Ｃ，４，２４；Ｈ，０，７５、Ｎ、０．１５％ホスホリ
パーゼ酵素は各種エイコサノイドのプロインフラマトリ
−（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｒｙ）産生における鍵と
なる役割を果たし、種々の調節機構を受けるということ
が示されている。最近１０年間でホスホリパーゼ及び酵
素活性を調節する蛋白質の単離及び特性付けにおいて進
歩があった。ステロイド誘導性の哺乳動物の蛋白質「リ
ボコルチン（Ｉｉｐｏｃｏｒｔｉｎ）　Ｊｌが同定され
、単離され、ホスホリパーゼＡｚ　　（ＰＬＡｚ）活性
を抑止することが示唆された。メリチン（蜂の毒液、分
子量２８００のペブヂド）がＰ　Ｌ　Ａ　ｚ活性を刺激
するということが示された。本発明者は抗メリヂン抗体
を用いて、哺乳動物系供給源からＰ　Ｌ　Ａ　２刺激性
蛋白質（ホスホリパーゼ活性化蛋白質又はＰＬＡＰと称
する）を単離した。この研究は、シラン化学物質又はＣ
ＮＢｒ活性化アガロースによって製造されたシリカ親和
性カラムを用いた。実質的には、アガロースを用いた場
合よりも、シリカを用いた場合に、より良好な精製度が
得られた。商品として入手可能なオルガノシラン活性化
シリカは、用いられる僅かにアルカリ性のｐＨ条件下に
おいてより低い安定性を示した。オルガノシラン活性化
シリカにとって最適であると言われている１ｏμの粒子
寸法もまた、用いられる生物学的抽出物との適合性に乏
しい。従って、非常に少ない回数の操作の後にカラム付
着が起こる。本明細書に開示された新規のクロマトグラ
フィー担体を用いたＰＬＡＰの分離を以下に記載する。
グルタルアルデヒド架橋メリチンに対してウサギ多クロ
ーン性抗体を調製し、シリカ■担体に固定化されたメリ
チンを用いて親和性精製した。
この親和性精製された抗体を次いて同様のシリカに固定
し、培地中で成長させた哺乳動物の細胞から交差反応性
物質を単離するために用いた。刺激活性は、細胞のない
超音波処理物を含有する反応において観察される活性と
親和性カラムからの留分に関連する内因性活性との間の
差として定義した。活性の一つの単位は、細胞のない超
音波処理物１　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ａについて見出された
観察されたＰ　Ｌ　Ａ　２活性において二倍の増加をも
たらすのに必要な精製蛋白質の量として定義した。抗メ
リチンカラムから回収された留分の溶出及び分析はＰ　
Ｌ　Ａ　２を刺激することのできる物質を示した。
最少のカラム付着が起こり、同様の実験において、培養
した細胞１６℃からの抽出物は、カラム背圧の見掛は上
の増大又は性能の損失なしにクロマトグラフィー分析す
ることができた。このことは、当技術分野における実質
的な改善を示す。
２０μの寸法のシリカ■の性能のオルガノシラン活性化
２０μシリカとの比較は、シリカＩＶについて実質的に
優れた性能を示した。
及辰註珊 燐酸塩緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ７，５）中の合成メリ
チン約１ｍｇを、毎分０．２　ｍ℃で２５℃において一
晩再循環させることによって、４．６ｍ、　ｍ　Ｘ　７
．５　ｃ　ｍのシリカ■カラム（アセトニトリル中のカ
ラムの手動充填によって製造）に固定化した。再循環物
のスペクトル分析は適用メリチンの９５％固定化を示し
た。燐酸塩緩衝塩水で洗浄した後に、抗メリチン抗血清
２ｍ℃をこのカラムに毎分０．２　ｍ　ｆｌにおいて適
用した。洗浄後、結合した抗体をｐ　Ｈ３，０の１００
ｍＭグリシンで溶出させた。留分を採集し、燐酸塩緩衝
液でｐＨを７．５に調節した。ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル分析は精製調製物中にＩｇＧの重い鎖及び軽い鎖
のみを実質的に示した。
ＰＬＡＰの　０生 ＰＢＳ中の親和性精製したメリチン抗体をシソカ親和性
カラム上上に、このカラムに親和性精製抗体溶液（３０
０μｇ／ｍｌ）　　１　ｍｔ２を一晩再循環させる（毎
分０．１ｍｎ）ことによって固定化した。トウィーン２
０　（Ｔｗｅｅｎ）　０．０５％を含有するＰＢＳを用
いてカラムを充分に洗浄した。次いでプロテアーゼ阻害
因子弗化フェニルメチルスルホニル（１，０ＡＬＭ）、
バシトラシン（ｌ　ＯＯＬＬｇ／ｍＩ２．）、ベンズア
ミジン（１ｍＭ）及び大豆ｌ・リプシン阻害因子（５μ
ｇ／ｍ　Ａ　）並びにトウィーン２００．０５％を含有
させたＰＢＳでこのカラムを平衡させた。次いでこのカ
ラムに細胞の超音波処理物を毎分０．１　ｍ℃で通過さ
せた。この細胞の超音波処理物は、次のようにして調製
した。１５０ｃｒｒ１１の５個のコーニング組織培養フ
ラスコ［米国ニューヨーク州のコーニング（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ）社］から対数的に成長させた細胞を取り出し、遠
心分離（５００Ｇにおいて５分間）によって濃縮した。
１０ｍＭへベス（Ｈｅｐｅｓ）プロテアーゼ阻害因子（
１０μｇ　／　ｍ℃大豆トリプシン抑制因子、１ｍＭベ
ンズアミジン、１００μｇ／ｍｆ２バシトラシン及び１
０μＭ弗化フェニルメチルスルホニル）及び洗浄剤（０
，０５％トウィ〜ン２０．０．０４％ＳＤＳ及び１ｍＭ
デオキシコール酸塩）を含有させたパックス・ザリーン
（ＰｕｃｋｓＳａｌｉｎｅ）　Ｆ　（米国ニューヨーク
州のＧｒＢＣＯ社）１ｍβ中に細胞を再び懸濁させ、ブ
ランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）超音波処理器を用いて迅速
に超音波処理した。超音波処理物をミクロヒュージ（ｍ
ｉｃｒ。
ｆｕｇｅ）中で室温において２０分間遠心分離して、得
られた上澄み液を０．２μｍミリボア・フィルター（ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ　ｆｉｌｔｅｒ）　　［米国マサチュ
ーセッツ州のミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社コに通
過させた。
濾過した超音波処理物を毎分０．１　ｍ　ｆｌにおいて
抗メリチン抗体カラムに通過させた。このカラムを毎分
２ｍβにおいて３０分間洗浄し、次いでｐ　Ｈ３，１の
５０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いて溶出させた。留分０．
５　ｍ　１２を採集し、使用するまで７０℃において冷
凍貯蔵した。
適宜な基剤を用いてホスホリパーゼＡ２及びホスホリパ
ーゼＣ活性を放射分析で測定した。反応は、慣用の方法
に従ってｐ　Ｈ９，０の２００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）
緩衝液で緩衝した。第１図において白丸の曲線は内因性
活性を示す。黒丸は刺激活性を示す。
Ｂ、ホスホリパーゼＣの精製 ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）とは、燐脂質の極性頭基を
分解してジアシルグリセリドを生成せしめる酵素の類を
意味するのに用いられる用語である。リウマチ様関節炎
の患者からの末梢血液単球及び多形核白血球は対照用細
胞と比較して高められたＰＬＣ活性レベルを示す。高め
られた活性は基剤としてのホスファチジルコリン（ｐｃ
）を好む。微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓは基
剤としてｐｃを好むことが示された。本発明者は以前に
、哺乳動物のＰＣを好むＰＬＣ酵素を単離するために、
抗バクテリアＰＬＣ抗体及びシラン活性化シリカ親和性
カラムを用いた。開示されたシリカ■担体を用いた同様
の精製を以下に記載する。
ＰＣを好むＰ　Ｌ　ＣＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ
に対してウサギ多クローン性抗体を調製し、シリカ■に
固定化された抗原を用いて親和性精製した。この親和性
精製された抗体を固定化し、培地中で成長させた細胞又
はヒトから取り出した細胞からの哺乳動物の交差反応性
酵素を精製するために用いた。
特に、親和性精製された抗体約６００ｍｇをシリカ■カ
ラム上に固定化した。Ｕ９３７細胞、約１０８個の細胞
を超音波処理し、カラムに適用した。このカラムを次い
で溶出させ、得られた留分を基剤としてホスファチジル
イノシト−ル及びホスファチジルコリンを用いてホスフ
ァリパーゼＣ活性について分析した。第２図に示したよ
うに、この操作は哺乳動物のＰＣを好むＰＬＣの回収を
もたらした。
抗　産生　び　製　　ニ細 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓから単離しされホスフ
ァリパーゼＣはベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社（米国インデイアナ
州）から得られ、グルタルアルデヒド（３％、容量／容
量）を用いて室温において３０分間架橋させた。抗原（
１注人当たり２０００単位）を同じ容量のＦｒｅｕｎｄ
ｓ抗原性補強剤と混合し、２週間間隔てニューシーラン
ト白ウサギの多くの部位に皮下注射した。このウサギを
二回目の注射の３〜４日後に採血し、この血液を４℃に
おいて一晩凝固させた。翌日、血清を取り出し、硫酸ア
ンモニラムを用いた沈殿によって免疫グロブリン留分を
富ませた。次いで前記のシリカＩＶを用いて親和性精製
抗体を調製した。
Ｐ　Ｌ　Ｃの　和　クロマトグラフィー　　　・細簡潔
に、ｐ　Ｈ７，２の燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）（米国ニ
ューヨーク州のＧＩＢＣＯ社）２ｍＩ２中の親和性精製
抗体３００ＬＬｇをシリカ■のカラム中に毎分０．２　
ｍρにおいて一晩循環させた。翌日、とのカラムを０．
０５％トウィーン２０含有ＰＢＳを用いて毎分２ｍ℃に
おいて充分に洗浄した。細胞を遠心分離（２０００Ｇに
おいて５分間）によって濃縮し、０．０５％トウィーン
２０及びプロテアーゼ阻害因子を含有するＰＢＳ２ｍβ
中に再び懸濁させ、超音波処理した。プロテアーゼ阻害
因子は、次のものを含有する： 弗化フェニルメチルスルホニル（１０μＭ）、バシトラ
シン（１００ＬＬｇ　／　ｍ　１２　）　、ベンズアミ
ジン（］ｍＭ）及び大豆トリプシン阻害因子（５ｔｔ　
ｇ　／　ｍ　ｆｌ　）。この細胞のない超音波処理物を
次いでミクロヒュージ中で遠心分離 （１３，０ＯＯＧにおいて２０分間）し、上澄み液を０
２μｍフィルター［米国マサチューセッツ州のミリポア
社］に通して濾過した。炉液を抗ＰＬＣ抗体親和性カラ
ムに通過させた（毎分０．１ｍ℃）。移動相は０．０５
％トウィーン２０含有ＰＢＳから成る。次いてこのカラ
ムを同じ移動相を用いて毎分２ｍβにおいて１０分間洗
浄し、結合物質をｐ　Ｈ３，１の５０ｍＭ酢酸ナトリウ
ムを用いて流速毎分０．５ｍ℃において溶出させた。１
０ｘＰＢＳ２００ＬＬｊ２及びグリセロール４００μ℃
を含有させた管中に留分２ｍ℃を採集した。
３−逆　クロマトグラフィー　シリカの　゛６逆相高性
能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は多くの物質の
分離に十分受入れられる技術である。本明細書に記載さ
れた化学物質を用いて、２０μ、気孔寸法２００人のシ
リカ上に数種の典型的な結合相を調製した。これらの粒
子寸法及び気孔寸法は逆相ＨＰＬＣ分離のためには最適
ではないが、化学的方法を確認するためにこの物質を用
いた。
Ａ、Ｃ−１，８び０〜１１部　を　っシリカ痕跡量のピ
リジンを含有する５ｇのシリカ■を無水エタノール２０
ｍ℃で処理した。この混合物を機械的に攪拌し、オクタ
デシルアミン５ｇを添加し、６０℃において６日間反応
させた。最後にこの溶液を６時間還流し、濾過した。固
形分をメタノール、エタノールで洗浄し、乾燥させて、
Ｃ−１８単位を持つ所望のシリカ（ｖ：式４）を得た。
分析：実測値： Ｃ，１，５９；　Ｈ，０，５５；　Ｎ、　０．０２％Ｃ
−１１単位を持つシリカを製造するために、オクタデシ
ルアミンの代わりにウンデシルアミンを用いて、所望の
シリカＣ−１１製品（ＶＩ；式４）％式％： シリカＶ及びＶＩを当分野の技術に従ってキャップし、
４．６　ｍ　ｍ　Ｘ　７．５　ｃ　ｍのカラムを１００
％アセトニトリル中で手作業で充填した。
移動相は０．１％トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）及び８０
％アセトニトリルである。商品として入手できるＨＰＬ
Ｃ系を用いて当分野の技術に従って溶媒勾配を作った。
試料はチトクロームＣ１血清アルブミン、チトクローム
Ｃトリプシンペプチド、インシュリン及びＢａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　Ｐ　Ｌ　Ｃである。二極管配列紫
外線吸収又は２１４ｎｍにおける固定化波長検出によっ
てピークを検出した。
４、６　ｍ　ｍ　Ｘ　７．５　ｃ　ｍのシリカ■のカラ
ムを用いて得られた結果を第３図に示した。適用成分は
チトクロームＣトリプシンペプチド、インシュリン、チ
トクロームＣ及びＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ　Ｐ
　Ｌ　Ｃである。緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡである。緩
衝液Ｂは８０％アセトニトリルである。毎分１．５　ｍ
　１２の流速において５分かけて２０〜１００％のＢの
直線勾配を用いた。同じ試料をｐ　Ｈ９，５の水酸化ア
ンモニウム８００ｍ℃でカラムを１６時間洗浄した後に
クロマトグラフィーにかけた（第４図）。また、シリカ
Ｖを用いて同じ混合物をクロマ１−グラフィーにかけた
（第５図）。シリカＶ上での芳香族アミンの分離を第６
図に示す。
例４−非シリカ担体の製造 この例に記載した反応は式５に例示される。
Ａ　ホスホリル化による活 フラクトゲル（Ｔｏｙｏｐｅａｒ１社製のヒドロキシル
化ポリスチレン／ポリビニルベンゼン、ＴＳＫ　）ＩＷ
６５　　：　３２〜６３ｕ）５００ｍｆ２を濾過し、得
られたケークを希塩酸と共に攪拌し、−晩装置した。蒸
留水５０００ｍρ及びメタノール２０００ｍｆ２でデカ
ンテーションによって洗浄した後に、濾過によってゲル
を採集し、６０℃において６日間オーブン乾燥させた。
次いでゲル５０ｇをピリジン３００ｍｆ２と共にスラリ
ーにし、スラッジが後に残るまで真空中でピリジンを除
去した。このフラスコをドライアイス浴中で冷却し、塩
化ホスホリル５０ｍｆｆを激しい反応を回避するために
ゆっくり添加した。このフラスコを６０℃に２日間放置
した。ピリジン、メタノール、メタノール−水及びメタ
ノールで洗浄して、活性化フラクトゲル（１）４．０ｇ
を得た。
分析：実測値： Ｈ，６，０５・Ｎ、　１．１４　、　Ｐ、　２．０％Ｂ
、シスタミンとの　応 活性化フラクトゲル（１）５ｇをシスタミン５ｍｊ２と
混合し、得られたスラリーを６０℃で一晩放置した。無
水エタノール５０ｍＩ２．を添加し、この混合物を一晩
還流させた。メタノールで洗浄した後に濾過することに
よって、黄色生成物（２）が回収された。
分析　実測値 Ｃ，４２，０９、Ｈ，５，７８；Ｎ、３．０９％Ｃ，ジ
アミノジフェニルジスルフィドとの　応シスタミンにつ
いて記載したようにして活性化フラクトゲル（１）５ｇ
をジアミノジフェニルジスルフィド５ｇと反応させた。
最終生成物３は分析で下記の結果を示した・ Ｃ，５１，４２，Ｈ２６，２８、Ｎ、　２．４７％Ｄ、
オクタデシルアミンとの　応 痕跡量のピリジンを含有するフラクトゲル燐酸塩（１）
５ｇをオクタデシルアミン６ｇと共にスラリーにし、６
０℃において２日間放置した。
このフラスコにトルエン］、ＯＯ＋ｎＪ２を添加し、こ
の混合物を２４時間還流した。次いでこの混合物を濾過
し、ゲルをメタノールで洗浄してフラクトゲルＣ−１，
８（４）を得た。この樹脂をトルエンピリジン中で６０
℃において２４時間、メチルトリメトキシシランでキャ
ップした。
分析； Ｃ１４８，８２、Ｈ，６，２６、Ｎ、、　１．３４％Ｅ
、ジフェニルアミンとの　応 フラクトゲル燐酸塩（１）５ｇ及びジフェニルアミン５
ｇをトルエン−ピリジン（１００：１）で処理し、２４
時間還流した。続いての工程は前記の通りである。最終
生成物のフラクトゲルジフェニルアミン（５）は分析に
よって下記の結果を示した： Ｃ，４９，３６、Ｈ，６，３０：Ｎ、２．０２％Ｆ、　
　ｌ−リメトキシメチルシランとの　窓上で得られたシ
スタミン鎖を持つフラクトゲル２ｇを痕跡量のピリジン
と共にトルエン５０ｍｊ２中で攪拌した。この攪拌溶液
にトリメトキシメヂルシランＯ，］、　ｍ℃を添加し、
２４時間放置した。前記のように濾過し、洗浄して、キ
ャップされたフラクトゲル−シスタミンを得た。
分析： Ｃ，４７，７９・Ｈ，６，６０；　Ｎ、　３．０６％シ
スタミン含有フラクトゲル（１）］、ｇをｐＨ７の燐酸
塩緩衝液で４ｍρに希釈された５０％グルタルアルデヒ
ド１ｒｎＪ２と共にゆっくり攪拌した。室温において３
０分後に、反応混合物を４０℃において４日間放置した
。メタノールで洗浄した後に、濾過によって生成物（６
）が得られた。
分析 Ｃ１５１，１８；Ｈｌ　６．６５．Ｎ、　２．９５％Ｈ
，フラクトゲルー硼酸塩　８　の製造アセトン１．ＯＯ
＋ｎＪＺ中のフラクトゲル誘導体（３）１ｇをカルボニ
ルジイミダゾールで６０℃においで６日間処理した。濾
過及びアセトンによる洗浄ににって生成物（７）か得ら
れた。このイミグゾール含有生成物を１Ｍ炭酸ナトリウ
ム中の同重量のｍ−アミノフェニル硼酸（２０ｍ℃、ｐ
　Ｈ１０）で６０℃において４日間処理した。この溶液
を濾過して、硼酸８００ｍｇを含有する最終生成物（８
）が得られた。
分析： Ｃ，５３，０４・Ｈ，６，３７Ｎ、　２．８０％ＦＴ−
ＩＲ（ＫＢｒ）： ３６００〜３１００　ａｍ−’　（−ＯＨ）１７３４ｃ
ｍ−’　（Ｃ＝Ｏ）。
■、フラクトゲルービオチンの　造 シスタミン鎖を持つフラクトゲル（２）Ｉｇをジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍｆｆ中のビオチンのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル１５０ｍｇで処理した
。反応混合物を室温において６日間攪拌した。この溶液
を濾過し、ＤＭＦ及びピリジンで洗浄した。前記のよう
にしてビオチニル化樹脂（９）をトリメトキシメヂルシ
ランでキャップした。
分析 Ｃ，４８，９３、Ｈ，６，４６、Ｎ、　　３．１４％５
−フラクトゲル　　の　用 ペプチドの合成は、アミノ酸を連続的に結合させて種々
の長さのペプチド鎖を形成させる技術である。伴う化学
反応は溶液中で実施することもできるが、固体相ペプチ
ド合成用にいくつかの系が開発されている。この技術は
固体担体（通常は官能化ポリスチレン）を用い、しばし
ば試薬及び溶媒の自動送出のために特殊装置を用いる。
ペプチド鎖が樹脂上で成長し、弗化水素酸（ＨＦ）又は
トリフルオル酢酸（ＴＦＡ）を用いた合成後にこれから
開裂される。好ましい酸は用いられるアミノ酸の種類に
依存するであろう。ＢＯＣ−アミノ酸はＨＦを必要とし
、ＦＭＯＣ−アミノ酸はＴＦＡを必要とする。治療薬と
して評価するためのペプチド合成に加えて、エピトープ
配列地図の研修、蛋白質の精製並びに生体分子の細胞的
及び生理学的位置確認用の特異的抗体の利用においてペ
プチドの需要が増大してきている。また、分析、診断及
び多くの他の用途もペプチドを必要とする。これらの研
究はしばしば、はとんど又は全く合成能力のない実験室
において実施される。本出願人は、ペプチド製造を簡略
化する試薬を製造することを求めていた。特別な利点は
、樹脂からの開裂の際に強酸を用いる必要がないという
こと及びＨＰＬＣ精製に適合し且つ抗体産生のためのハ
ブテンへの結合が容易である形でペプチドが回収される
ことであろう。
以下、ペプチド合成における誘導されたフラクトゲルの
利用を開示する。出発物質は次の２つの形を与えるシス
タミン含有フラクトゲルである： ・求核置換によって任意のスペーサに結合するためのＮ
　Ｈ２基 ・温和条件下で開裂し得るＳ−８結合。
ペプチド合成のために、合成すべきアミノ酸配列を選択
し、試薬及び溶媒を送出するために自動ペプチド合成機
を用いた。
合成後、樹脂をメタノールで洗浄し、ジチオ１・レイッ
ト又はメルカプトエタノールを用いたＳ−８結合の還元
によって樹脂からペプチドを開裂させた。別法として、
Ｓ−８結合を過蟻酸で酸化させた。また、ペプチド配列
に依存してアセトニトリルのような有機改質剤又はペプ
チド溶解性に必要な洗剤も添加した。（ＨＦ又はＴＦＡ
溶出ペプチドはしばしば、ＨＰ　Ｌ　Ｃ精製に適合する
形で回収されず、酸を除去した後にペプチドは不溶性で
あってもよい）。回収されたペプチドを直接ＨＰＬＣ精
製及び抗体産生のためのハブテン接合にかけた。精製ペ
プチドのアミノ酸組成をアミノ酸分析によって確認した
。ペプチドＧｌｙ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｉ　１ｅ−
Ａｓｐ−Ｖａｌの合成について得られた結果を第７図に
示す。この配列は、ハムスターの肺のβ−アドレナリン
受容体の第２の細胞外ループについての推論された配列
から誘導された。１Ｍジチオトレイットを用いて樹脂か
らペプチドを開裂し、当分野の技術に従う逆相ＨＰ　Ｌ
　Ｃによって精製した。回収されたペプチドの組成をア
ミノ酸分析によって確認した。回収されたペプチドは開
裂部位において遊離のＳ　Ｈ基を含有し、このペプチド
を、当分野の技術に従うＳ　Ｈに向けた二官能価架橋剤
を用いて抗体産生のためのＫｅｙｈｏｌｅ　Ｌｉｍｐｅ
ｔ蛋白質のハブテンに結合させた。
容易に開裂し得るＳ−８官能基を用いたペプチド製造の
ための別のアプローチは、ｃｉｓ−ヒドロキシル基及び
過沃素酸又は他の酸若しくは塩基変化性結合を用いるこ
とである。溶解化学のため或はすでに存在している樹脂
への結合剤として、開裂し得る官能基を含有するＢＯＣ
又はＦＭＯＣ試薬（例えばＢＯＣ又はＦＭＯＣシスタミ
ン）が適している。
この試薬は通常のプロトコルにおいて第１のアミノ酸を
先取するであろう。上記の全てのアプローチは、樹脂に
直接結合した部位において開裂が起こる技術とは異なる
。
ペプチドＡ成の　なる　差 ペプチド合成はまた、ＢＯＣ又はＦＭＯＣ−ジペプチド
（これは蛋白質中にこのような対が生じる周波数に従っ
て調製される）を用いることによってを用いることによ
っても改善することもてきる。
同様の考えがオリゴヌクレオチド合成にも求められてい
る。所定の合成のための結合工程の数を減らすことによ
って、収率、純度及び達成できる鎖長が増大する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明に従って製造された、メリチンを固定
させたシリカ担体を有するカラムより収集された種々の
留分におけるホスホリパーゼＡ２活性およびホスホリパ
ーゼＣ活性のグラフである。白丸の曲線は自生活性を表
わし、黒丸の曲線は刺激活性を表わす。 第２図は、本発明に従って製造されたシリカ上のホスホ
リパーゼの親和性クロマトグラフィーを示す。 第３図は、本発明に従って製造された、逆相ＨＰ　Ｌ　
Ｃを用いたシリカカラムからのチトクロムＣトリプシン
ペプチド、インシュリン、シトクロムＣおよび桿菌セレ
ウスの溶離分布である。 第４図は、本発明に従って製造された、逆相ＨＰ　Ｌ　
Ｃを用いた、ｐＨ９，５の水酸化アンモニウムによる洗
浄１６時間後のカラムからのチトクロムＣ、トリプシン
抑制剤およびホスホリパーゼＣの溶離分布である。 第５図は、本発明に従って製造された、逆相ＨＰＬＣを
用いたシリカカラムからの小チトクロムＣペプチド、チ
トクロムＣヘムペプチド、インシュリン、チトクロムＣ
ペプチドおよびＰＬＣの溶離分布である。 第６図は、本発明に従って製造された、逆相ＨＰＬＣを
用いたシリカカラムからの芳香族アミン混合物の溶離分
布である。 第７図は、逆相ＨＰＬＣを用いたカラムからの合成ペプ
チドＧ　１ｙ−Ａｓｎ−Ｇ　１ｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔ
ｈｒ−３ｅｒ−Ｉ　Ｉｅ−Ａｓｐ−Ｖａｌの溶離分布で
ある。このペプチドは、本発明に従って製造されたフラ
クトゲルに結合せる成分から合成された。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）表面に複数のヒドロキシル基を有する有機若しく
    は無機主鎖を含むポリヒドロキシル化材料であって、そ
    の担体材料が前記ヒドロキシル基の少なくとも１個の前
    方部位における前記主鎖への求核配位子の直接共有結合
    により改質されているポリヒドロキシル化材料。
  2. （２）ポリヒドロキシル化材料が無機主鎖を含み而して
    シリカおよびガラスよりなる群から選ばれる、特許請求
    の範囲第１項記載の材料。
  3. （３）ポリヒドロキシル化材料が有機主鎖を含み而して
    アクリル樹脂、セルロース、アガロース、セファロース
    、多糖類およびオリゴ糖類よりなる群から選ばれる、特
    許請求の範囲第１項記載の材料。
  4. （４）ポリヒドロキシル化材料がヒドロキシル化ポリス
    チレン／ポリビニルベンゼン、デキストランおよびシク
    ロデキストリンよりなる群から選ばれる、特許請求の範
    囲第３項記載の材料。
  5. （５）求核配位子が色素、抗体、抗原、薬物、抗生物質
    、レクチン、蛋白質、ペプチド、アミノ酸、ＤＮＡおよ
    びＲＮＡよりなる群から選ばれる、特許請求の範囲第１
    項記載の材料。
  6. （６）表面に複数のヒドロキシル基を有する有機若しく
    は無機主鎖を含むポリドロキシル化材料にして、その担
    体材料が前記ヒドロキシル基の少なくとも１個の前方部
    位における前記主鎖への求核配位子の直接共有結合によ
    り改質されているポリヒドロキシル化材料を製造するに
    際し、 （ａ）表面に複数のヒドロキシル基を有する有機若しく
    は無機主鎖を含むポリヒドロキシル化材料を用意し、 （ｂ）該ポリヒドロキシル化材料をホスホリル化剤、ス
    ルホン化剤並びに式Ｃｌ＿３ＣＣ（Ｏ）ＮＨＣＯＣｌ、
    Ｏ（ＣＦ＿３）＿２、▲数式、化学式、表等があります
    ▼、および▲数式、化学式、表等があります▼の化合物
    よりなる群から選ばれる薬剤と接触させ、そして （ｃ）工程（ｂ）の生成物を求核配位子と接触させる ことを含む方法。
  7. （７）薬剤がホスホリル化剤であり而してオキシ塩化燐
    およびＨａｌ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＳＯ＿２ＯＨ（ここ
    で、Ｈａｌはハロゲン原子である）よりなる群から選ば
    れる、特許請求の範囲第６項記載の方法。
  8. （８）薬剤がスルホン化剤であり而してＣｌＳＯ＿２−
    Ｐｈ−ＣＨ＿３およびＦ＿３ＣＣＨ＿２ＳＯ＿２Ｃｌよ
    りなる群から選ばれる、特許請求の範囲第６項記載の方
    法。
  9. （９）（ａ）糖蛋白質を有効量のホスホリル化剤と接触
    させ、 （ｂ）工程（ａ）の生成物を検出可能な求核色素と接触
    させ、そして （ｃ）前記色素を検出する ことを含む糖蛋白質の検出方法。
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