SU883052A1 - Иммуносорбент - Google Patents

Description

(54) ИММУНОСОРБЕНТ

Изобретение относитс  к области получени  иммуносорбентов дл  иммуно логических исследований. Иммуносорбенты достаточно широко примен ют в иммунологических и биохимических исследовани х дл  выделени  высокоочищенных препаратов антител антигенный, иммуносорбент или белков антительный сорбент . Дл  эт го исследуемый белок тем или иным сп собом св зывают с полимерным носителем , полага , что после образовани  нерастворимого иммунного комплекса на иммуносорбенте по вл етс  возможность максимально полного освобождени  препарата от различных примесей. После диссоциации иммунного комплекса антитела (или антигены) освобождаютс  с иммуносорбента в чистом виде. Отсюда видно, что иммуносорбенты долж ны отвечать р ду требоБаний, i.e., он должны обладать механической прочностью , не разрушатьс  при многократном использовании, не обладать неспецифической сорбционной способностью и обладать достаточной емкостью, под которой понимают количество белка, иммо-, билизованного на единице веса или объема носител . Известен иммуносорбент на основе коллагена I типа, представл ющий собой коллаген I типа, св занный с диазотированной п-аминобензилцеллюлозой (РАВ-целлюлоза) . Способ получени  данного соединени  .включает стадии предварительной подготовки носител , т.е. диазотирование РАВ-целлюлозы смесью сол ной кислоты и нитрита натри  и св зывание диазотированного носител  с коллагеном Г типа р. Недостатками известного иммуносорбента  вл ютс  недостаточно высока  емкость (0,06 мг антител/мг коллагена, содержащегос  в сорбенте,или O,t)6 мг антител/мг сорбента, или 1 мг коллагена/мл сорбента) , а также недостаточна  механическа  прочность..Кроме того, структура и свойства иммуно38 сорбента обуслаилинает необходимость использовани  дл  элюции антител опре деленного элюирующего агента - трипсиновых фрагментов коллагена, получение которых само по себе представл ет дополнительную трудоемкую процедуру, в- результате чего усложн етс  и использование сорбента. Целью изобретени   вл етс  новый иммуносорбент на основе коллагена I типа, обладающий улучшенными свойства , ми по сравнению с известным (большей емкостью и механической прочностью) и обуславливающий более простые услови  использовани  в иммунологической 5 практике, а также расширение ассортимента иммуносорбентов на основе коллагена I типа. Цель изобретени  достигаетс  свойствами нового иммуносорбента - коллагена I типа, св занного с модифицированным сополимером акриламида - N , N -метилен-бис-акриламида-агарозы , имею щего следующие элементарный состав и характеристики (на сухое вещество),%: С 52,3-54,8 Н 6,5-10,7 N 4,3-4,5 О 32,7-34,2 S 0,002-0,005 Соединение представл ет собой белы водонаполненный гель с содержанием во ды от 92% до 96%, слаборастворимо в диамине, не растворимо в воде, спирте ацетоне, уксусной кислоте и эфире. Способ получени  этого продукта, используемого в качестве иммуносорбен та, основан на известной реакции св зывани  белков.с карбонилсодержащими носител ми образованием азометиновых св зей между аминогруппами белка и карбонильными группами носител  2. Введение карбонильных групп на поверхность носител  осуществл етс  обычно обработкой альдегидами, наиболее часто дл  такой модификации испол зуетс  глутаровый альдегид. Способ получени  предлагаемого соединени  осуществл етс  следующим образом . Сополимер акриламида N, N-метилен- 50 -бис-акриламида-агарозы модифицируют действием глутарового альдегида в фосфатном буфере, рН - 7,6 в течение 14-16 ч. К активированному таким образом носителю- в растворе добавл ют 55 коллаген I типа и ведут реакцию св зывани  белка с носителем при комнатной температуре в течение 14-16 ч или в течение 48 ч при . с последующим восстановлением азомстиновых си зей и альдегидных групп продукта. Полученный иммобилизованный коллаген J типа про вл ет свойства иммуносорбента, обладает высокой емкостью, хорошей регенерационной способностью и удобен при работе на хроматог.рафических колонках из-за хороших механических свойств. В частности, при синтезе иммуносорбента к носителю присоедин етс  до 90% белка, участвовавшего в реакции иммобилизации, что в 2 раза превьш1ает аналогичный показатель у известного сорбента. Емкость полученного сорбента составл ет: 0,17 мг AT (антител) на мг коллагена сорбента, или 0,22 мг АТ/мл сорбента, или 1,3 мг |коллагена/мл сорбента, что в 3-4 раза превышает емкость известного сорбента. Поскольку оба сравниваемых сорбента в единице объема содержат примерно равное количество иммобилизованного коллагена (1,3 мг и 1 мг в 1 мл сорбента ), увеличение емкости сорбента можно объ снить Созданием оптимальных условий стерического взаимодействи  при образовании иммунного комплекса на иммуносорбенте. Кроме того, элюцию антител на предлагаемом сорбенте ведут обычно употребл емыми агентами - 0,2 М глицин-НС 1 рН - 2,2 без применени  трипсиновых фрагментов коллагена. Процесс упрощаетс  и при этом примесь неспецифических белков не увеличиваетс . Предлагаемый иммуносорбент нар ду с повышенной емкостью обладает механической прочностью, химической стаг бильностью и низкой неспецифической сЪрбцией. Отмеченные характеристики обусловлены выбором в качестве носител  гранул1фованного сополимера акриламида N ,М -метилен-бис-акриламида-агарозы , что, нар ду с чисто мехаьшческой устойчивостью, создает лучшие услови  при образовании на сорбенте иммунного комплекса. Пример. 110 мл сополимера акриламида- Н, М-метилен-бис-акриламида-агарозы марки АсА-44 (размер частиц 60-140,мол.вес. 20000-120000,содержание акриламида 4%, агарозы 4%) многократно отмывают дистиллированной водой до полной прозрачности надосадочной жидкости. суспензию довод т до 6% содержани  раствором 25% глутаровогр альдегида на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,6 и оставл ют при слабом S8 перемешипаиии на 16 ч при К11миат}юй температуре. После ок(Л1чацц  активации избыток глутаропого альдегида уда л ют и гель тщательно отмывают дистил лированной водой до полного отсутстви  следов глутарового альдегида. К суспензии затем добавл ют раствор кол лагена I типа на 0,1 М фосфатном буфере . рН 7,4 в концентрации 2 мг/мл (всего 195 мг коллагена) и смесь инкубируют при слабом перемешипании в течение 46 ч при 4С, затем несв завшийс  белок отдел ют многократным промыванием фосфатным буфером рН 7,4 и 17РОВОДЯТ восстановление сорбента раствором боргидрида натри  на этом же буфере с конечной концентрацией 1 % в течение 45 мин при 4 С. Полученный сорбент отмывают 1 л 0,1 Н фосфатного буфера рН 7,4, 0,5 л 0,2 М глицин-НСЕ рН 2,2 и вновь 1 л 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4. Получают 130 мл гел , 1 мл которого содержит 1,3 мг иммобилизованного коллагена 1 типа (т.е. 90% вз того в реакцию белка иммобилизируетс  на носителе ) . Состав сухого- вещества следу ющий: С 54,8%; Н 6,4%; N 4,6%; О 34,2 S 0,002%, Продукт после добавлени  мертиолата (1:10000) или азида натри  (до 0,2%) хран т при . Удлинение времени иммо.билизации коллагена I типа нецелесообразно, поскольку при этом усиливаютс  процессы деструкции молекулы белка. Точно также нецелесообразно увеличение величины рН. П.ример 2. Услови  получени  соединени  идентичны описанным в прим ре 1 за исключением того, что вместо сополимера акриламида-N,N -метилен-бис-акриламида-агарозы марки ЛсА-44, берут марку АсА-22 (содержание.акрилФормула изпйргтеии 

Иммуносорбент, представл ющий собой коллаген Г типа, св занный с модифицированным сополимером акриламида-N , N-мeтилeн-бIIC-aкpилaмидn-arapoзы, имеющий следующий элементарный состав (на сухое нещсстно) , л:

С 52,3-54,8

И6,4-10,

Nл -А.

О 32,7-34,2 S 0,002-0,005 Белый водонаполненный гель с содержанием воды от 92 до 96%, слаборастворим в тиамине, не растворим в воде, спирте, ацетоне, уксусной кислоте и эфире.

Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе

1. R. Timpl, Н. Furthmayr, C.Stefferi , W. Doleschel Isolation of pure 24 амида 2%, агарозы 2%). llojiyiam-i 100 мл гел , 1 мл которого содержит 1,3 мг иммобилизованного коллагена I типа. Состав сухого вещества иммуносорбента следующий: С 52,3%; Н 10,7%; N 4,3%, О 32,7%; S 0,005%. Данные соединени  были использованы как иммуносорбенты. Сорбционна  активность их иллюстрируетс  примером 3. Приме-р 3. 130 мл иммуносорбента , полученного в примере 1, заполн ют хроматографическую колонку диаметром 16 мм и длиной 25 см. Колонку с сорбентом (все операции ведутс  при ), промывают 0,5 л 0,1 II фосфатного буфера рН 7,4 со скоростью 20 мл/ч,, затем 200 мл 0,2 М глицин-НС1 рН 2,2 и снова фосфатным буфером до нейтрального рН. После этого нанос т 100 мл иммунной сыворотки со скоростью 20 мл/ч и колонку отмывают фосфатным буфером до нул  оптической плотности выход щего из колонки раствора. Антитела с колонки элюируют 0,2 М глицин-НС Е рН 2,2, нейтрализуют 4 М рН 7,4, диализуют против фосфатного буфера в течение ночи и ксжцентрируют . Сконцентрированные антитела осветл ют центрифугированием, разливают на аликвоты и хран т замороженными при -25°С. Проведенный иммуноэлектрофоретический-и иммунодиффузионный анализ показал, что полученные препараты содержат антитела, относ щиес  к 1 классу и не содержат примеси неглобулиновых белков. Полученный иммуносорбент может быть использован более 15 раз в течение 6 мес. без потери сорбционных свойств. Количество антител, полученных в течение 15 выделений из 100 мл сыворотки, представлено в таблице.

7.8830528

anti-collagen antibodies ustng a spe- 2. Иммобшшзрванные ферменты. Под cific Immunoad sorbent tecanique, ред. И.В. Березина, В.К. Антонова, Z. Immuni tatsforsa, 1967, 134, 4, К. Мартин§ка.. .Т. К, М., 1976, изд-во 391-396.МГУ, с. 184.

Claims (1)

1. Формула изобретения * Иммуносорбент, представляющий собой коллаген Г типа, связанный с модифицированным сополимером акриламида-N, N’-метилен-бис-акриламида-агарозы, имеющий следующий элементарный состав (на сухое вещество), %:

   С 52,3-54,8

   И 6,4-10,7

   N 4,3 -4.5

   Белый водонаполненный гель с содержанием воды от 92 до 96%, слаборастворим в тиамине, не растворим в воде,' спирте, ацетоне, уксусной кисло те и эфире. ‘