KR910004069B1 - 항체를 고정시킨 친화성 크로마토그래피를 위한 담체 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

항체를 고정시킨 친화성 크로마토그래피를 위한 담체 및 이의 제조방법
제 1 도는 본 발명의 친화성 크로마토그래피를 위한 담체들의 활성화가 몇가지 종류의 프로테아제의 반복처리로 낮아지는 관계를 도시한 것이다.
제 2 도는 불용성 담체상에 고정된 항체의 활성화 및 활성화된 PEG의 몰비 변화가 프로나제의 반복처리로 낮아지는 관계를 도시한 것이다.
본 발명은 친화성 크로마토그래피를 위한 담체에 관한 것이다.
생물공학의 급속한 발달로 통상적인 산업기술과는 다른 부가적인 가치를 갖는 여러가지 물질이 생산될 수 있다. 즉, 유전공학, 세포 융합 기술 등의 발달과 함께 이의 생물학적 기능을 사용함으로써 유용한 물질을 제조하는 여러 종류의 기술이 공지되어 있다. 유효한 고도의 정제 기술은 실험실 및 공장에서 가장 중요한 문제가 된다.
예를들어, 유전자 조작으로 호르몬, 림포킨 등과 같은 미량의 생리학적 활성 물질을 산업적 수준으로 생산할 수 있다. 그러나, 이러한 물질을 효율적이고, 안정하게 분리하는 조작 및 불순물을 제거하는 조작과 관련된 분리 및 정제방법이 바람직하다. 이러한 분리 및 정제방법으로, 겔 여과, 이온 교환등이 이용되어 왔다. 이러한 방법은 적당한 순도의 물질을 고비용 및 저수율로 수득하는 많은 단계의 조작을 필요로 한다.
기본적으로, 세포에서 특이한 분자 인식이 생체내에서 생리학적 기능을 나타내는 이러한 물질의 분리에 사용된다는 것이 이 목적에 맞추어 고려된다.
효소 및 억제제, 효소 및 기질, 항원 및 항체 호르몬 및 수용체와 같은 특별한 생화학적 물질사이의 특이한 친화성을 사용함으로서 친화성 크로마토그래피로 이러한 물질을 분리할 수 있다. 따라서 친화성 크로마토그래피 기술은 이러한 물질을 분리 및 정제하는데 널리 사용된다. 항원 및 항체의 반응을 사용하는 기술로서는, 생물학적 친화 특이성이 매우 높은 것을 특징으로 하는 면역 친화성 크로마토그래피가 있다. 이 기술에 따라, 목적하는 물질은 리간드로서 목적 물질에 대한 항체를 불용성 담체에 결합시켜 수득한 흡착제상에 선택적으로 흡착정제된다. 면역 친화성 크로마토그래피는 단백질, 당단백질, 펩타이드, 효소 펩타이드형 호르몬 등에 적용시킬 수 있고, 이들의 항체를 제조할 수 있다.
통상적인 면역 친화성 크로마토그래피에서 당단백질의 항체는 토끼, 말, 소, 및 염소와 같은 포유류를 항원으로 면역시킨 혈액으로부터 유도되고, 그결과 생성된 항체는 겔 여과, 단백질A 친화성 크로마토그래피 등의 방법으로 정제하고, 항체를 불용성 기질상에 고정시킨다. 그리고 나서, 항체로서의 단백질 및 항원사이의 특이적 결합능을 통해, 항원을 면역학적 방법에 의해 정제한다. 항체 및 항원의 결합은 비교적 강하기 때문에, 반응에 의해 수득된 복합제는 안정하다. 결합은 가역적이고, 항원은 조건을 변화시켜 줌으로써 고정화된 항체로부터 해리 및 정제된다.
상술한 통상적인 기술에 사용되는 항체는 단백질이다. 항원을 함유하는 샘플액체는 대부분 단백분해효소(프로테아제)를 함유한다. 이러한 이유로 고정화된 항체는 프로테아제에 의해 분해되고 친화성 크로마토그래피의 항원의 결합 활성이 상실된다. 단지 고가 또는 소량으로 이용가능한 항체가 있다. 이러한 항체를 효율적으로, 즉 불활성화되지 않고 계속해서 사용할 수 있는 것이 중요하다.
본 발명의 목적은 항체가 고정화되어 있고, 활성이 상실됨이 없이 계속 사용할 수 있는 친화성 크로마토그래피를 위한 담체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다는 목적은 항체가 고정화된 친화성 크로마토그래피를 위한 담체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 불용성 담체상에 활성화된 폴리에틸렌 글리콜(하기부터 "PEG" 약자사용)에 의해 화학적으로 변형된 고정된 항체를 함유함을 특징으로 하는 친화성 크로마토그래피를 위한 담체에 관한 것이다.
활성화된 PEG의 예로서 메톡시 폴리에틸렌 글리콜과 시아누르산 클로라이드의 축합물질이 있다. 에이.아부코우스키(A.Abucowski)의 제조방법[참조: Journal of Biol.Chem., Vol.25, pp 3582(1977)]에 의해 하기 설명하는 실시예에 사용되는 물질을 수득한다.
항체가 활성화된 에 의해 화학적으로 변형되는 방법은 하기와 같다.
Figure kpo00001
Figure kpo00002
상기 식에서 A는 항체이다.
즉, 메톡시 PEG 및 시아누르산 클로라이드를 반응시키고 활성화된 PEG를 수득한다. 그 다음 항체를 반응물에 가하고 활성화된 PEG에 의해 변형된 항체를 수득한다.
더구나, 하기 물질은 다른 활성화된 PEG(참조 : Lecture Point Collection of Biochemical Assembly in 1986 4P-4Mll, Japan)로서 사용될 수 있다.
Figure kpo00003
다양한 분자량을 가진 PEG를 예시하는 것이지 본 발명을 특히, 이러한 PEG로 제한하는 것이 아니다.
활성화된 PEG에 의해 변형된 항체가 담체상에 고정화된 경우, 프로테아제 저항성은 변형되지 않은 항체보다 더 커진다. 친화성 크로마토 칼럼의 활성이 장시간 동안 유지되기 때문에 친화성 크로마토그래피로 정제하는 것은 오랜 기간동안 수행할 수 있어서 경제적으로 효과적이다. 본 발명의 기술에서와 같이 리간드효율을 증가시키기 위해 리간드를 변형시키는 것은 통상적인 기술에서는 발견되지 않으며, 본 발명의 기술은 분리 및 정제 방법으로 획기적인 것이다.
활성화된 PEG-변형된 항체가 고정화된 담체의 제조방법은 하기 방법에 예시되어 있으나, 어느 방법이라도 본 발명에 사용될 수 있다.
(a) 활성화된 PEG-변형된 정제를 제조하고, 그 결과 생성된 항체를 담체상에 고정화시킨다.
(b) 항체를 먼저 담체상에 고정시킨후, 항체를 활성화된 PEG로 변형시킨다.
(c) (a) 또는 (b)의 방법에서, 항체를 미리 항원으로 차단시킨다.
항체를 담체상에 고정시키는 방법은 특별히 제한을 두지 않으며, 예를들어 방법은 문헌[참조 : Experiment and Application of Affinity Chromatography", edited by Kodansha in Tokyo, Japan(1976)]에 명시되어 있는데, 즉 할로겐화된 시안산, 에피클로로하이드린, 비스에폭사이드, 하이드라지드 유도체의 기술을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용된 담체는 예를들어, 셀룰로즈, 덱스트란, 아가로즈, 폴리아크릴아미드, 낱알크기, 다공성등의 다공성 유리등이며 이로 제한되는 것은 아니다.
더구나, 본 발명의 친화성 크로마토그래피를 위한 담체 제조에 사용된 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다.
본 발명의 장점은 하기와 같다. 본 발명에 따라, 프로테아제를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 위한 담체상에 고정화된 항체를 분해하는 것은 어려우며, 활성은 방법의 반복에 의해 유지된다.
제 1 도는 불용성 담체 및 활성화된 폴리에틸렌 글리콜로 변형시켜 불용성 담체에 고정화시킨 항체를 함유함을 특징으로 하는 본 발명의 친화성 크로마토그래피를 위한 담체, 및 불용성 담체 및 활성화된 폴리에틸렌 글리콜로 변형시키지는 않았지만 불용성 담체에 고정화시킨 항체를 함유함을 특징으로 하는 친화성 크로마토그래피를 위한 담체의 활성화가 여러 종류의 프로테아제 처리를 반복함으로써 저하되는 관계를 보여준다.
제 2 도는 불용성 담체상에 고정화시킨 항체의 활성화 및 활성화된 PEG의 변형 몰비가 프로나제의 처리를 반복함으로써 저하되는 관계를 보여준다. 이러한 도면에서 Ai는 프로테아제 처리전 BSA-흡착량(mg/ml베드)을 나타내며 A는 프로테아제 처리후 BSA -흡착량(BSA는 소의 혈청 알부민을 의미한다 ; mg/ml베드)을 나타낸다.
또한 제 1 도에서 프로나제 처리에 따른 비변형된 고정화 항체의 활성화 저하관계는 원형으로 나타내고, 트립신 처리에 따른 비변형된 고정화 항체의 활성화 저하 관계는 삼각형으로 나타내며, 펩신 처리에 따른 비변형된 고정화 항체의 활성화 저하관계는 사각형으로 표시하고, 프로나제 처리에 따른 변형된 고정화 항체의 활성화 저하 관계는 검은 원형으로 표시하며 트립신 처리에 따른 변형된 고정화 항체의 활성화 저하관계는 검은 삼각형으로 나타내며, 펩신 처리에 따른 변형된 고정화 항체의 활성화 저하관계는 검은 사각형으로 표시한다.
제 2 도에서, 프로나제 처리에 따른 비변형 고정화 항체의 활성화 저하관계는 삼각형으로 표시하고, 프로나제 처리에 따른, 몰비 3으로 활성화된 PEG를 가하여 변형시킨 고정화 항체의 활성화의 저하관계는 검은 원형으로 표시하며, 프로나제 처리에 따른, 몰비 1로 활성화된 PEG를 가하여 변형시킨 고정화 항체의 활성화 저하관계는 검은 삼각형으로 나타내고, 프로나제 처리에 따른 몰비 0.7의 활성화된 PEG의 첨가로 변형된 고정화 항체의 활성화 저하관계는 검은 사각형으로 나타내며, 프로나제 처리에 따른 몰비 0.5의 활성화된 PEG의 첨가로 변형된 고정화 항체의 활성화 저하관계는 검은 역삼각형으로 나타내었다.
하기 실시예는 본 발명을 더욱 특별히 설명한다.
[실시예 1]
항원으로서 BSA를 사용한다. BSA항체를 제조하여 담체에 결합시킨후 결합체를 활성화된 PEG로 변형시킨다. 변형된 결합체의 프로테아제 활성을 시험한다. 자세한 것은 하기와 같다.
(1) 항-BSA-항체의 제조 : 이것은 일반적인 방법 [ 참조 ; E. Sada, S. katoh, A. Kondo and A. Kiyokawa : Journal of Chemical Engineering Japan, Vol.19, pp.502(1986)]에 의해 래비트를 사용하여 제조한다.
(2) 담체에 항체의 고정화 : 항체 용액은 0.1M 브레이트 완충액-0.5M 염화나트륨에 항체 5mg/ml를 용해시켜 수득한다. 불용성 담체로서, CNBr-세파로즈 4B(상품명, Pharmacia Company로부터 입수)를 사용한다. 항체를 고정화시키는 것은 통상적인 방법[예를들어, "Experiment and Application of Affinity Chromatography", edited by Kodansha in Tokyo, Japan(1976)]에 의해 수행하고, 그 기술은 하기와 같다 건조시킨 CNBr-세파로즈 4B 2g을 400ml의 1mM 염산으로 수차례 세척하고 상기 항체 14ml를 가하여 4℃에서 밤새 항체와 반응시킨다. 반응후 담체를 동일 인산염 - 완충용액으로 수회 잘 세척한다. 그리고나서, 14ml의 0.1M 에탄올 -아민 용액을 담체에 가하고 실온에서 2시간 교반시킨다. 담체를 수거하여 상기 인산염 완충액으로 잘 세척한다.
(3) 활성화된 PEG로의 변형 : (2)의 항체 - 고정화 담체를 70ml의 0.1M 나트륨 테트라보레이트 수용액에 현탁시켜 195mg의 시아누르산 클로라이드 -활성화된 PEG를 가하고 혼합물을 5℃에서 1시간 동안 교반시킨다. 담체를 수거하여 0.1M 나트륨 테트라보레이트 수용액으로 잘 세척한다. 이 경우에, 첨가된 활성화 PEG의 몰비는 1.0이다. 또한 몰비는 하기 식으로 계산한다.
Figure kpo00004
아미노 잔기의 수는 트리니트로벤젠설폰산 방법(TNBS 방법)으로 결정한다. 비변형된 항체-고정화 담체에서는, 활성화된 PEG 처리를 하지 않는다.
이러한 처리에 의해 활성화 PEG-변형된 항-BSA 항체가 결합되는, 친화성 크로마토그래피를 위한 담체 및 항 -BSA 항체가 결합되는 친화성 크로마토그래피를 위한 담체가 제조되고, 담체에 결합되는 항체의 각각의 양은 280nm 파장의 자외선 흡수 스펙트럼에 따라 9.0mg/ml-담체이다.
(4) 항원(BSA)의 결합양의 측정 : (3)에 의해 제조된 항체-결합 담체를 컬럼에 충진시켜 직경 1.8cm, 높이 2.8cm 및 용적 7.0ml인 베드를 수득한다. BSA용액 200ml(0.2mg/ml, 0.1M인산염 완충액, pH 7.6)를 컬럼에 붓고, BSA를 포화되게 흡착시키고 흡착된 BSA는 0.1N 염산으로 제거한다. 제거된 BSA의 양을 280nm 파장의 자외선 흡수 스펙트럼으로 측정하고 항체-결합 담체상의 BSA양을 프로테아제 처리전에 계산한다. 작업은 25℃에서 수행한다.
(5) 단백분해 처리 : (4)의 컬럼의 담체를 몇가지 프로테아제 용액(5mg/ml : 펩신-0.1M 아세테이트 완충액 pH 3.6 : 트립신 또는 프로나제-0.1M 인산염 완충액, pH 7.6)에 30분동안을 1회로 하여 담그고 수회 반복처리한다. 작업온도는 25℃이다.
(6) 단백 분해 처리후 담체상에 결합된 항원(BSA)의 양 : 프로테이제 저항성은 (5)에서 설명한 바와같이 각 회 처리후 담체상에 결합된 항원(BSA)의 양을 측정하여 조사된다. 결합된 BSA의 양을 측정하는 방법은 (4)에서의 방법과 동일하다.
그 결과는 제 1 도에 나타나 있다. 제 1 도에서, 세로축은 처리전 초기 BSA-흡착양(mg/ml) Ai에 대한 단백 분해 처리후 BSA-흡착양(mg/ml) A의 비를 나타내는 것이고, 가로축은 단백 분해 처리수를 나타내는 것이다.
그 결과로 나타나듯이, 본래 특이적으로 펩타이드 결합체를 자르는 트립신 및 펩신을 사용함에도 불구하고, 활성화된 PEG로 변형시킨 항체는 분해되지 않고, BSA-흡착양의 손실도 적으며 프로테아제에 대한 항체의 저항성은 그대로 남아 있다. 비특이적으로 펩타이드 결합체를 절단하는 프로나제를 사용하는 경우에는 활성화된 PEG로 변형시킨 항체의 저항성이 프로테아제에 대해 뚜렷하게 증가된다.
[실시예 2]
프로나제에 대한 항체의 저항성은 활성화된 PEG로 변형시킨 항체의 몰비를 변화시킴으로써 항체의 변형율이 변화되는 것으로 시험한다. 실시예 1에서 설명한 방법을 반복하되 활성화된 PEG의 첨가량을 몰비 3인 경우 292mg, 몰비 0.7인 경우 3.68mg 및 몰비 0.5 인 경우 49mg으로 변화시킨다.
그 결과는 제 2 도와 같다. 프로나제에 대한 항체의 저항성은 몰비 0.7이상에서 뚜렷하게 증가된다.

Claims (10)

  1. 불용성 담체, 및 활성화된 폴리에틸렌 글리콜에 의해 변형되어 불용성 담체상에 고정화된 항체를 함유함을 특징으로 하는 친화성 크로마토그래피를 위한 담체.
  2. 제 1 항에 있어서, 활성화된 폴리에틸렌 글리콜이 메톡시 폴리에틸렌 글리콜과 시아누르산 클로라이드의 축합물질인 담체.
  3. 제 1 항에 있어서 변형된 항체를, 메톡시 폴리에틸렌 글리콜과 시아누르산 클로라이드를 반응시켜 수득된 활성화된 폴리에틸렌 글리콜에 항체를 가함으로써 수득하는 담체.
  4. 제 1 항에 있어서 항체가 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 담체.
  5. 제 1 항에 있어서, 담체상에 고정화된 항체를, 할로겐화 시안산, 에피클로로하이드린, 비스에폭사이드 및 하이드라지드 유도체의 방법들로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법에 의해 수득하는 담체.
  6. 제 1 항에 있어서, 셀룰로즈, 텍스트란, 아가로즈, 폴리아크릴아미드 및 다공성 유리로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 담체.
  7. 활성화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) - 변형된 항체를 고정시킨 담체를 제조하는 방법에 있어서, 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 - 변형된 항체를 제조하고, 수득된 항체를 담체상에 고정화시킴을 특징으로 하는 담체의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서 항체가 미리 항원으로 차단된 제조방법.
  9. 활성화된 폴리에틸렌 글리콜(PEG) - 변형된 항체를 고정시킨 담체를 제조하는 방법에 있어서, 항체를 담체상에 고정시키고 고정화된 항체를 활성화된 PEG로 변형시킴을 특징으로 하는 담체의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서 항체가 미리 항원으로 차단된 제조방법.
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