DK141292B - Fremgangsmåde til fremstilling af vandopløselige bærerbundne proteiner. - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af vandopløselige bærerbundne proteiner. Download PDFInfo
- Publication number
- DK141292B DK141292B DK267474AA DK267474A DK141292B DK 141292 B DK141292 B DK 141292B DK 267474A A DK267474A A DK 267474AA DK 267474 A DK267474 A DK 267474A DK 141292 B DK141292 B DK 141292B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- water
- reaction
- bound
- carbohydrate
- dextran
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/813—Carrier is a saccharide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 141292 DANMARK m lnt Cl'3 c 07 0 7/oo // c oe b 37/02 (21) Ansøgning nr. 2&]k/lk (22) Indleveret den 15· maj 1974 ff (23) Lebedeg 15· maj 1974 \/ (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggeleeeeKrtftet offentliggjort den 18. f eb · 19^0
DIREKTORATET FOR
PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) Prioritet bøgeret fra den 17. maj 1973* 361119, us (71) BAXTER TRAVENOL LABORATORIES INC., One Baxter Parkway, Deerfield, 1111= nole 60015, US.
(72) Opfinder: Michael Hanus hew sky, 7421 Churchill Avenue, Morton Grove, 11= linois 60053» US.
(74) Fuldmægtig under segens behandling:
Th. Ostenfeld Patentbureau A/S.
(54) Fremgangsmåde til fremstilling af vandopløselige beer er bundne protei® ner.
Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af vandopløselige bærerbundne proteiner, hvor et vandopløseligt carbon-hydrat aktiveres med et cyanhalogenid under alkaliske betingelser, hvorefter det således aktiverede carbonhydrat omsættes med et protein.
I USA patentskrift nr. 3.639.213 og andetsteds har det været foreslået, at forskellige enzymer nyttigt kan bindes til en vandopløselig matrix bestående af carbonhydratmolekyler eller lignende. Det er fastslået, at et enzym eller andre former for proteiner kan stabiliseres på denne måde, og at det matricebundne produkt kan anvendes på forskellige måder. F.eks. kan nogle præparater anvendes som lægemiddel til injektion, hvorved der opnås en formindsket antistofreaktion mod epzymet eller det pågældende protein som følge af, at enzymet er kemisk bundet til det forholdsvis biologisk inerte carbonhydrat.
I USA patentskrift nr. 3.645.852 har det været foreslået at omsætte polysaccharider, såsom cellulose, eller dextrancopolymere med cyan- 2 141292 halogenider i et vandigt medium for at aktivere materialet til reaktion med et enzym eller et andet protein.
Vandopløselige carbonhydrater, såsom dextran, kan aktiveres ved hjælp af de i USA patentskrift nr. 3.645.852 omhandlede metoder til omsætning med enzymer og lignende. Under aktiveringsreaktionen har dele af dextranreaktanterne imidlertid tendens til at blive vanduopløselige formodentlig på grund af tværbindingssidereaktioner. Dette er naturligvis en væsentlig negativ faktor, når man søger at fremstille vandopløselige matricebundne enzymer.
I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en metode til frembringelse af høje udbytter af vandopløselige matricebundne enzymer, som kan være praktisk taget frie for vanduopløselige biprodukter. Ydermere kan der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringes vandopløselige matricebundne enzymprodukter med en væsentligt forøget enzymaktivitet pr. mg i sammenligning med fra teknikken kendte metoder til vandig aktivering med cyanhalogenider.
Den foreliggende opfindelse angår i overensstemmelse hermed en fremgangsmåde til fremstilling af vandopløselige bærerbundne proteiner, hvor et vandopløseligt carbonhydrat aktiveres med et cyanhalogenid under alkaliske betingelser, hvorefter 1-300 vægtdele af det således aktiverede carbonhydrat i vandig opløsning omsættes med 1 vægtdel af et protein, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at aktiveringen af carbonhydratet med et cyanhalogenid foretages i nærværelse af en absolut alkohol, der ikke indeholder mere end 3 carbonatomer og 1 hydroxylgruppe, eller n-butanol, og i nærværelse af et opløst alkali med formlen MOR i en koncentration, som er tilstrækkelig til at tilvejebringe en pH-værdi på mindst 10, hvis samme koncentration af alkali sattes til deioniseret vand, i hvilken formel M betegner et alkalimetal og R en lavere alkylgruppe eller hydrogen, i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at tillade aktiveringen. Reaktionen bør forløbe i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at tillade fuldstændig aktivering, hvilket tidsrum er forholdsvis kort. Et tidsrum i intervallet fra 10 til 40 minutter er sædvanligvis tilstrækkeligt til, at reaktionen forløber til ende.
Det i det foreliggende anvendte cyanhalogenid er typisk cyanbro-mid, men andre cyanhalogenider, såsom cyaniodid eller cyanchlorid, kan anvendes. Den almindeligt anvendte mængde cyanhalogenid synes ikke at være særligt kritisk, idet der fortrinsvis anvendes fra 0,5 til 1,5 vægtdele cyanhalogenid pr. vægtdel carbonhydrat, som er til stede i reakt ionsblandingen.
3 141292
Den anvendte alkohol er absolut, dvs. i alt væsentligt fri for vand som urenhed. Nærværelsen af vand synes at fremme uønskede side-reaktioner, som forårsager uopløseliggørelse af det vandopløselige carbonhydrat og en formindskelse af udbyttet eller reaktionsproduktets aktivitet. Der anvendes alkoholer med 1-3 carbonatomer og 1 hydroxy1-gruppe eller n-butanol, da opløsningen af bestanddelene i glycoler eller højere alkoholer ofte er vanskelig, og uønskede reaktioner har vist sig at finde sted med forgrenede alkoholer, såsom isobutanol, således at alkoholerne med de laveste molekylvægte, såsom methanol, foretrækkes. Det foretrækkes også i almindelighed i reaktionsblandingen at anvende fra ca. 20 til ca. 80 ml alkohol pr. g tilstedeværende carbonhydrat.
Alkaliet med formlen MOR kan være et alkalimetalalkoxid eller -hydroxid, såsom natriummethoxid, kaliumethoxid, kaliumbutoxid, lithium-hydroxid eller natriumhydroxid. Tilsvarende rubidium- og cesiumfotbin-delser kan også anvendes. Det foretrækkes i almindelighed at anvende alkoxidforbindelser (dvs. hvor R betegner lavere alkyl), da alkalime-talhydroxider har en stærk tendens til at bibeholde absorberet vand, og således kan give tendens til fremmelse af sidereaktioner, med mindre de er tørret omhyggeligt før anvendelse. Alkalimetalalkoxider kan ligeledes have bedre opløselighed i de ifølge opfindelsen anvendte alkoholer. Alkalimaterialet med formlen MOR sættes til reaktionsblandingen i en sådan koncentration, at den, hvis reaktionsblandingen var deioniseret vand, ville være tilstrækkelig til at bibringe blandingen en pH-værdi på mindst 10. Det er i ikke-vandige systemer naturligvis generelt ukorrekt at regne med en pH-værdi som sådan, men det tilstedeværende alkaliske materiale tilvejebringer ikke-vandige alkaliske betingelser.
Det er især ønskværdigt at tilvejebringe en koncentration af alkali, der er tilstrækkelig til give deioniseret vand en pH-værdi på 11 eller derover. Det kan ligeledes være nødvendigt at tilsætte alkali under de første få minutter af reaktionen, hvis der tilsættes små mængder alkali til at begynde med, da alkali tilsyneladende forbruges under reaktionen.
En beskrivelse af den tilsyneladende mekanisme ved cyanbromids aktivering af carbonhydrat i et vandigt system kan findes i "A Study of the Mechanism of Cyanogen Bromide Activation of Cellulose", pp. 1039--1044, Biotechnology and Bioengineering, bind XIV (1972) .
Det er på nuværende tidspunkt ukendt, hvorvidt reaktionsmekanismen for det ikke-vandige system ifølge opfindelsen svarer til eller ad 4 141292 skiller sig fra den i den umiddelbart ovenfor omtalte publikation omhandlede mekanisme.
De ifølge opfindelsen anvendte carbonhydrater kan være dextran, opløselig stivelse, opløselig glycogen eller lignende, og bør i almindelighed have en molekylvægt på mindst ca. 5000. Det mest foretrukne er at anvende materialer, såsom dextran med en molekylvægt på fra ca. 40.000 til ca. 100.000, især "Dextran 70" (molekylvægt 70.000), der er et ikke-toxisk middel, som allerede anvendes til forskellige former for terapi. Imidlertid kan opløselige dextraner med molekylvægte på 500.000 og derover anvendes.
En typisk foretrukken reaktionsblanding består af fra 1 til 3 vægtdele natriummethoxid, 1 til 3 vægtdele dextran og 1 til 3 vægtdele cyan-bromid samt 100 vægtdele methanol.
Reaktionen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen forløber ved stuetemperatur, men det foretrækkes at opretholde en sænket reaktions-temperatur, typisk fra -20 til +10°C, da en sådan sænket reaktionstemperatur giver bedre resultater.
Efter at reaktionen er forløbet til ende, kan det resulterende aktiverede carbonhydrat, som under de foretrukne reaktionsbetingelser er uopløseligt i det ikke—vandige opløsningsmiddel, udvindes ved simpel filtrering, efterfulgt af udvaskning med et ikke-vandigt opløsningsmiddel og vakuumtørring til fjernelse af opløsningsmidlet.
Det tørrede, aktiverede carbonhydrat, fra ca. 1 til ca. 300 vægtdele, kan derpå opløses i en passende vandig puffer, såsom en 0,1M natriumhydrogencarbonatopløsning, til opretholdelse af en pH-værdi, der i almindelighed ligger på imellem ca. 5 og ca. 9, og blandes med en opløsning eller dispersion af ca. 1 vægtdel enzym eller et andet protein ved formindsket temperatur, typisk fra 0°C til ca. 5°C, i et antal timer eller dage. Reaktionsproduktet mellem carbonhydrat og protein kan isoleres fra fri protein ved kolonnekromatografi eller på anden måde, såsom ved selektiv udfældning under anvendelse af blandinger af alkohol og vand.
Typisk omsættes fra ca. 10 til ca. 80 vægtdele aktiveret carbonhydrat, og fortrinsvis fra ca. 15 til ca. 40 vægtdele carbonhydrat med 1 vægtdele protein.
Specielt opnås ved omsætning af det aktiverede carbonhydrat med et enzym ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen de bedste resultater, når der anvendes fra 10 til 80 vægtdele af det aktiverede carbonhydrat for hver vægtdel enzym.
Enestående og medicinsk interessante materialer er fremstillet 5 141292 ved at omsætte carbonhydrat med streptokinase ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Sådant opløseligt omsat materiale, der har været afprøvet på dyr, udviser store terapeutiske fortrin i forhold til det frie enzym. Det har vist sig, at der forekommer formindsket antistofdannelse ved indgivelse af den matricebundne streptokinase fremstillet i overensstemmelse med opfindelsen, selv i sammenligning med indgivelsen af større doser fri streptokinase.
Den omhandlede fremgangsmåde kan anvendes til binding af mange forskellige store molekyler, som typisk har en molekylvægt på over 1000. Typiske proteiner, som kan anvendes til reaktionen med de aktiverede carbonhydrater ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er i almindelighed enzymer, skønt antistoffer, hormoner og lignende også kam bindes. Ligeledes kan proteiner, som indeholder visse ikke-proteinag- tige bestanddele, såsom metalioner, polysaccharider, porphyringrupper, adenindinucleotid, ribonukleinsyre, phospholipider og lignende, bindes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse. Sådanne materialer betragtes i det foreliggende som faldende ind under definitionen "protein" , da de indeholder en større del polypeptid- eller proteinsubsti-tuenter, og da de kemisk kan bindes til carbonhydratstøttemedier af den ovenfor beskrevne type. Proteinpolypeptidfragmenter, såsom aktive dele af enzymmolekyler, kan også bindes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse.
Eksempler på proteinholdige materialer, som ifølge opfindelsen kemisk kan bindes, er enzymer, såsom phosphorpyrudruesyretransphos-phorylase, transmethylase, aminoxidase, glutaainsyre-oxaleddikesyre-transaminase, glutaminsyre-pyrudruesyretransarainase, lipoxidase, peroxidase, catalase, glucoseoxidase, urease, glutaminase, urokinase, arginiase, phosphatase, lacithinase, cholinesterase, lipase, histidase, pectinase, maltase, a-amylase, amyloglucosidase, keratinase, bromelin, chymotrypsin, trypsin, pepsin, ficin, papain og chymopapain. Andre egnede enzymer omfatter de rennin-lignende proteaser, der fremstilles af organismen Mucor miehei og Mucor pusillus, hvilke proteaser er nyttige ved fremstillingen af ost, alkaliske proteaseenzymer, såsom de af organismen Bacillus subtilis varietet licheniformis fremstillede, amylaseenzymer, såsom de af Bacillus amyloliquefaciens fremstillede, og enzymerne L-asparaginase eller serindehydratase, der kan anvendes mod visse typer tumorceller ved at berøve dan asparagin eller serin, en essentiel aminosyre for sådanne tumorceller.
Andre proteinmaterialer, som kan bindes til de aktiverede carbonhydrater ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, omfatter hormoner, såsom insulin og de forskellige hypofysehormoner, proteiner fra gammaglobulinfraktionen, f.eks. antistoffer af klasserne G, M, A, D
U1292 6 og E, og andre blodfaktorer, såsom den antihæmofiliske faktor, blodkoagulationsfaktorerne, specifikke antistoffer, såsom hepatitis-, influenza-, poliomyelitis-, mæslinge-, fåresyge- og rabiesantistoffer, passende antigener, såsom støv, pollen fra planter af slægten ambrosia, eller mugantigen, eller hepatitis-, poliomyelitis-, mæslinge-, fåresyre-, influenza- eller rabiesantigen til rensning eller til eksperimentel undertrykkelse af antistofreaktioner, samt almindelige legemsproteiner, såsom hæmoglobin eller albumin.
Opfindelsen belyses i det følgende ved eksempler.
Eksempel 1 1 g natriummethoxid sattes til 50 ml absolut methanol. Til denne opløsning sattes 1 g cyanbromid efterfulgt af 1 g "Dextran 70" (molekylvægt 70.000) , som ikke opløstes i alkoholblandingen. Reaktionsblandingen omrørtes i 20 minutter ved stuetemperatur. Det resulterende faste produkt udvandtes ved simpel filtrering efterfulgt af udvaskning med absolut methanol og lufttørring.
. 500 mg af det resulterende aktiverede produkt opløstes i 5 ml af en 0,1M natriumhydrogencarbonatpufferopløsning. Samtidig opløstes 19,6 mg streptokinase i 3 ml af en 0,1M natriumhydrogencarbonatopløsning.
Begge opløsningsprøver dialyseredes ved 4°C i 2-3 timer imod en 0,1M natriumhydrogencarbonatopløsning.
De to dialyserede opløsninger forenedes, og 2 ml af en 0,1M natri-umhydrogencarbonatopløsning tilsattes for at bringe det samlede volumen op på 10 ml. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1 time og fik derpå lov til at henstå i 41 timer ved 4°C.
Det opløselige bundne produkt isoleredes ved kolonnekromatografi. Porøse glasmikroperler ("Corning CPG beads" solgt af Corning Glass Company, Corning, New York) kan anvendes som et passende separationsmedium i kolonnen. Fraktionerne indeholdende dextran-streptokinase lyofiliseredes til dannelse af et fnugagtigt faststof med en enzymaktivitet på 748 streptokinaseaktivitetsenheder pr. mg.
Eksempel 2
Til 50 ml absolut methanol sattes 4 ml af en 25% opløsning af na-triummethoxid i methanol. Bægeret indeholdende denne blanding pakkedes i tøris til afkøling deraf på vandfri måde, og derefter tilsattes 1 g cyanbromid efterfulgt af 1 g "Dextran 70" (molekylvægt 70.000). Reaktionsblandingen omrørtes i 20 minutter ved den af tørisen bibragte formindskede temperatur på fra ca. 0° til ca. -10°C. Produktet, et 7 141292 hvidt faststof, udvandtes ved filtrering efterfulgt af udvaskning med methanol og tørring i 1 time i vakuum i en beholder indeholdende et tørringsmiddel (calciumchlorid) adskilt fra den aktiverede dextranprøve.
Den ovenstående reaktion gentoges efter behov adskillige gange til tilvejebringelse af tilstrækkeligt aktiveret dextran til de nedenstående bindingsreaktioner.
Portioner af det ovenfor fremstillede aktiverede dextran og prøver af streptokinaseenzym sattes til særskilte portioner af vandig natriumhydrogencarbonatpuffer og forenedes derefter under omrøring ved en temperatur på ca. 4°C til tilvejebringelse af en reaktionsprøve med et opløsningsvolumen som angivet i tabellen nedenfor og koncentrationer af dextran og streptokinase ligeledes som angivet nedenfor. Vægtene af nærværende streptokinase beregnedes ud fra en streptokinaseaktivitet på 80.000 streptokinaseenheder pr. mg tilsat enzym. Reaktionsblandingerne holdtes ved 4°C i det nedenfor angivne antal timer.
Efter reaktionens afslutning isoleredes dextran-streptokinasen ved kolonnekromatografi igennem en glasperlekolonne, og fraktionerne indeholdende det bundne enzym lyofiliseredes til dannelse af et fast" produkt med det angivne antal streptokinaseenheder pr. mg. Det maksimale teoretiske udbytte af streptokinaseenheder pr. mg er også angivet, ligesom den ved analyse af nogle produkter fundne nitrogenprocent.
141292 8 i ti
<D +J
cp a μ t- co ^ 5 n) η ο η σι p 0 ----
j \ Q i—j I—i Η Ο I I I
Η p JS ft
I I
a) c -η H ti 44 (0 OP
g ø -p ø
•rl 44 ftO
co co a) a)
,¾ -H p 43 O O O O O O VO
nj +j -P G to vo ο ο o in m m g ø to ø g in η η η 'J* m h μ tU r- in Μ1 μ* Η σ\ ch
+) 0 rH to · tO
(D 0) ti to p 0 Q -P -P G ft
H
id Ί to ti fti 6 t? (D 0 ti * c p tu · ® .·
TJ -P 0 P P
C to to ft-P inooomoo 0 0(tJ44 moininr-min -P to IP H ti P ti I—I CP rH CN !"- r~ ® ti
CtJ-PØ'd t-· Μ* ΓΟ ΓΟ Η Γ·- Η TJ Ή
-P -P 44 Tl Ο 'Η S
ø ti ο ω ρ 2 Q ta -P 43 ft ' 5
tO rH
ti ft
rrt -rl O
Η Ό ti 4J ti 0 to ti m
Cn— T*
Cp ro ro H r- r- r~~ 433 -Hø VQVOrH^rrHrHrH CO ft rH 'ti g 0 ti 5 O ®
Λ Ή -P ·Η 4J
la pa-r +> ^
Eh 44 -H
^ ti 44 I 0 to 0 ti ti ti
to 0 , W
td -η -Ρω
G -P H
•H ti ® 44 Ρ Π Π 44 Ο -P —· — — ti to +) G H fH ΓΊ Ί H1 OJ H 00 ft 0 6 +1 0 u \ βω P ti 01 ® «· -p ο ε 1-1 CO 44 ~—· Si S' 0 0
-P
1 T) to
G I ti — β -H
ti G 0 H 0 W
P 0 -H S > , -p O -p \ ooooooo tip
x β ti Οι oo oo m M1 tiO
0 Ο P g rH MH
Q 44 -P —' Co
Si P
ω 0 1 ti ti > 44 0 O 43 ti I g ‘P m 0 C ti 0 p tt) ι-n in in 0 44 HO -- to 44
-P43> m cn cm cm m in in η H
(D Cfl tO CM Η Η H CM CM CM H
H G to ti 0 EOti $ “ ti -rl -rl M ti to -P Ό m 5 0 Ή ω 44 1 — ^ ω 0
0 X -ti -P
o Oft β ΓΟΟΟΓ-ΟΟνΟΟΜ* 0
<l)p Η Η Η Η M* in H TIP
PØ l llllll 0 -Ρ øg ο ο ο ο ο ο in >ω mg οσ οοοονο 03 CM CM CM CM CM CM Μ* r-.
(¾ G CM CM OH CM CM CM CM tt 9 141292
Det kan ses, at en procentvis meget høj del af den i denne reaktionsblanding anvendte streptokinase bliver kemisk bundet til dextra-nen uden tab af enzymaktivitet. Med hensyn til forsøget med referencenummer 2200-13 viser det sig faktisk, at den specifikke aktivitet for det matricebundne produkt udtrykt i enheder streptokinaseaktivitet pr. mcg kemisk bundet nitrogen er højere end for rent streptokinase.
Eksempel 3
Ca. 7,8 mg (1560 internationale enheder) L-asparaginase dialyseredes i og imod en 0,1M natriumphosphatpuffer ved en pH-værdi på ca.
7,3. Derefter fortyndedes asparaginaseopløsningen til 25 ml i samme puffer.
1 g af den aktiverede dextran fra eksempel 1 sattes til denne opløsning under omrøring og fik lov at reagere ved 35°C i 41 timer. Det resulterende produkt fraktioneredes ved hjælp af en glasperlekolonne, og de fraktioner, som gav kemisk bundet dextran-asparaginase, lyofili-seredes til udvinding af 1,19 g af produktet med en enzymaktivitet på 0,717 internationale asparaginaseaktivetsenheder pr. mg - et udbytte på ca. 55% bundet enzym.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36111973 | 1973-05-17 | ||
US361119A US3876501A (en) | 1973-05-17 | 1973-05-17 | Binding enzymes to activated water-soluble carbohydrates |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK141292B true DK141292B (da) | 1980-02-18 |
DK141292C DK141292C (da) | 1980-08-11 |
Family
ID=23420723
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK267474AA DK141292B (da) | 1973-05-17 | 1974-05-15 | Fremgangsmåde til fremstilling af vandopløselige bærerbundne proteiner. |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3876501A (da) |
JP (1) | JPS506772A (da) |
CA (1) | CA1040561A (da) |
DE (1) | DE2423831A1 (da) |
DK (1) | DK141292B (da) |
FR (1) | FR2229395B1 (da) |
SE (1) | SE431095B (da) |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB1479268A (en) * | 1973-07-05 | 1977-07-13 | Beecham Group Ltd | Pharmaceutical compositions |
US4225487A (en) * | 1974-05-31 | 1980-09-30 | Pedro Cuatrecasas | Affinity chromatography of Vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers |
DE2703703A1 (de) * | 1977-01-29 | 1978-08-03 | Dynamit Nobel Ag | Traegergebundene acylasen |
US4229537A (en) * | 1978-02-09 | 1980-10-21 | New York University | Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands |
US4331590A (en) * | 1978-03-13 | 1982-05-25 | Miles Laboratories, Inc. | β-Galactosyl-umbelliferone-labeled protein and polypeptide conjugates |
SU1022988A1 (ru) * | 1979-09-28 | 1983-06-15 | Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР | Стабилизированна урокиназа,обладающа тромболитической активностью,и способ ее получени |
JPS57142437U (da) * | 1981-02-27 | 1982-09-07 | ||
US4496689A (en) * | 1983-12-27 | 1985-01-29 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer |
DE3440988A1 (de) * | 1984-11-09 | 1986-07-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur spaltung von peptiden und proteinen an der methionyl-bindung |
US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US5206344A (en) * | 1985-06-26 | 1993-04-27 | Cetus Oncology Corporation | Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof |
DE3540076A1 (de) * | 1985-11-12 | 1987-05-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur stabilisierung von creatinkinase |
DE3625378A1 (de) * | 1986-07-26 | 1988-02-04 | Hoechst Ag | Verfahren zur entfernung von halogencyanen und phosgen aus abgasen |
US4847325A (en) * | 1988-01-20 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1 |
US5510418A (en) * | 1988-11-21 | 1996-04-23 | Collagen Corporation | Glycosaminoglycan-synthetic polymer conjugates |
US5162430A (en) * | 1988-11-21 | 1992-11-10 | Collagen Corporation | Collagen-polymer conjugates |
US5565519A (en) * | 1988-11-21 | 1996-10-15 | Collagen Corporation | Clear, chemically modified collagen-synthetic polymer conjugates for ophthalmic applications |
US5306500A (en) * | 1988-11-21 | 1994-04-26 | Collagen Corporation | Method of augmenting tissue with collagen-polymer conjugates |
US5393792A (en) * | 1991-11-20 | 1995-02-28 | Advance Biofactures Of Curacao, N.V. | High dosage topical forms of collagenase |
IL111609A0 (en) * | 1994-11-11 | 1995-01-24 | Univ Bar Ilan | Bioactive conjugates of polyhydroxy-polymers with amines |
US7883693B2 (en) * | 1995-12-18 | 2011-02-08 | Angiodevice International Gmbh | Compositions and systems for forming crosslinked biomaterials and methods of preparation of use |
US6458889B1 (en) | 1995-12-18 | 2002-10-01 | Cohesion Technologies, Inc. | Compositions and systems for forming crosslinked biomaterials and associated methods of preparation and use |
ES2268714T3 (es) | 1995-12-18 | 2007-03-16 | Angiotech Biomaterials Corp. | Composiciones de polimeros entrecruzados y metodos para su uso. |
US6833408B2 (en) * | 1995-12-18 | 2004-12-21 | Cohesion Technologies, Inc. | Methods for tissue repair using adhesive materials |
JP4059442B2 (ja) * | 2001-12-07 | 2008-03-12 | 備前化成株式会社 | グリコーゲンを物理化学的に製造する方法およびこの方法で得られるグリコーゲン |
DE60331367D1 (de) * | 2002-12-30 | 2010-04-01 | Angiotech Int Ag | Wirkstofffreisetzung von schnell gelierender polymerzusammensetzung |
AU2003303513A1 (en) * | 2002-12-30 | 2004-07-29 | Angiotech International Ag | Tissue reactive compounds and compositions and uses thereof |
BRPI0510477B1 (pt) | 2004-04-28 | 2023-01-17 | Angiotech Biomaterials Corporation | Método para formar um gel e dispositivo para uso em aplicações médicas |
CA2581093C (en) | 2004-09-17 | 2014-11-18 | Angiotech Biomaterials Corporation | Multifunctional compounds for forming crosslinked biomaterials and methods of preparation and use |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE337223B (da) * | 1967-05-23 | 1971-08-02 | Pharmacia Ab | |
SE343210B (da) * | 1967-12-20 | 1972-03-06 | Pharmacia Ab |
-
1973
- 1973-05-17 US US361119A patent/US3876501A/en not_active Expired - Lifetime
-
1974
- 1974-04-01 CA CA196,430A patent/CA1040561A/en not_active Expired
- 1974-04-10 JP JP49041617A patent/JPS506772A/ja active Pending
- 1974-04-25 FR FR7414378A patent/FR2229395B1/fr not_active Expired
- 1974-05-15 DK DK267474AA patent/DK141292B/da unknown
- 1974-05-16 DE DE2423831A patent/DE2423831A1/de not_active Withdrawn
- 1974-05-16 SE SE7406564A patent/SE431095B/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE431095B (sv) | 1984-01-16 |
DE2423831A1 (de) | 1974-12-12 |
FR2229395B1 (da) | 1977-08-19 |
FR2229395A1 (da) | 1974-12-13 |
DK141292C (da) | 1980-08-11 |
CA1040561A (en) | 1978-10-17 |
US3876501A (en) | 1975-04-08 |
JPS506772A (da) | 1975-01-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK141292B (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af vandopløselige bærerbundne proteiner. | |
US3802997A (en) | Method of stabilizing enzymes | |
US4004979A (en) | Preparation of active proteins cross-linked to inactive proteins | |
US3645852A (en) | Method of binding water-soluble proteins and water-soluble peptides to water-insoluble polymers using cyanogen halide | |
ES2259194T3 (es) | Composicion enzimatica para disociar tejidos. | |
US3836433A (en) | Fixation of nitrogenous materials | |
US6359118B2 (en) | Carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals | |
KR910004069B1 (ko) | 항체를 고정시킨 친화성 크로마토그래피를 위한 담체 및 이의 제조방법 | |
US3278392A (en) | Water insoluble enzymes | |
CA1330140C (en) | Crosslinked polymers and a process for their preparation | |
US7087728B2 (en) | Carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals | |
Stults et al. | Immobilization of proteins on partially hydrolyzed agarose beads | |
Horton et al. | [35] Immobilization as a means of investigating the acquisition of tertiary structure in chymotrypsinogen | |
Chen et al. | Improvement of cell lysis activity of immobilized lysozyme with reversibly soluble-insoluble polymer as carrier | |
EP0367302A2 (en) | Process for semi-synthesis of human insulin, water-soluble cross-linked Achromobacter protease I for use therein and a process for preparing the same | |
SU1419717A1 (ru) | Способ получени биоспецифических адсорбентов дл выделени фибронектина и коллагеназ | |
SU1690544A3 (ru) | Способ получени иммобилизованных нуклеофильных соединений | |
Yaqub et al. | Covalent immobilization of l‐asparaginase with a photochemical reagent | |
US3770584A (en) | Pronase purification | |
Borlaza | Evaluation of dithiobis (thioformate) and s-methyl dithiocarbonate as reactive groups for the immobilization of biological molecules | |
CHIOU et al. | Immobilization of papain on an anion exchange resin by physical adsorption followed by cross linking with glutaraldehyde | |
JP2739232B2 (ja) | 生物学的親和性を有するセルロースゲルの使用方法 | |
JPH05261281A (ja) | 生理活性物質固定化担体とその製法 | |
RU686377C (ru) | Способ получени препарата иммобилизованной протеазы BACILLUS SUBTILIS | |
Falb et al. | Immobilized Proteins and Peptides |