RU686377C - Способ получени препарата иммобилизованной протеазы BACILLUS SUBTILIS - Google Patents

Description

Насто щее изобретение относитс  к битехнологии и, 8 частности, к способам полчени  иммобилизованных ферментных репаратов, а именно к способу получени  репарата иммобилизованной протеазы 5 Bacillus subtltls.

Препарат иммобилизованной протеазы Bacillus subtllis может быть использован в медицине дл  лечени  гнойных абсцессов и ран,. Р(.биохимии дл  гидролиза белков в 0 абораторных дё  х, а также в промышленности /yifl гидролиза белковых смесей.

В литературе описан р д способов полчени  иммобилизованных протеаз Bacillus subtllis. 15

Известен способ получени  препарата иммобилизованной субтйлопептидазы А Вас. subtllis на пара-аминобензилцеллюлозе , который включает две стадии: актива-, цию матрицы путем диазотировани  и 20 иммобилизацию фермента на активированной матрице.

Недостатком способа  вл етс  низка  протеолитичеСка  активность препаратов мене« 10% от исходной.25

Известен также способ получени  препарата иммобилизованной протеазы Вас. subtllis на силохроме С-80, включающий активирование матрицы с помощью глутарового альдегида с последующей 30 иммобилизацией фермента. Источником протеазы служит раствор протосубтилина Г 10 X, представл ющий собой сложную смесь белков, включающую фермент протеазу , полученную после осаждени  балласт- 35 ных белков из культуральной жидкости Bacillus subtllis ацетоном, центрифугировани  и сублимационной сушки супернатанта. Способ получени  препаратов иммобилизованной протеазы заключаетс  в следую- 40 щем. Силохром С-8.0 обрабатывают амино.пропилэтоксисиланом, а затем глутаровым альдегидом. К влажному активированному носителю добавл ют 30%-ный раствор протосубтилина Г10Х в количестве 45 27-30% ед.ПС/МГ / носител . (За единицу ПС принимаетс  такое количество фермента , которое в течение 1 ч при 38°С катализирует гидролиз казеина в такой степени, что способность его св зывать HCI падает на 50 величину, эквивалентную 1 мл 0,1 н раствора NaOH). Процесс иммобилизации осуществл ют при перемешивании на лед ной бане при рН 7,4-7,5. После чего препарат отдел ют на пористом фильтре от жидкости. 55 Иммобилизованный препарат промывают до исчезновени  следов белка в промывных водах. Процент сохранени  активности препаратов составл ет 12.9-14%.

Недостатком этого способа  вл етс  низкий процент сохранени  активности и ограниченность применени . Так. например , получаемый препарат невозможно использовать в медицине.

Целью описанного способа  вл етс  устранение недостатков известного способа, а именно, увеличение процента сохранени  активности протеаа1ы при иммобилизации. Указанна  цель достигаетс  за счет того, что в качестве матрицы дл  иммобилизации используют аминоэтилцеллюлозу (АЕ-целлюлозу), а активацию матрицы провод т в 0,1-Ш фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч.

Согласно изобретению описываетс  способ получени  препарата иммобилизованной протеазы Вас. subtills с высоким процентом сохранени  активности, заключающийс  в активации АЕ-це люлозы глутаровым альдегидом в 0,1-1М фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч с последующей иммобилизацией фермента на активированном носителе.

Процесс провод т следующим образом.

В качестве аминоэтилцеллюлозы (АЭцеллюлоза ) используют препарат отечественного производства (завод химреактивов в г, Олайне) и фирмы Реанал (Венгри ). Протеазу Вас. subtlUs берут в виде водного раствора.

В качестве источника протеаз используют протосубтилин ГЗХ, очищенный по методу , который заключаетс  в осаждении балластных белков раствором CaCl2, удалении осажденных белков центрифугированием и осаждении протеаз из надосадочной жидкости этиловым спиртом. За единицу активности протеаз принимают такое количество фермента, которое переводит в кислоторастворимую фракцию 1 мг тирозина за 15 мин при 37°С.

Описываемый способ состоит из следующих стадий:

-активирование АЭ-целлюлозы глутаровым альдегидом в 0,1-1 М калий-фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч при комнатной температуре, при уменьшении времени активации снижаетс  протеолитическа  активность конечного продукта.

-иммобилизаци  протеазы на активированной АЭ-целлюлозе при 4-5°С и перемешивании в 0,1-1 М растворе калий-фосфатного буфера рН 7,3-7,7.

Внос т 40-50 ед. акт. фермента на 1 кг сухого веса активированной матрицы.

При уменьшении концемграции фосфорнокислых сопей в активации

и иммобилизации снижаетс  активность конечного продукта.

Полученные препараты иммобилизованной протеазы имеют активность 32-40 ед.акт./г сух. препарата и сохранение активнссти составл ет 17-30% от исходной активности.

При гидролизе альбумина в проточной колонке с иммобилизованной протеазой сохран етс  100% активности в течение 4-х сут при 25°С. В течение 3-4 сут в гнойной ране также сохран етс  100% активности.

Преимуществом описываемого способа , по сравнению с прототипом,  вл етс  использование активированной целлюлозной матрицы дл  иммобилизации протеазы. В св зи с этим получен высокий процент сохранени  активности препарата иммобилизованной протеазы и высока  стабильность препаратов при гидролизе белков.

Приведенный ниже пример служит иллюстрацией описываемого способа.

ПрА1мер. 100 г влажной АЭ-целлюлозы (сухой вес 50 г) суспендируют в 230 мл 1 М калий-фосфатного буфера, рН 7,5; добавл ют к полученной суспензии 75 мл 25%-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь перемешивают в течение двух ч.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММОБИЛИЗОВАННОЙПРОТЕАЗЫ

   BACILLUS SUBTILIS, включающий активирование матрицы с помощью глутарового . альдегида и последующую иммобилизацию протеазы, отличающийс  тем, что, с целью

   фильтруют. Осадок на фильтре промывают водой 1 М водным раствором NaCI и вновь водой.

   К активированной АЭ-целлюлозе приливают 250 мл раствора, содержащего 1375 мг белка с удельной активностью 2 ед. акт/мг в 0,1 М калий-фосфатном буфере. Смесь инкубируют при непрерывном перемещивании в течение 10-12 ч при 5°С. Полученный продукт отфильтровывают, промывают 1 М водным раствором NaCf до отсутстви  оптической плотности в смывах, измеренной при 280 нм, и затем промывают водой-. В результате получают 100 г иммобилизованной протеазы с удельной активностью 32-40 ед. акт/г сухого веса с сохранением активности 17-30% от активности протосубтилина, вз того дл  иммобилизации при использовании казеина в качестве субстрата.

   (56) Goidstefn L. Water Insoluble enzymes Biochemistry 9, 2322, 1970.

   Калашникова A.M. Термо-и рН-стабильность растворимой и иммобилизованной на силохроме С-80 протеазы Вас. subtllls. Прикладна  биохими  и микробиологи  11(6)842, 1975.

   увеличени  процента сохранени  активно2g сти протеазы, в качестве матрицы используют аминоэтилцеллюлозу, а ее активацию провод т в 0,1 - 1 М фосфатном буфере при рН б - 9 в течение не (енее 2 ч.