SU1696475A1

SU1696475A1 - Способ получени иммобилизованной липазы

Info

Publication number: SU1696475A1
Application number: SU894648987A
Authority: SU
Inventors: Кахрамон Давранович Давранов; Абдумурод Саттарович Саттаров; Мина Яковлевна Табак
Original assignee: Институт Микробиологии Ан Узсср
Priority date: 1989-02-09
Filing date: 1989-02-09
Publication date: 1991-12-07

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к способу получени иммобилизованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической отрасл х промышленности. Цель изобретени - повышение активности целевого продукта. Способ заключаетс в обработке полиамидного носител - капрона бифункциональным агентом, несущим изоцианатные группы, а именно 2,4-толуолдиизоцианатом

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , конкретно к получению иммобилизованных ферментных препаратов, в частности к способам получени иммобилизованной липазы, и может найти применение в пищевой, легкой и химической промышленност х.

Известен способ получени иммобилизованной липазы, включающий обработку полиамидного носител бифункциональными реагентами, в качестве которых используют глутаровый альдегид или госсипол.

Обработку носител глутаровым альдегидом провод т при рН 8,5 в течение 1 ч, а

св зывание с ферментом при 4°С в течение 12 ч 1.

Недостатками способа вл етс низка удельна активность целевого продукта (0,8 ед. на 1 г носител ) и невысока стабильность (врем полуинактивации 2,5 ч при 50°С).

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту вл етс способ иммобилизации липазы на полиамидном носителе с использованием в качестве бифункционального сшивающего реагента госсипола Согласно известному способу обработку носител

О Ч)

г

VI ел

госсиполом провод т при 45-80°С и рН 8,0- 9,5 в течение 1-5 ч, а св зывание фермента с носителем осуществл ют при 0-16°С 2. Однако известный способ характеризуетс недостаточно высокой активностью и термостабильностью получаемого продукта. Достигаема удельна активность 14 ед./г носител (субстрат-хлопковое масло), соотношение активности иммобилизованного и растворимого ферментов составл ет 0,175, а врем полуинактивации при 50°С составл ет 3,5 ч.

Целью изобретени вл етс повышение активности целевого продукта.

Согласно способу получени иммобилизованной липазы, предусматривающему обработку полиамидного носител бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы 6 нейтральной или слабощелочной среде, и последующее св зывание липазы с модифицированным носителем , в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдиизоциа- нат в количестве 1-2 мг на 1 г носител , а после обработки бифункциональным реагентом провод т модификацию носител пальмитиновой кислотой, устанавлива соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носител .

Использование предлагаемого способа позвол ет увеличить удельную активность целевого продукта в 3,0-3,4 раза (от 14 до 42-48 ед./мг носител ).

П р и м е р 1. 1 г порошкообразного полиамида обрабатывают 4 н. HCI (100 мл) при 40°С в течение 2 ч, затем промывают трижды бидистиллированной водой (по 500 мл). Осадок полиамида отдел ют декантацией или центрифугированием (5 мин, 2000 об/мин). Затем суспендируют в 10 мл диок- сана и прибавл ют 1 мг 2,4-толуолдиизоци- аната, 3 капли триэтиламина и смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 20-25°С, затем полиамид отфильтровывают , промывают на фильтре диоксаном и смешивают с 20 мл суспензии пальмитиновой кислоты в диоксане, прибавл ют несколько капель тризтиламина и смесь медленно перемешивают в течение 5 ч при 80°С. Носитель промывают суспензией пальмитиновой кислоты, ацетоном (3x100 мл) и 0,005 М фосфатным буфером (рН 7,8) до полного исчезновени ацетона.

Дл присоединени фермента к модифицированному таким образом полиамидному носителю к его суспензии в 0,005 М

фосфатном буфере (рН 7,8) добавл ют 20 мл раствора липазы с концентрацией белка 4 мг/мл и инкубируют в течение 6 ч при 4°С. Полученный целевой продукт промывают 0,1 М фосфатным буфером и активность фермента измер ют по его способности расщепл ть хлопковое или оливковое масло. Удельна активность препарата 42,0 ед./г носител .

П р и м е р 2. Все операции провод т по примеру 1, но используют 25 мл пальмитиновой кислоты. Удельна активность 48,0 ед./г носител .

Примеры 3-7. Способ осуществл ют

по примеру 1. варьиру количеством добавленной пальмитиновой кислоты (1-3,7 мл) или 2,4-толуол-диизоцианата (4-6 мл).

Данные исследовани приведены в таблице .

Из данных таблицы следует, что полржи- тельный эффект достигаетс при добавлении 20-30 мл пальмитиновой кислоты. Понижение концентрации пальтиминовой кислоты приводит к снижению активности

целевого проудкта, а повышение ее концентрации нецелесообразно из-за увеличени расхода реагента без вли ни на активность . Оптимальные концентрации бифункционального реагента 1-2 мг на 1 г

носител .

Таким образом, использование предлагаемого способа позвол ет значительно увеличить удельную активность целевого продукта с 14 до 42-48 ед./г носител (т.е. в

3,0-3,4 раза), а также несколько увеличить стабильность иммобилизованной липазы (врем полуинактивации при 50°С возрастает с 3,5 до 6,0 ч).

Claims

Формула изобретени

Способ получени иммобилизованной липазы , предусматривающий обработку полиамидного носител бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы,

в нейтральной или слабощелочной среде и последующее св зывание липазы с модифицированным носителем, отличающий- с тем, что, с целью повышени активности целевого продукта, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуол- диизоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носител , а после обработки бифункциональным реагентом провод т модификацию носител пальмитиновой кислоты, устанавлива соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носител .