DE1908290A1 - Zur Fixierung von Proteinen verwendbares Mischpolymerisat - Google Patents

Description

int. Nr. 1587

BOEHRINQER MANNHEIM GMBH, Mannheim

Zur -Fixierung von Proteinen verwendbares Mischpolymerisat

Die Erfindung betrifft ein Mischpolymerisat, welches besonders zur Fixierung von Proteinen geeignet ist.

Grundsätzlich muss zwischen unlöslichen Proteinen und gebundenen unlöslichen Proteinen unterschieden werden.

Es ist bekannt, dass unlösliche Proteine durch Kondensations-, Kupplungs- und Polymerisationsreaktionen mit dem Protein selbst entstehen können. Die auf diese Weise erhaltenen Proteine sind Produkte unkontrollierbarer Reaktion; es lassen sich keine definierten Produkte erhalten. Ein grosser Teil des Proteins wird durch die harten Reaktionsbedingungen der Polymerisation, der Kupplung mit bis-Diazo-Verbindungen und durch die für die Kondensation eingesetzten Komponenten, wie Formaldehyd, Chlor-Ameisensäureäthylester, u.a., denaturiert und dadurch biologisch inaktiviert. Er geht für die hauptsächlichen Anwendungsbereiche unlöslicher Proteine verloren.

Als unlösliche, biologisch aktive Proteine haben allein die an Trägermaterial!en fixierten Proteine Bedeutung, da sie defi-

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nierte Materialien darstellen, die sich universell für Enzyme, Inhibitoren, Antigene bzw. Antikörper, für Eiweißstoffe allgemein anwenden lassen.

Die Bindung der Proteine an die Trägermaterialien kann heteropolar oder auch homöopolar erfolgen. Sie heteropolar gebundenen Proteine sind weniger von Interesse, da sie in Abhängigkeit von Ionenkonzentration und pH-Wert wieder ablösbar sind.

Folgende Versuche, Proteine durch reaktive Gruppen an unlösliche Träger zu fixieren, sind bekannt:

1. Umsetzung von Cellulose mit p-Nitrobenzylchlorid zu dem entsprechenden Cellulose-Derivat, das zur Aminoverbindung reduziert und diazotiert, mit Proteinen gekuppelt werden konnte.

2. Die reaktive Gruppe nach 1) wurde durch m-Aminobenzyloxymethyl ersetzt. Später wurden Versuche mit

3. Polyamino-polystyrol - eineia vollsynthetischen Träger - unternommen.

4. d.l-p-Aminophenylalanin, d,l-3ieucin u.a. Aminosäuren wurden zu einem synthetischen Träger polykondensiert, dessen diazotierte Amino-Gruppen mit Proteinen zu kuppeln vermögen.

5. Nach den Methoden der Peptidchemie wurde Carboxymethylcellulose mit Proteinen und di-Cyclohexyl-earbodiimid als Kondensationsmittel umgesetzt.

6. Aus Carboxymethyl-Cellulose wurde über das Hydrazid das Azid hergestellt, das mit Proteinen zu reagieren vermag.

7. Mit Bromacetylcellulose werden Proteine gut gebunden.

8. Aus Isothiocyanat-Derivaten des Dextrangels "Sephadex¹* und der Cellulose wurden mit Proteinen wasserunlösliche Enzym-Verbindungen hergestellt.

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9· Unter den Bedingungen der Acrylamid-Polymerisation lassen sich Proteine in gut quellbarem Material fixieren. Das Enzym wird dabei radikalisch an die Ketten gebunden.

10. ¥eiter wurden Proteine an Äthylenmaleinsäureanhydrid (ELIA) und

11. StjTol-i'laleinsäureanhydrid-copolymere gebunden.

Die bisher bekannten Methoden sind nicht befriedigend und nicht allgemein für Proteine anwendbar. So werden weniger als 50 fo Protein bei Methode 1, 2 und 4 gebunden, ein Großteil des Proteins verliert unter diesen Bedingungen die biologische Aktivität. Ilethode 3 erwies sich als noch ungünstiger.

Methode 5 läßt sich nur in nichtwässrigem Medium ausführen und darum nur sum Teil für Antikörperprobleme und niedermolekulare Inhibitoren anwenden.

Hach Methode 6 werden nur etwa 10 $ des eingesetzten Proteins gebunden, wovon nur 10 bis 43 $ enzymatische Aktivität behalten.

Die Methode 7 ergibt eine hohe Ausbeute an gebundenem Protein (80 bis 90 y>) ; für viele Proteine bedeuten diese R-eaktionsbedingungen aber einen Verlust der biologischen Aktivität.

Hit Methode B werden nur ganz wenige Prozent des eingesetzten Proteins alitiv an Gel gebunden.

Hach-Methode 9 werden nur 18 bis 20 %> des eingesetzten Proteins gebunden, wovon nur wenige Prozent Aktivität gegenüber Substraten entwickeln können. Höhermolekulare Substrate (Hämoglobin) werden nur zvl 1 bis 2 $ umgesetzt .

Derzeit ergibt" Methode 10 die befriedigendsten Ergebnisse. 3ie findet ΐΛ-r Antigene, Inhibitoren lind ünsvme "Anwendung. Die 2indun_t:irr-?:..;tion erfolgt schonend in xv'ässrigen I-Iilieu; etv:a ·;0 bis

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60 % des Proteins lassen sich unter optimalen Bedingungen fixieren.

Jedoch ist das verwendete Ausgangsmaterial sehr uneinheitlich; es hat niedermolekulare (z.T. lösliche) und höhermolekulare (unlösliche) !Fraktionen, die sich weder sieben noch auf andere Weise trennen lassen. Daher werden nur bis zu 60 $> Protein an den unlöslichen Träger gebunden, der Rest geht als lösliches Material verloren. Aber auch das gebundene Protein befriedigt noch

In der Bindung des Proteins an den Träger (EMA) hat das Broteia Comonomer-Punktionj es kann nicht nur an einer Stelle, sondern an mehreren (d.h. vernetzt) gebunden werden. In Abhängigkeit von der Proteinkonzentration werden mehr oder weniger gut quellbare Protein-auf-Träger-Substanzen erhalten«, Das Protein liegt dabei in einem Netzwerk covalent gebunden vor, so daß die Bitfn&ion bei diesem Material eine wesentliche Rolle spielt ₉ und es win teilweise für Substrate zugänglich ist. Auch durch Zugabe ύοά ¥@£aefzern (Hexamethylendiamin u.a.) wird dieser fechteil nickt ©iafgehoben. Von dem gebundenen Protein sind daher nur noch etwa 50 $ für niedermolekulare Substrate erreichbar, so daß die G-eeastaJrtivitat nicht mehr als 30 i» beträgt. Gegenüber hochmolekularen s-traten sind nur 1o % und weniger gefunden worden.

Ein zusätzlicher Nachteil dieses Materials liegt von Protein zu Protein verschieden, auch in Proteinkonzentration, z.B. flockig, schwer filtrierbar anfällt und nicht ohne weiteres in Säulen gepackt werden kann«

Styrol-Maleinsäureanhydrid-Polymere gemäß Methode 11 lassen sieh zur Entfernung von Proteinen, z.B. Reinigung des Trinkwassers u.a. zur Anwendung bringen. Diese Träger haben ähnlich aminopolystyrol ausgesprochen lypophilen Charakter» Proteine können nicht ohne Verlust ihrer Struktur .gebunden w©rc könnten sie mit Proteinen beladen nicht lyop&ilisier-fc

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Die nicht durch Protein verknüpften funktioneilen Gruppen der bekannten Trägersubstanzen tragen als NH₂- (Methode 1, 2, 3, 4) bzw. als COp-Gruppen (Methode 6, 8, 10) in entsprechenden pH-Bereichen positive bzw. negative Ladungen.. Bei Methode 10 entstehen CO₂-Gruppen zusätzlich bei der Proteinbindung des cyclischen Anhydrids. Dieser polyvalente Charakter der Proteinträger verursacht Adsorption der Matrix, ähnlich den Ionenaustauschern, erhöhte Inaktivierung bzw. Denaturierung der Proteinstruktur und Verschiebung der pH-Dptima bei gebundenen Enzymen.

Es besteht daher großes Interesse an der Schaffung eines geeigneten Trägers für wasserunlösliche Proteine, sowie an den Träger gebundene wasserlöslichen Proteine und einem Verfahren zu ihrer Herstellung·

Durch die Erfindung werden die anstehenden Probleme gelöst. Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Mischpolymerisat, bestehend aus a) Acrylamid, b) Äthylenmaleinsäure bzw. deren Anhydrid oder/und c) Maleinsäure sowie d) N^'-Methylen-bis-acrylamid oder Äthylendiacrylat im Gewichtsverhältnis a:b:c:d von 3:0,5-1,5:0,05-4: 0,075-0*9, wobei die Summe von b) und c) höchstens 4 Verhältnisanteile beträgt.

Vorzugsweise liegt die einpolymerisierte Dicarbonsäure als Anhydrid vor. Der Bestandteil d), d.h. N,N'-Methylen-bis-acrylamid oder/und Äthylendiacrylat, machen vorzugsweise nicht mehr als 0,45 Teile im oben angegebenen Gewichtsverhältnis aus.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der oben beschriebenen Mischpolymerisate zur Fixierung von Protein.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein wasserunlösliches Protein, wobei das in ungebundenem Zustand wasserlösliche Protein an das oben beschriebene Mischpolymerisat gebunden vorliegt.

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Im Folgenden wird das erfindungsgemäße Mischpolymerisat, seine Herstellung und Verwendung näher beschrieben.

Acrylamid, H,N^t-Methyl-bis-acrylamid oder/und Äthylendiacrylat sowie Maleinsäure bzw. Äthylenmaieinsäure oder die entsprechenden Anhydride werden in Gegenwart von Badikalbildnern und Radikalbeschleunigern in den oben angegebenen Verhältnissen nach an sich bekannten Methoden polymerisiert. An sich ist es möglich, Maleinsäure- bzw. Haleinsäureanliydridgruppen in breiten Konzentrationsbereiehen einpolymerisieren. Im Hinblick auf die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabenstellung erwies sich jedoch die oben näher gekennzeichnete Zusammensetzung als Bedingung für die Erzielung eines Mischpolymerisats, welches als Trägersubstanz die gewünschten günstiges Eigenschaften auf v/eist.

Bei der Herstellung läßt sich das Mengenverhältnis von Acrylamid zu Maleinsäure bzw. Äthylenmaieinsäure oder den entsprechenden Anhydriden in verhältnismäßig weiten Bereichen variieren, ohne daß hierdurch die erforderliche Vernetsermenge v/esentlich beeinflußt wird. So läßt sich Acrylamid mit Maleinsäure bzw. ihrem Anhydrid im Gewichtsverhältnis von 3:0,1 bis 4 verwenden, ohne daß hierdurch das Verhältnis von Acrylamid zu Vernetzer wesentlich beeinflußt ist«, Bei der Verwendung von Äthylenmaieinsäure bzv/. ihrem Anhydrid als Comonomer sind die Grenzen hingegen enger geaogen. Hier regelt der Vernetzergehalt Porengröße und festigkeit, aber auch die Bindung der Äthylenmaieinsäure im Gel.

Pur die Verwendung zur fixierung von Proteinen ergaben sich besonders gute Ergebnisse bei Verwendung von Acrylamid und Maleinsäure bzv/. Äthylenmaieinsäure oder den entsprechenden Anhydriden im Gewichtsverhältnis 3:0,5 bis 1_?0« Bei Erhöhung der Konzentration der Dicarbonsäure Ms 1*5 wird das Mischpolymerisat zwar spröder und weniger quellbar, zeigt jedoch immer noch gute Eigenschaften als !Präger. Bei einem Verhältnis von Acrylamid zu Vernetzer, d.h. Ιϊ,Ν'-Methylea-Ms-acrylaffiM bsw» Ätliylendiacrylat, von 3:0,075 bis 0,450 werden gelartige Polymeri-

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sate mit besonders bevorzugten Eigenschaften erhalten. Ein Verhältnis von 3:0,075 stellt die untere Grenzkonzentration dar, bei der die Maleinsäure bzw. Äthylenmaleinsäure noch befriedigend eingeschlossen wird.

Für die Fixierung von Proteinen in wässrigem Milieu erwiesen sich auch Vernetzerkonsentrationen entsprechend einem Verhältnis von Acrylamid zu Yeraetzer von mehr als 5:0,45; z.B. 3:0,6-0,9 noch als gut geeignet. Bei Arbeiten mit höheren Salzkonzentrationen, d.h. mehr als 0,05 M, erwiesen sich jedoch die hierbei erhaltenen relativ eng vernetzten Gele für die Proteinstruktur als nachteilig.

Die Herstellung der erfindungsgemäSen Mischpolymerisate läßt sich beispielsweise in wässriger Lösung, vorzugsweise in inerter Atmosphäre} äiircMühren. Beispiele für geeignete Radikalbildner bzw, Badikallseselileuniger sind Propionsäurenitril und Ammoniumperoxydisulfat« Me Tuljmexlsation kann bei Zimmertemperatur, aber auch bei tuilierem Temperaturen bis zu 100° oder bei niedrigerer Temperatur dmrcligsfiihrt werden. Die Polymerisationsdauer ist von der gewählten Polymerisationstemperatur, den gewählten Beschleunigern bzw. Katalysatoren und der mengenmäßigen Zusammensetzung des Ansatzes atsliäsgig. Sie liegt gewöhnlich zwischen etwa 5 Minuten und mehreren Stunden.

Nach dem Erstarren wirl ä®T p©i;ps©risieirse Msats zur Erzielung einer für die Handhabung besonders günstigen Körnung durch ein Sieb der gewünschten MEselenweite geirfiskt_s mit Wasser gewaschen und lyophilisiert.

Für die Fixierung des Proteins ist es notwendig, daß die Diearbonsäure in Form des Anhydrids Torliegt. Ss müssen daher vor der Proteinverknüpfung sämtliche Säuregruppen wieder in das cyclische Anhydrid überführt werden. Dies erfolgt beispielsweise durch Erhitzen des lyophilisierten Mischpolymerisats im Vakuum auf eine Temperatur von etwa 80 bis 120⁰G oder Unter Atmosphärendruck bei einer Temperatur von etwa 160 bis 22O₉ vorzugsweise 180 bis 200⁰C.

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Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate sind in Abhängigkeit von der Vernetzerkonzentration wasserklare bis milchig-trübe Substanzen mit gummiartiger bis spröder Konsistenz.

Die Mischpolymerisate lassen sich leichtIsörnen, beispielsweise indem man sie durch ein Metallsieb drückt. Als günstig für die Zwecke der Proteinverknüpfung erwiesen sich hierbei Korngrößen von etwa 0,35 bis 0,8 mm. Dieses Granulat quillt bei Zusatz von Wasser nach. Die Stärke der Quellung ist vom Vernetzergehalt abhängig. Je enger die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate vernetzt sind, desto weniger quellbar sind sie.

Die Entquellung ist z.B. mit Alkohol oder noch einfacher durch Gefriertrocknung möglich.

In mancher Hinsicht gleichen die Teilchen der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate denen des bekannten Polyacrylamidmolekularsiebes. Bei Behandlung mit Pufferlösungen erfolgt eine Schrumpfung in Abhängigkeit von der Zahl der vorhandenen Carboxylgruppen, ähnlich wie bei den Ionenaustauschern auf Dextran- oder Polyacrylamidbasis.

Wenn die Carboxylgruppen durch Erhitzen auf etwa 200⁰C in das cyclische Anhydrid überführt werden, tritt häufig eine leichte Gelbfärbung auf. Wird längere Zeit erhitzt, so vertieft sich die Farbe von gelb bis braun und gleichzeitig nimmt die Bindungskapazität deutlich ab. Eine länger dauernde Erhitzung auf die erforderliche Temperatur unter Normaldruck wird daher tunlichst vermieden.

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Die Porosität und die Härte des erfindungsgemäßen Mischpolymerisats im Zustand eines gequollenen Gels wird in erster Linie durch den Vernetzergehalt bestimmt. Das Material weist Molekularsiebeigenschaften auf, ähnlich wie "bei den Polyacrylamidgelen, wobei die Ausschlußgrenzen beliebig durch den Vernetzergehalt festgelegt werden können. In gequollenem Zustand läßt sich das erfindungsgemäße Mischpolymerisat leicht filtrieren oder zentrifugieren und zeigt als Säulenfüllung ideale Eigenschaften. In Wasser- oder Pufferlösungen gequollen und entquollen als Lyophilisat ist das gelartige Mischpolymerisat uneingeschränkt haltbar.

Das erfindungsgemäße Mischpolymerisat ermöglicht eine schonende Bindung des Proteins, weil es hydrophil und stark quellbar ist, und die Proteinverknüpfung nur durch Solvolyse der cyclischen Anhydridgruppen erfolgt. Die Proteinstruktur bleibt nach erfolgter Bindung des Proteins erhalten, wobei Aktivitätsausbeuten bis zu 100 ii (und sogar darüber durch Steigerung der Aktivität) gewonnen werden. Das nicht gebundene Protein läßt sich ohne Aktivitätsverlust zurückgewinnen. Bei der Bindung übernimmt das Protein nicht eine Vernetzerfunktion in der Matrix sondern die erhaltenen, als "Enzymgele" zu bezeichnenden träger^gebundenen Enzyme sind vollkommen einheitlich und weisen nicht in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration unterschiedliche Festigkeit auf.

Durch die gezielte Vernetzung können die Molekularsiebeigenschaften des Mischpolymerisats so eingestellt werden, daß Proteine nur in gewünschte Bereiche gelangen können. So ist es möglich, das Mischpolymerisat für bestimmte Proteine so zu vernetzen, daß die Proteinbindung nur an der Oberfläche des GeI-partikels erfolgen kann,vahlweise aber auch im gesamten Gel. Die Polymerisationsparameter lassen sich je nach dem wirksamen Molekülradius, sterischen Effekten und ladungsverteilung variieren.

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Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate besitzen Adsorptionseigenschaften, so daß in Wasser oder schwachen Pufferlösungen (bis etwa 0,01 M) das Eiweiß 100#ig am Träger fixiert wird. Bis zu 85 % des Eiweißes werden hierbei !covalent, der Rest heteropolar gebunden. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Mischpolymerisate ohne vorherige Cyclisierung der Säuregruppen erfolgt die Eiweißbindung nur adsorptiv. Es wurde gefunden, daß sich unter diesen Bedingungen das Protein mit Salzlösungen ohne Aktivitätsverlust vom !Träger wieder eluieren läßt.

Die Proteinbindungskapazität des erfindungsgemäßen Mischpolymefc risats ist abhängig von der Zahl der vorhandenen Anhydridgruppen und der Porengröße. Bei ehern enger vernetzten Produkt ist die Bindungskapazität geringer als bei einem weniger eng vernetzten Produkt bei gleicher Anzahl an vorhandenen Anhydridgruppen, da das Proteinmolekül bei engerer Vernetzung nicht alle zur Verfügung stehenden bindungsfähigen Gruppen erreichen kann.

Liegen im erfindungsgemäßen Mischpolymerisat zu viele Ladungen vor, die nicht von Protein durch kovalente Bindung besetzt werden können, so erfolgt im allgemeinen eine Verschiebung der pH-0ptima bei den gebundenen Enzymen. Entsprechend wurde bei den bekannten trägergebundenen Enzymen beobachtet, daß es bei negativ geladenen Trägermaterialien zu einer Verschiebung um zwei pH-Ein- f heiten, beispielsweise bei an Äthylenmaleinsäureanhydrid gebundenem Trypsin von 7,8 auf 10,0, und bei positiv gelagerten Trägern eine Verschiebung in den sauren Bereich erfolgt. Bei dem erfindungsgemäßen Mischpolymerisat ist es möglich, die bindungsfähigen Gruppen maximal auszunutzen, so daß sich trägergebundene Proteine erhalten lassen, die keine Verschiebung des pH-Wert-Optimums zeigen. eg efüge. B

Eine besonders interessante Eigenschaft der erfindungsgemäßen auf Träger gebundenen wasserunlöslichen Proteine besteht darin, daß unter Umständen höhere Michaelis-Konstanten erhalten werden als bei nicht-gebundenem Enzym. So wurde beispielsweise gefun-

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den, daß die Aktivität von erfindungsgemäß gebundenem Trypsin gegenüber M-Benzoyl-1-arginin-p-nitranilid erhöht wird in Vergleich zu nicht-gebundenem Enzym.

Die erfindungsgemäßen trägergebundenen Enzyme weisen eine Fülle hüchsterwünschter Eigenschaften auf und lassen sich für zahlreiche Anwendungsgebiete verwenden. So ermöglichen sie es, Substratumsätze weitaus gezielter als bisher auszuführen, da das Enzym zu jedem gewünschten Zeitpunkt aus dem Inkubationsansatz wieder entfernt werden kann. Ist der Umsatz noch nicht quantitativ, so läßt sich das gleiche Enzym erneut zusetzen. Bei Proteasen kann das zu spaltende Protein bei jeder gewünschten Hydrolyserate isoliert werden. Die Spaltungsreaktion läßt sich damit direkt verfolgen. Das enzymatisch aktive Protein muß nicht mehr, wie bisher, nach dem Substratumsatz ausgefällt werden hierdurch wurden oftmals die Substratumsätze verändert - sondern es läßt sich durch einfaches Filtrieren oder Abdekantieren oder dgl. entfernen.

Substratumsätze lassen sich mit derartigen trägergebundenen enzymatisch aktiven Proteinen auch über Säulen ausführen. In ein käfigartiges Gefäß gepackte erfindungsgenäße Trägerenzyme lassen sich ähnlich wie ein Tee-Ei zu einem Inkubationsansats geben und jederzeit wieder daraus entfernen.

Mit proteolyti.sch wirksamen trägergebundenen Enzymen lassen sich auf einfache Weise Inhibitoren isolieren. Die Stabilität der Proteasen wird dabei durch die Bindung an das -.Trägermaterial wesentlich erhöht, da die Proteasen keiner Autolysereaktion mehr unterliegen.

Mit erfindungsgemaßen trägergebundenen Proteaseinhibitoren lassen sich Proteasen einfach, schnell und ganz spezifisch isolieren. Kit ihrer Hilfe ist es auch möglich, Proteasen enthaltende Proteinlösungen von den Proteasen su reinigen und damit zu stabilisieren.

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Durch erfindungsgemäße auf Träger fixierte Antigene bzw. Antikörper läßt sich eine einfache Isolierung von Antigenen bzw.
Antikörpern durchführen. Mit derartigen trägergebundenen Enzymantikörpern kann eine besonders einfache und wirksame Enzymisolierung durchgeführt werden.

Die erfindungsgemäßen gebundenen Proteine lassen sich ganz allgemein wiederholt benutzen und zeigen zum Teil auch bei verlängertem Gebrauch keinerlei Aktivitätsschwund.

Aufgrund der Molekularsiebeigenschaften der erfindungsgemäßen
Mischpolymerisate lassen sich die trägergebundenen Proteine auch zur Substrattrennung einsetzen.

Die erfindungsgemäßen Mischpolymerisate sind hinsichtlich ihrer Eignung zur Fixierung von biologisch aktiven Proteinen den bisher bekannten, für gleiche Zwecke verwendeten Trägermaterialien in hohem Ausmaße überlegen, wie die in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßten Ergebnisse zeigen.

Tabelle 1

Träger- Einheitlich- Träger: Ausbeute material keit des Protein geb.Pro-Materials tein in

Aktivität^' Ausbeute

niedermolek. Aktivität

Substrate v.einges.

in $ in ψ>

einheitlich 20:1

15 -

CMC-HYDRA-

ZID (EN- einheitlich 10:0,5-1 25

ZYIiE)²)

EMA-"
erfin-

nicht "

40-

bis 40

dungsgem. einheitlich ^liebig

60 - 70
bis 100

5) 6)

7) 8)

10 - 13

bis 14-

bis 30

bis 80

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- 13 Anmerkungen:

1) Polyacrylamid

2) Carboxymethylcellulosehydrazid

3) Äthylenmaleinsäureanhydrid

4) Trypsin-Aktivität

5) alle niedermolekularen Aminosäuren-Substrate

6) Chymotrypsin-Aktivität

7) am Stickstoff geschützte Aminosäure-Ester

8) N-Benzoyl-1-arginin-p-nitranilid

Sie Überlegenheit der erfindungsgemäßen trägergebundenen Proteine liegt nicht nur in ihrer überlegenen Ausbeute und Aktivität, sondern auch in dem weitaus vorteilhafteren zulässigen Verhältnis von Träger zu Protein.

Sie erfindungsgemäßen Mischpolymerisate lassen sich zur fixierung von Proteinen sehr unterschiedlicher Molekülgröße und Eigenschaften verwenden, da sich die Eigenschaften dieses Trägermaterials ohne weiteres je nach den Erfordernissen des zu bindenden Proteins einstellen lassen. Wenn z.B. das Protein ein besonders großes Molekül aufweist, so kann durch Verringerung des Vernetzungsgrades in weitem Umfange noch ein Eindringen des Proteins in die Matrix und Bindung in derselben bewirkt werden. Bei Proteinmolekülen, die so groß sind, daß auch durch eine Vernetzung im geringe tmö glichen Ausmaß ihr Eindringen in die Matrix wesentlich erschweren wird, ist es auch möglich, eine Fixierung des Proteins lediglich an der Oberfläche der Teilchen vorzunehmen, wobei in diesem lalle das Mischpolymerisat vorzugsweise so fein gekörnt wird, daß eine sehr große Oberfläche erhalten wird, wobei die dann allein an der Oberfläche stattfindende Fixierung des Proteins zu einem völlig ausreichenden Fixierungsgrad führt.

Sas Verhältnis von homöopolar zu adsorptiv bzw. heteropolar am Träger gebundenen Enzym läßt sich beeinflussen durch die Art

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der Herstellung der Bindung zwischen Protein und Träger. Wird beispielsweise das Protein vorgelegt in relativ hoher Pufferkonzentration und langsam das nicht-gequollene Gel zugegeben, so ist die Ausbeute an homöopolar gebundenem Enzym sehr hoch und praktisch kein adsorptiv gebundenes Enzym nachzuweisen. Wird andererseits mit niedriger Pufferkonzentration gearbeitet und Träger und Enzym rasch zusammengegeben, so ist zwar die Ausbeute an gebundenem Protein höher, von diesem an den Träger gegangenen Protein läßt sich jedoch mit hohen Pufferkonzentrationen wieder ein erheblicher Anteil eluieren, der also nicht W homöopolar gebunden gewesen sein kann. Wird beispielsweise wie oben angegeben mit hoher Pufferkonzentration und langsamer Trägerzugabe gearbeitet, so gehen etwa 80 & des vorgelegten Enzyms an den Träger und es läßt sich dann nichts mehr davon eluieren. Das Enzym ist also annähernd vollständig homöopolar gebunden und seine Aktivität wird lediglich noch durch die Zugänglichkeit für das Substrat bestimmt. Im zweiten Fall hingegen bei niedriger Pufferkonzentration und rascher Zugabe werden zwar 100 fi des vorgelegten Proteins am Träger absorbiert. Hiervon lassen sich aber bis 35 # wieder mit hohen Salz- oder Pufferkonzentrationen eluieren, waren also nicht homöopolar gebunden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

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- 15 Beispiel 1

Herstellung des Mischpolymerisats

3 g Acrylamid (AAD), 0,3 g N.N'-Methylen-bls-acrylamid (bis-AAD) werden mit 1 g Äthylenmaleinsäureanhydrid (EMA) in 23 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,6 suspendiert und unter starkem Rühren in Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur mit je 1 ml 5#igem Propionsäurenitril und 5#igem Ammoniumperoxydisulfat versetzt. Nach 10 bis 15 Minuten erstarrt die Masse zu einem gelartigen Block. Dieser wird 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann durch ein Metallsieb mit einer lichten Maschenweite von 0,5 mm gedrückt. Das erhaltene Granulat wird mit etwa 5 1 destilliertem Wasser gewaschen. Das Naßgewicht beträgt nun 38,2 g.

Das so erhaltene gequollene Mischpolymerisat wird zum Entquellen gefriergetrocknet. In getrocknetem Zustand beträgt das Gewicht (Ausbeute) 5,4 g.

Zur Cyclisierung zum Säureanhydrid wird anschließend 1,5 bis

2 Stunden bei 200⁰C im Trockenschrank erhitzt.

Beispiel 2

3 g Acrylamid, 0,075 g Äthylendiacrylat und 1 g Maleinsäure werden wie in .Beispiel 1 beschrieben mischpolymerisiert. Die Polymerisationsdauer beträgt 15 Stunden.

Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Ausbeute an Lyophilisat beträgt 2,3 g. Nach der Cyclisierung beträgt das Gewicht des Produktes 2,05 g.

Beispiel 3

3 g Acrylamid, 0,3 g Ν,Ν'-Methylen-bis-Acrylamid und 1 g Maleinsäure werden wie in Beispiel 1 beschrieben mischpolymerisiert.

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Die Polymerisationsdauer beträgt 15 Stunden. Die Weiterverar=· beitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Di© Ausbeute an lyophilisat beträgt 2,67 g. Hach Gelisierung beträgt das Gewicht des Produktes 2,45 g.

Beispiel 4

Wie in Beispiel 1 beschrieben werden 3 g Acrylamid, 0,6 g NjN'-Methylen-bis-acrylamid und 1 g Maleinsäure mlschpolymeri™ siert. Die Polymerisationsdauer beträgt 5 Stunden. Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben« Die Ausbeute an Lyophilisat beträgt 2,8 g. Nach der Cyclisierung werden 2,6 g Endprodukt erhalten.

Beispiel 5

Wie in Beispiel 1 beschrieben werden 3 g Acrylaiaid, 0,3 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und 0,1 g Maleinsäure 5 Stunden mischpolymerisiert. Die Weiterverarbeitung erfolgt ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Naßgewieht des gequollenen Produktes beträgt 53,5 g. Nach der lyophilisierung wird ein Trockengewicht von 4,8 g erhalten. Die Cyclisierung führt gu einem Endprodukt in einer Ausbeute von 3,1 g.

Beispiel 6

Herstellung des trägergebundenen Proteine

Es wird ein cyclisiertes Mischpolymerisat aus 3 g Acrylamid_p 0,15 g HjN'-Methylen-bis-acrylamid und 1 g Maleinsäure als Srä ger verwendet. 100 mg Trypsin werden mit 1 g träger in 15 ml eiskaltem Wasser, pH = 5,2, eingerührt und bei 40©G 15 Stunden, im Kühlraum reagieren lassen. Anschließend wird das Produkt eine Säule gepackt.

Das heteropolar gebundene Protein wurde mit" 65 ml Waschwasses? eluiert. Mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH = 7,8_P kein weiteres Protein mehr eluiert werden.

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Heteropolar gebundenes Protein: 31 # bei pH 7,0, 8,5, 10 20 #

Rest-Aktivität, bezogen auf nicht gebundenes Trypsin: 50 #.

Beispiel 7

Als Träger wird das Produkt von Beispiel 5 verwendet. Der Träger wird wie in Beispiel 1 beschrieben mit 100 mg Trypsin reagieren gelassen.

Nichtgebundenes Protein: 30 #
Aktivität des gebundenen Proteins

vor Behandlung mit 0,2 M Puffer: 100 # nach " » » η η 50 $.

Beispiel 8

Es wird der gleiche Träger wie in Beispiel 6 verwendet. 100 mg Träger und 200 mg Trypsin werden wie in Beispiel 1 beschrieben reagieren gelassen.

Nichtgebundenes Protein: 50 %
Aktivität des gebundenen Proteins

vor Behandlung mit 0,2 M Puffer: 100 # nach » ^M " " » 48 %.

Beispiel 9

Es wird das Produkt von Beispiel 3 als Träger verwendet. 100 mg Hinderserumalbumin werden mit 1 g Träger wie in Beispiel 1 beschrieben reagieren gelassen.

Nicht gebundene s Protein: 32 5*.

Weder mit 0,2 M Phosphatpuffer, pH = 7,8, noch mit 0,2 M Glycinpuffer, pH = 1,8, kann Protein vom Träger eluiert werden. Die Ausbeute an homöopolar gebundenem Protein beträgt 68 $>, bezogen auf eingesetztes Protein, und 100 56, bezogen auf gebundenes Pro-

^tein· 009837/2168

Bei Verwendung von Humanserumalbumi η anstelle von Rinderserumalbumin wird das gleiche Ergebnis erhalten.

Beispiel 10

Es wird das Produkt von Beispiel 3 als Träger verwendet. 1 g Träger wird portionsweise innerhalb von 60 Minuten zu 200 mg +) gelöst in 18 ml Phosphatpuffer (0,1 M, pH = 7,8) gegeben und 18 Stunden bei 4⁰C reagieren gelassen.

Nichgebundenes Protein: 50 $>

" Aktivität des gebundenen Proteins, bezogen auf eingesetzte Aktivität: 40 ?S.

Mit 0,2, 0,33 bzw. 0,5 M Phosphatpuffer kann kein Protein und keine Aktivität vom Träger eluiert werden.

+) Trypsin

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Claims (4)

- 19 Patentansprüche

1. Mischpolymerisat bestehend aus a) Acrylamid, b) Äthylenmaleinsäure bzw. deren Anhydrid oder/und c) Maleinsäure sowie

d) Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid oder Äthylendiaerylat im Gewichtsverhältnis a:b:c:d von 3:0,5-1,5:0,05-4:0,075-0,9, wobei die Summe von b)und c) höchstens 4 Verhältnisanteile beträgt.

2. Mischpolymerisat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die einpolymerisierte Dicarbonsäure als Anhydrid vorliegt.

3. Mischpolymerisat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil d) nicht mehr als 0,45 Verhältnisteile ausmacht.

4. Verwendung des Mischpolymerisats nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Fixierung von Protein.

an das Mi^chjualjiffleTirsair^emaii"einem der Ansprüche 1 bis 3 ge-

^ Α

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