DE2363854C3 - Substrat zur Proteinasebestimmung sowie dessen Herstellung - Google Patents

Description

Oberfläche eines synthetischen polymeren Trägers kovalent gebunden und mit Reaktivfarbstoffen efagefärbt ist. Durch die feine Verteilung werden die > hochmolekularen Substrate für die zu bestimmenden Proteinasen sehr gut zugänglich, und die Spaltung des Substrats führt zu einer von der Enzymaktivität abhängigen Freisetzung den daran gekoppelten Farbstoffes,

Als Substratproteine im Sinne der Erfindung eignen sich alle durch Proteinasen spaltbaren Proteine — insbesondere Haemoglobin, Casein, Fibrinogen oder Kollagen sowie deren Um- oder Abwandlungsprodukte wie Hitzefibrin, α-Casein, Gelatine, ferner wiedervernetzte Hydrolyseprodukte dieser Verbindungen, beispielsweise wiedervernetzte Polypeptide aus abgebauter Gelatine, welche nach der deutschen Patentschrift 11 18 79?. hergestellt ist.

Als Träger für diese Substrate eignen sich vor allem Copolymerisate aus einem aktiven Monomeren, d. h. einem solchen, das aktive Gruppen wie die Carbon- »o Säureanhydrid- oder die Isothiocyanat-Gmppierung enthält, und einem inaktiven Monomeren ohne derartige Gruppen, z. B. eine Ätherverbindung. Ab aktive Monomere eignen sich insbesondere Maleinsäure- oder Crotonsäureanhydrid oder Allylisothiocyanat, als in- »5 aktive Monomere z. B. Propylen, Acrylamid oder Butadien.

Die Copolymerisate können aus aktivem und inaktivem Monomeren in beliebigen Mengenverhältnissen bestehen. Entsprechend können Monomereneinheiten des aktiven Monomeren zu 0,01 bis 99,99 Molprozent im Polymerisat enthalten sein. Das Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Acrylamid wird vorteilhaft weniger als etwa 6 Molprozent Maleinsäureanhydrid, das Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Butadien weniger als etwa 90 Molprozent Maleinsäureanhydrid enthalten, während das Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Propylen vorteilhaft aus etwa 50% Maleinsäureanhydrid und 50% Propylen besteht. Soll ein besonders hoher Anteil an aktiven Gruppen vorliegen, so läßt sich auch Homopolymeres des aktiven Monomeren, beispielsweise des Maleinsäureanhydrids als Trägermaterial für das Substrat-Protein einsetzen.

Der Träger muß sodann mit dem Substratprotein zur Umsetzung gebracht werden, so daß die aktiven Gruppen beider Partner kovalente Bindungen miteinander eingehen. Die Art der Reaktion und der dabei entstehenden kovalenten Bindung hängt naturgemäß von dem Charakter der in Reaktion tretenden aktiven Gruppen ab, Beispielsweise können unter entsprechenden Additions' oder Kondensationsreaktionen Peptid-, Harnstoff-, Thioharnstoff-, Ester-, Acetal- oder Ätherbindungen geknüpft werden.

Sollten im Trägermaterial überschüssige aktive Gruppen zurückbleiben, die nicht mit den Sübstratproteinen in Reaktion getreten sind, so können diese gewünschtenfalls durch geeignete niedermolekulare Reagentien, z. B, Säureanhydridgruppen durch ein Amin wie Hexamethylendiamin abgebunden werden. 6e

Weitere Möglichkeiten zur Bindung in oder an einen inerten Träger (z. B. Polyacrylamid, Polyamid) bestehen in der Einführung von reaktionsfähigen Gruppen wie Isothiocyanat, reaktionsfähigen Doppelbindungen, Diazoniuiiigruppen, Azogruppen oder reak- tionsfähigen Halogenen in die Substratproteine, die demnach nach den üblichen chemischen Methoden mit dem Träger umgesetzt werden. Ist der Träger seinerseits mit reaktionsfähigen Gruppen ausgestattet, so läßt sioh das Substrat sinngemäß wie vorstehend gezeigt daran binden.

Die Auswahl des Reaktivfarbstoffes richtet sich nach dem bevorzugten Verwendungsbereich des Substrats, Für die Messung der Proteinasc im Blut oder hasmoglobinhaltigen Medien — insbesondere Organextrakten — werden vorzugsweise Farbstoffe verwendet, deren Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich >600 nm liegt, da hierbei eine Beeinflussung durch die Eigenabsorption des Haemoglobins stark zurücktritt. Besonders geeignet ist hierbei ein Farbstoff mit C. I. (= Colour Index) Reactive blue 77. Andere Farbstoffe mit C. I. Reactive blue 3, C. I. Reactive black 31, C. I, reactive blue 7, C. I. 74460, Reactive blue 15, sind zur Substratfärbung ebenfalls geeignet, um einige Beispiele herauszugreifen.

Bei chlorophyllhaltigen Pflanzenextrakten kann man Farbstoffe wählen, die mindestens ein mit dem Pflanzengrün nicht interferierendes Atöorptionsmaximum haben, z. B. ein Farbstoff mit C. L Reactive red 104, oder C. I. Reactive red 21.

Zur Einfärbung des auf oder in dem Träger kovalent gebundenen Substrats werden pH- und Temperaturbedingysigen gewählt, wie sie vom Farbstoffhersteller empfohlen werden. Nach der Reaktion des Farbstoffes mit dem Substrat wird der überschüssige Farbstoff unter Kontrolle der Extinktion in dem entsprechenden Absorptionsmaximum ausgewaschen. Ein. nach diesem Verfahren hergestelltes festes Substrat zur Proteinase-Bestimmung ist um den Faktor 5 bis 100 empfindlicher als die nach dem Stand der Technik eingefärbten hochmolekularen Substrate.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Substrats und von Mitteln, die das Substrat enthalten, zur Messung von Proteinaseaktivitäten. Nach Inkubation der proteinasehaltigen Lösungen mit dem gefärbten trägergebundenen Substrat, die bei I) bis e0°C je nach der Temperaturempfindlichkeit der zu bestimmenden Proteinase durchgeführt werden kann — vorzugsweise werden Temperaturen von 20 bis 40⁰C angewendet — wird der leicht zentrifugierbare und filtrierbare Träger abgetrennt und der freigesetzte Farbstoff in dessen Absorptionsmaximum gemessen. Die dabei erhaltene Extinktion ist in weitem Bereich linear von der zu messenden Proteinaseaktivität abhängig. Extinktionen außerhalb des linearen Bereichs können durch Verdünnung der Enzymlösung vermieden werden. Durch die kovalente Bindung des Substratproteins an den Träger und des Farbstoffes an das Substratprotein ist das Substrat in weiten pH-Bereichen (pH 2 bis 12) während der für den Test benötigten Zeit stabil. Während adsorptiv am Träger angelagerte Substrate durch Änderung des Salzmilieus oder Anwesenheit von Proteinen, z. B. Albumin, leicht abgelöst werden, erlaubt das Substrat gemäß der Erfindung die Verwendung verschiedener Puffersysteffle, je nachdem welches für die Messung der betreffenden Proteinase als optimal atigesehen wird.

Die erfindungsgemäßen Substrate sind geeignet, Proteinasen mit einer bei bekannten Substraten bisher nicht beobachteten Empfindlichkeit zu bestimmen, so z. B. Trypsin, Chymotrypsin, Kollagenase, Bromelain, Ficin oder Pronase Die erfindungsgemäße Herstellung des Substrats und dessen Verwendung zur Bestimmung von Proteinaseaktivität, insbesondere im Blut, Grewebe- und Pflanzenextrakten, ist aus den Ansprüchen zu entnehmen.

Beispiel I

400 mg eines pulverförmiger! Polymerisats aus Maleinsäureanhydrid und Propylen im Molverhältnis I: I werden in 10 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,5 angeteigt und in einem Kältebad aus Eiswasser-Gemisch mit dem gleichen Phosphatpuffer auf 20 ml aufgefüllt. Eine Lösung von 120 mg Humanfibrinogen in 12 ml 0,15 M NaCl-Lösung wird zugefügt. Sodann werden zur Verschließung der überschüssigen Anhydridgruppen 8 ml Hexamethylendiamin hinzugefügt. Der Ansatz wird über Nacht gerührt, abdekantiert und das Gel dreimal mit je 40 ml 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Nach diesem Auswaschen nichtgebundenen Fibrinogens wird das JeI in 75 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 720 mg Na₃PO₄ · 12 H₂O enthält, suspendier? und unter Zusatz ^von 360 mg Farbstoff Cl. Reactive blue 77 3 h bei 40 C in"einem Wasserbad gerührt. Anschließend wird das Gel durch Zentrifugation niedergeschlagen, mit 400 ml einer 0,9%igen Kochsalzlösung bei 80 C aufgerührt danach wiederum zentrifugiert. Dieser Waschvorgang zur Entfernung des überschüssigen, nicht !covalent gebundenen Farbstoffes wird insgesamt lOmal wiederholt, wobei die ersten beiden Waschungen mit einer Kochsalzlösung durchgeführt werden, die auf 100 ml 0,2 ml einer 2 η-Natronlauge enthält. Die folgenden 5 Waschungen erfolgen mit Kochsalzlösung ohne Zusatz. Die 8. Waschung wird mit Kochsalzlösung durchgeführt, die auf 100 ml 0,5 g Rinderalbumin enthält. Die Waschlösung für die letzten beiden Waschungen enthält keine Zusätze. Danach wird abermals zentrifugiert und die Ausbeute bestimmt. Es werden 1,2 g feucht gewogenes Substrat erhalten. Für die Herstellung einer Substratpräparation zur Bestimmung von Plasmin wird der Niederschlag in 3,6 ml eines 0,1 M Natriumeitratpuffers vom pH-Wert 7,4 suspendiert. Das auf diese Weise erhaltene Proteinasesubstrat kann direkt zur Aktivitätsbestimmung verwendet werden.

Gleich gute Werte werden erhalten, wenn das Substrat zur Lagerung lyophilisiert und unmittelbar vor der Verwendung in der entsprechenden Menge Wasser resuspendiert wird.

Beispiel 2

150 mg Fibrinogen vom Rind in 20 ml 0,15 M-NaCl werden mit 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,6 und anschließend portionsweise mit 15 mg Maleinsäureanhydrid versetzt und eine halbe Stunde bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Das so erhaltene Maleoylfibrinogen wird in einem Polymerisationsansatz nach L. Ornstein (Annal. N.Y. Acad. Sei. 121, 321, 1964) mit Acrylamid «!polymerisiert. Für den Polymerisationsansatz werden die von Ornstein vorgeschlagenen Lösungen A und C sowie eine Ammoniumperoxydisulfatlösung folgender Zusammensetzung verwendet :

Lösung A:
48 ml 1 n-HCl

36,3 g Trishydroxymethylaminomethan
0,46 ml TEMED = Tetraäthylmethyl-äthylen-

diamin
ad 100 ml destilliertes Wasser

Lösung C:

(nach Ornstein, abgewandelt)

30 g Acrylamid

1,5 g Methylenbisacrylamid

ad 100 ml destilliertes Wasser

Ammoniumperoxydisulfat:

I %ige Lösung in destilliertem Wasser.

Die Copolymerisation von 25 ml der oben erhaltenen Maleoylfibrinogen-Lösung wird durch Zusatz von 5 ml der Lösung A, 6,25 ml der Lösung C und 1,25 ml Ammoniumperoxydisulfatlösung eingeleitet und durch einstündiges Stehenlassen bei Zimmertemperatur vollendet. Danach wird das Gel mit 80 ml 0,9°/,iger Kochsalzlösung überschichtet und mit einem Laborhomogenisator (Ultra Turrax) zerkleinert. Das Produkt wird zentrifugiert und mit der gleichen Menge einer 0,9%-igen Kochsalzlösung gerührt, darauf abermals abzentrifugiert und der Ruckstand in 24 mi eines Trinairiumphosphatpuffers, der 0,9 g Triiiatriumphosphat ent-

_ao hält, suspendiert. Dazu werden 0,45 g Farbstoff mit C. I. Reactive blue 77 gegeben. Die Mischung wird 3 h bei 40 C gerührt. Der überschüssige Farbstoff wird sodann wie in Beispiel 1 ausführlich dargestellt ausgewaschen, wobei für einen Waschvorgang jeweils 240 ml einer 0,9 %igen Kochsalzlösung und gegebenenfalls die in Beispiel I angeführten Zusätze verwendet werden.

Beispiel 3

3 g Haemoglobin vom Pferd werden in 300 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 gelöst und mit 900 mg pulverisiertem Maleinsäureanhydrid versetzt. Anschließend wird noch eine halbe Stunde gerührt. Das dabei entstandene Maleoylhaemoglobin wird entsprechend Beispiel 2 mit Acrylamid zu einem 5%igen Acrylamidgel «!polymerisiert. Für die Polymerisation werden die in Beispiel 2 angegebenen Lösungen nach Ornstein in folgenden Mengenverhältnissen eingesetzt:

Zu 300 ml der Maleoylhaemoglobinlösung werden 60 ml der Lösung A nach Ornstein, 75 ml der Lösung C und 15 ml der 1 %igen Ammoniumperoxydisulfatlösung gegeben.

Nach I h bei Zimmertemperatur wird das Gel mit 900 ml 0,9%iger Kochsalzlösung überschichtet und mit einem Laborhomogenisator (Ultra Turrax) zerkleinert.

Das Kopolymerisat wird zentrifugiert und mit dem gleichen Volumen einer 0,9%igen Kochsalzlösung kurz gerührt, danach zentrifugiert und der Rückstand in 450 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 10,8 g Na₃PO₄ · 12 HjjO enthält, suspendiert und 'lei 25 C mit 5,4 g Farbstoff mit C. I. Reactive blue 77 18 h gerührt. Der überschüssige Farbstoff wird wie im Beispiel 1 beschrieben ausgewaschen, wobei in der angegebenen Reihenfolge jeweils 4,51 der Waschlösung eingesetzt werden.

Beispiel 4

1 g Fibrinogen wird in 100 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,4 gelöst und mit 10,4 mg (10 μΐ) Crotonsäureanhydrid umgesetzt. Das beim Stehen des Ansatzes gebildete Crotonylderivat des Fibrinogens wird entsprechend Beispiel 2 mit Acrylamid bei pH 8,5 zu einem 4%igen Gel «!polymerisiert. Hierzu werden 100 ml der Crotonylfibrinogenlösung mit den im Beispiel 2 beschriebenen Polymerisatslösungen nach

Ornstein umgesetzt, wobei hier 25 ml Lösung A, 20 ml Lösung C und 5 ml Ammoniumperoxydisulfat zugegeben werden. Nach 1 h wird das Gel mit 300 ml 0,9%iger Kochsalzlösung überschichtet, mit einem

Laborhomogenisator zerkleinert, anschließend zentrifugiert, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, abermals zentrifugiert und in 150 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der I g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 0,5 g C. I. Reactive blue 77 bei 40" C umgesetzt. Der überschüssige Farbstoff wird g*tiiiäß Beispiel I unter Verwendung von jeweils 1,5 I der Waschlösung ausgewaschen.

Beispiel S

IO g Gelatine werden in 0,l IvI Phosphatpuffer pH 8,5 bei 60 C gelöst und bei etwa 30¹C mit 56,5 μΙ (58,5 mg) Allylisothiocyanat umgesetzt. Es entsteht das Allylisothiohamstoffderivat. Dieses wird entsprechend Beispiel 2 mit Acrylamid bei pH 8,5 zu einem 4%igen Gel copolymerisiert. Hierzu werden 100 ml einer IO%igen Allylsiothioharnstoff-Gelatine-Lösung mit den in Beispiel 2 angeführten Lösungen nach Ornstein umgesetzt, wobei hier 25 ml Lösung A, 20 ml Lösung C und 5 ml Ammoniumperoxydisulfatlösung zur Anwendung gelangen. Nach I h wird das Gel mit 300 ml 0,9%iger Kochsalzlösung überschichtet, mit einem Laborhomogenisator zerkleinert, zentrifugiert, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, abermals zentrifugiert und in 150 ml eines Trinatriumphosphatpuffcrs, der 9,2 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 4,6 g Farbstoff mit C. I. Reactive blue 77 bei 40° C umgesetzt. Der überschüssige Farbstoff wird gemäß Beispiel I unter Verwendung von jeweils 1,5 I der Waschlösung ausgewaschen.

Beispiel 6

100 ml Haemaccel® mit einem Eiweißgehalt von 10% werden mit 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,5 gemischt und mit 56,5 mg Maleinsäureanhydrid bei 30C umgesetzt. Das maleoylierte Haemaccel wird gemäß Beispiel 2 mit Acrylamid bei pH 8,5 zu einem 4%igen Gel copolymerisiert. Hierzu werden 200 ml der Maleoyl-Haemaccel-Lösung mit den im Beispiel 2 beschriebenen Polymerisationslösungen nach Orn-

wr*K*»t lii*»r

ml I/>ciinrr Δ A(\ ml

Lösung C und 10 ml Ammoniumperoxydisulfatlösung zugegeben werden. Nach 1 h wird das Gel mit 600 ml 0,9%iger Kochsalzlösung überschichtet, mit einem Laborhomogenisator zerkleinert, zentrifugiert, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen, abermals zentrifugiert und in 300 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 9,2 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 4,6 g Farbstoff C. I. Reactive blue 77 bei 40⁰C umgesetzt. Der überschüssige Farbstoff wird gemäß Bei- 5<> spiel 1 unter Verwendung von jeweils 3 1 der Waschlösung ausgewaschen.

Beispiel 7

1 g Casein wird in 0,1 M Citratpuffer pH 7,4 zu einer 10%igen Lösung gelöst. Bei Zimmertemperatur werden 0,2 ml Polyäthylenglycol-a,tu di-(Sulfophenyl-4-isothiocyanat) mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 6000 zugesetzt und bis zum Erstarren gerührt. Nach 1 h wird das Gel zerkleinert. Nach Auswaschen des nicht gebundenen Proteins mit 2 · 50 ml eines 0,1 M Citratpuffers pH 7,4 wird das Gel zentrifugiert und in 50 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 1 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 0,5 g Farbstoff C. I. Reactive red 104 versetzt und 3 h bei 40° C gehalten. Der überschüssige Farbstoff wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von jeweils 1 1 Waschlösung ausgewaschen.

Beispiel 8

600 mg α-Casein werden in 0,05 M Trispuffer pH 7,5, der 0,09 M-NaCI enthält, zu einer 3%igen Lösung gelöst und I h auf 80 C erhitzt. Nach Abkühlen auf 30⁰C werden 0,15 ml Polyäthylenglycol-α,ίυ di-(SuIfophenyl-4-isothiocyanat) mit einem Molekulargewicht zwischen 500 und 1000 zugesetzt und das Gemisch bis zum Erstarren gerührt. Nach I h wird das Gel zerkleinert und das nicht gebundene Protein mit 2 · 100 ml eines 0,1 M Citratpuffers pH 7,4 ausgewaschen, zentrifugiert und in 20 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 600 mg Trinatriumphosphat enthält, suspendiert. Zu dieser Suspension werden 300 mg Farbstoff C. I.

Reactive blue 3 zugesetzt, 30 Min. bei 40 C gehalten und anschließend noch 30 Min. auf 80"C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der überschüssige Farbstoff gemäß Beispiel i unter Verwendung von jeweils 200 mi Waschlösung ausgewaschen.

IO Versuch I

Zu 50 mg eines aus Suspension in phys. Kochsalz gefriergetrockneten Substrats nach Beispiel 2 werden

_a, 2 ml aqua dest. und 2 ml 0,1 molaren Citratpuffers pH 7,4 pipettiert und der Ansatz 5 min bei Zimmertemperatur gelassen. Anschließend wird mit einem Glasstab eine homogene Suspension hergestellt und diese 5 min bei 37"C im Wasserbad inkubiert. 2 ml Citratblut von einem Patienten unter Fibrinolysetherapie werden sofort nach der Abnahme aus der Armvene zum Substrat gegeben und der Ansatz gut durchgemischt. Es wird 15 min bei 37°C unter 3maligem Umschütteln inkubiert. Der Abbau wird nach 15 min durch Zusatz von 1 ml einer verdünnten Lösung des KunitzTrypsin-lnhibitors mit 500 KIE/mlgestoppt. Nach Abschleudern des Substrats durch 10 min Zentrifugation bei 3000 UpM in einer Laborzentrifuge wird der klare Überstand abgehebert und bei 665 nm im Spektralfotometer gemessen. An Hand einer Eichkurve läßt sich die Piasminaktivität ablesen. Für einen Patienten nach 10 min Fibrinolysetherapie ergab sich z. B. eine ΔΕ 665 nm von 0,235 OE. Aus einer Eichkurve, die mit Hilfe definierter Mengen Plasmin erstellt wurde und die als Figur beigefügt ist, liest man eine Piasminaktivität von 0,16 Einheiten nach Remmert & Cohen für diesen Zeitpunkt ab.

Unter Abänderung der Versuchsbedingungen lassen sich beispielsweise folgende Enzyme bestimmen:

30

35

Enzym	Substrat1)	Puffer	PH	Inkuba	Inkuba
				tionstem	tions-
				peratur	dauer
				CQ	(min)

Trypsin Hae- 0,05 M 8,0 37 15

maccel Tris

Chymo- Gelatine 0,05 M 7,5 37 15

trypsin Phosphat

Kolla- Kollagen 0,1 M 7,4 37 30

genäse Citrat

Bro- Casein 0,1 M 4,0 40 30

melain Acetat

Ficin Haemo- 0,05 M 8,5 40 20

globin Tris

Pronase Casein 0,06 M 9,0 40 10

Borat

'·) Träger und Farbstoff können beliebig gewählt werden.

Versuch 2

Vergleich der Empfindlichkeit des erfindungsgemäß hergestellten Substrats mit einem dem Stand der bisherigen Technik entsprechenden Handelsprodukt, hergestellt aus dem denaturierten Kollagen der Kuhhaut, an welcher ein blauer Farbstoff gebunden ist, beim jeweiligen Absorptionsmaximum. Als Enzym wird Trypsin (Serva, 2 · krist.) verwendet. Der Abbau wird in 0,05 M-Tris pH 7,8 bei 37"C 15 min durchgeführt und mit einem Proteinaseninhibitor gestoppt. Das Volumen des Reaktionsansatzes betrug 6 ml.

Wie aus den Vergleichszahlen ersehen werden kann, ist das erfindungsgemäß hergestellte Substrat wesent

lich empfindlicher als Technik.

10

das Substrat des Standes der

Trypsinmenge	Substrat I	Substrat Il
	(Handelsprodukt)	(erfindungsgem.
		Substrat)
ng	ΔΕ 595 nm	ΔΕ 665 nm

0	0,00	0,00
10	nicht getestet	0,045
50	0,001	0,260
100	0,004	0,485
10000	0,670	nicht getestet

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (13)

1 2 Patentansprüche; 14, Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Proteinasebestimmung nach Anspruch 1, da-

1. Wasserunlösliches, farbstoSbaltiges Substrat durch gekennzeichnet, daß ein mit reaktiven Grupzur Proteinasebestimraung, gekennzeichnet pen ausgestattetes lösliches Polymeres mit dem Subdurch ein Substratprotein, das in feiner Ver- 5 stratprotein vernetzt und das Reaktionsprodukt teilung in oder auf der Oberfläche eines synthe- mit einem Reaktivfarbstoff eingefärbt wird, tischen polymeren Trägers koyalent gebunden 15, Verwendung eines Substrats nach Ansprü- und mit einem Reaktivfarbstoff eingefärbt ist, chen 1 bis IO zur Messung von ProteinaseiJctivität

2. Substrat gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn- insbesondere in gefärbten Lösungen.

zeichnet, daß das Substratprotein Haemoglobin, ίο 16, Mittel zur Proteinasebestimmung enthaltend

Casein, Fibrinogen, Kollagen oder ein Umwand- ein Substrat gemäß Ansprüchen 1 bis 10. lungsprodukt eines dieser Proteine ist.

3. Substrat gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Homopolymeres eines aktiven Monomeren oder ein Copoly- 15 meres aus einem aktiven und einem inaktiven Monomeren ist.

4. Substrat gemäß Anspruch 3, dadurch gekenn- Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches, farbzeichnet, daß das aktive Monomere Maleinsäure- stoffhaltiges Substrat zur Proteinasebestimmung soanhydrid, Ootonsäureanhydrid oder Allylisothio- ao wie dessen Herstellung, das sich insbesondere zur cyanat ist Verwendung in gefärbten Lösungen, beispielsweise

5. Substrat gemäß Anspruch 3, dadurch gekenn- in haemoglobin- oder chlorophyllhaltigen Medien, zeichnet, daß das inaktive Monomere Propylen, eignet.

Acrylamid oder Butadien ist. Für die Proteinasebestimmung wird in der Literatur

6. Substrat gemäß Ansprüchen 3 bis 5, dadurch »5 eine große Zahl von Verfahren beschrieben, die sich gekennzeichnet, daß der Träger ein Copolymeres im wesentlichen in zwei Gruppen einteilen lassen, aus Maleinsäureanhydrid und Acrylamid mit einem nämlich einerseits solche, bei denen hochmolekulare Anteil von bis zu etwa 6 Molprozent Maleinsäure- Eiweißkörper gespalten werden und andererseits anhydrid ist. solche, die auf einer Hydrolyse von niedermolekularen

7. Substrat gemäß Ansprüchen 3 bis 5, dadurch 30 Substanzen wie Estern und Amiden beruhen. Bei der gekennzeichnet, daß der Träger ein Copolymeres zweiten Gruppe besitzen die Spaltprodukte häufig eine aus Maleinsäureanhydrid un»i Butadien mit einem veränderte Lichtabsorption gegenüber dem intakten Anteil von bis zu etwa 90 Molprozent Malein- Substrat. Die Änderung der Lichtabsorption beim säureanhydrid ist. Absorptionsmaximum der Spaltprodukte wird hierbei

8. Substrat gemäß Ansprüchen 3 bis 5, dadurch 35 meist als ein Maß für die Enzymaktivität verwendet, gekennzeichnet, daß der Träger ein Copolymeres Üblicherweise wird angenommen, daß die Wirkung aus gleichen Teilen Maleinsäureanhydrid und Pro- der Proteinase auf hochmolekulare Substrate im gleipylen ist. chen Sinne wie am niedermolekularen Material ver-

9. Substrat gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch läuft. Diese Voraussetzung ist jedoch in komplexen gekennzeichnet, daß der Träger ein Homopoly- 40 Systemen, die neben den Enzymea auch Inhibitoren meres aus Maleinsäureanhydrid ist. enthalten, beispielsweise im Blut, nicht gegeben.

10. Substrat gemäß Ansprüchen I bis 9, dadurch Mit hochmolekularen Substraten wie Haemoglobin, gekennzeichnet, daß der Reaktivfarbstoff ein sol- Gelatine oder Casein kann man die proeolytische eher mit einem Absorptionsmaximum im Wellen- Wirkung einer Lösung korrekt bestimmen. Sie haben bereich >600 nm ist. 45 aber den Nachteil, daß sie nach der Inkubationszeit

11. Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur mit dem Enzym durch Fällung von den Abbaupro-Proteinasebestimmung nach Anspruch 1, dadurch dukten und anschließend häufig noch mittels empfindgekennzeichnet, daß ein Träger aus einem Copoly- licher chemischer Reaktionen nachgewiesen werden merisat eines aktiven und eines inaktiven Mono* müssen. Dadurch ergeben sich große Fehlerbreiten bei meren mit einem Substratprotein derart umgesetzt 5° diesen Aktivitätsmessungen. Darüber hinaus treten bei wird, daß die aktiven Gruppen des Trägers mit beiden Gruppen von Bestimmungsmethoden beträchtdenen des Substratproteins kovalente Bindungen liehe Mängel dann zutage, wenn die Meßverfahren eine eingehen und das Reaktionsprodukt mit einem optische Ablesung erfordern und die.proteinasehaltige Reaktivfarbstoff eingefärbt wird. Lösung eine mit dem Meßbereich interferierende eigene

12. Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur 55 Absorption zeigt.

Proteinasebestimmung nach Anspruch 1, dadurch Es ist schon versucht worden, hochmolekulare Sub-

gekennzeichnejf, daß ein Träger, der keine aktiven strate mittels reaktiven Farbstoffen einzufärben und

Gruppen enthält, mit einem Substratprotein unter die hydrolytische Proteinasewirkung durch Messung

Zuhilfenahme eines aktive Gruppen liefernden der abgespaltenen Farbstoffmenge photometrisch zu

Stoffes umgesetzt und das Reaktionsprodukt mit 60 bestimmen (Liter.: H. Rinderkneeht et al., Clin.

einem Reaktivfarbstoff eingefärbt wird. Chim. Acta 21, 197 bis 203 [1968]). Diese Methode hat

13. Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur jedoch den Nachteil, daß ihre Empfindlichkeit bei Proteinasebestimmung nach Anspruch 1, dadurch Verwendung von gefärbtem Hautpulver wesentlich gekennzeichnet, daß in ein Substratprotein reaktive von dessen Partikelgröße beeinflußt wird. Gruppen eingeführt werden, das sodann mit einem 65 Es wurde nun ein wasserunlösliches, farbstoffinaktiven Monomeren copolymeriseirt wird, und haltiges Substrat zur Proteinasebestimmung gefundaß das Reaktionsprodukt mit einem Reaktivfarb- den, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Substoff eingefärbt wird. stratprotein in feiner Verteilung in oder auf der