AT403963B - Verfahren zur quantifizierung und bestimmung der funktionalität von kollagen-bindenden proteinen - Google Patents

Description

AT 403 963 B

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Kollagen-Konjugat, die Verwendung des Kollagen-Konjugates in einem Kollagenbindungstest, sowie ein Verfahren zur Quantifizierung und Bestimmung der Funktionalität von Kollagen-bindenden Proteinen in einem biologischen Material.

Die Blutgerinnung wird durch eine Reihe von aufeinanderfolgenden Reaktionen verschiedener Proteine 5 und Enzyme ausgelöst. Durch einen Mangel oder eine Fehlfunktion eines Blutgerinnungsfaktors wird die Bildung des Wundverschlusses verhindert, die Folge sind Blutungen, die bis zum Tod führen können. Ein solcher Fall liegt z.B. bei der von Willebrand-Krankheit vor, die durch das Fehlen oder eine Störung des Adhäsionsfaktors vWF gekennzeichnet ist.

Der von Willebrand-Faktor ist ein multimeres Plasmaprotein, bestehend aus Untereinheiten mit Moleku-io largewichten von 225,000 D. Zwei Untereinheiten bilden ein über Schwefelbrücken verbundenes Dimer mit einem Molekulargewicht von 450,000 D. Durch kovalente Verknüpfung werden aus den vWF-Dimeren Polymere mit Molekulargewichten von 1 Million und mehr gebildet. Bei der Blutgerinnung erfüllt der vWF zwei wesentliche Aufgaben. 1. Der vWF bindet den Gerinnungsfaktor VIII (FVIII), und 2. verfügt der vWF über adhäsive Eigenschaften, die die Aggregation von Blutplättchen und deren Bindung an das Subendo-75 thelium der Gefäßwand, via Kollegen, vermitteln. Es wird allgemein davon ausgegangen, daß die Funktionalität des vWF wesentlich von seiner Multimerstruktur abhängt. So wird angenommen, daß nur die hochmolekularen vWF-Polymere die hämostatisch aktiven Moleküle darstellen.

Die verschiedenen Erscheinungsbilder der von Willebrand-Krankheit (vWD) sind durch den Verlust der hochmolekularen vWF-Polymere gekennzeichnet, offenbar Ergebnis der verringerten adhäsiven Eigenschaf-20 ten des vWF, was zur Blutungsneigung und Verlängerung der Blutungszeit führt. Aufgrund des vWF-Musters findet eine Klassifizierung der von Willebrand-Krankheit in 3 Haupttypen sowie mehrere Subtypen statt. Im Blut von Typ I-Patienten wird eine quantitative Reduktion aller vWF-Multimeren, verbunden mit einem reduziertem vWF-Antigengehalt <vWF:Ag) und vWF Ristocetin-Cofaktor-Aktivität (vWF:RCo) gefunden, während sich der Typ III durch ein komplettes Fehlen des vWF auszeichnet. Der Typ II ist durch eine 25 qualitative Abnormität und die Abwesenheit der mittelgroßen und großen vWF-Multimere sowie stark reduzierte vWF:RCo-Aktivität charakterisiert. Da die hochmolekularen vWF-Multimeren die ausgeprägtesten adhäsiven Eigenschaften besitzen, führt diese qualitative Abnormität des vWF ebenfalls zur Blutungsneigung und Verlängerung der Blutungszeit.

Zur Differentialdiagnose der vWD werden eine Reihe von Untersuchungen durchgeführt. Gebräuchlich 30 sind der Hautblutungstest und funktionelle Tests, die die adhäsiven Eigenschaften des vWF untersuchen. Bei der Charakterisierung der adhäsiven Eigenschaften des vWF wird üblicherweise die Blutplättchenaggregation untersucht. Dazu wird vWF mit Formalin-stabilisierten Blutplättchen und dem unphysiologischen Antibiotikum Ristocetin gemischt, und die Zeitdauer und Intensität der Plättchenaggregation gemessen. Dieses Meßsystem (Ristocetin-abhängige Plättchenaggregation) spiegelt jedoch nicht die physiologische 35 Situation und Funktion des vWF wider.

Ein anderes System zur Erfassung der adhäsiven Eigenschaften des vWF besteht in der Bestimmung der Bindung des vWF zu Kollagen. Kollegen stellt eine Grundsubstanz des subendothelialen Gewebes dar. Das Kollagen Typ III ist der Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix der Blutgefäße. Er verleiht diesen eine hohe mechanische Festigkeit bei gleichzeitiger Elastizität. Das Kollagen ist in intakten Blutgefäßen 40 durch einen Monolayer von einer das Blutgefäß luminal ausgekleideten Endothelzellschicht von den zellulären und löslichen Blutkomponenten isoliert. Bei einer Gefäßverletzung wird das Endothel lokal zerstört, sodaß nun direkter Kontakt zwischen Kollagen und Blut erfolgen kann. An das exponierte Kollagen bindet sich das Plasmaprotein vWF, das wiederum durch den vWF-Rezeptor (GP Ib/IX) und den aktivierten Fibrinogen-Rezeptor (GPIIb/llla) der Blutplättchen gebunden werden kann. Dadurch kommt es zur vWF-45 vermittelten Adhäsion der Blutplättchen an das freiliegende Subendothel und somit zum ersten, labilen Wundverschluß. Die vorwiegend in tieferen Gefäßschichten lokalisierten Kollagene des Typs I und Typs VI sind ebenfalls an der Bindung des vWF an das Subendothel beteiligt.

Die Bestimmung einer vWF-Kollagen-Bindung entspricht dabei der physiologischen Funktion des vWF. Über die exakte Bindungsstelle von vWF an Kollagen besteht noch Unklarheit. Es gibt jedoch Hinweise, so daß die A1 und A3 Domäne von vWF-Bindungsstellen für Kollagen besitzen (Ruggeri et al. (1993), FASEB J. 7:308-316). Cruz et al. ((1995), J. Biol. Chem. 270:10822-10827) geben als wahrscheinlichste Bindungsstellen die Aminosäuresequenz zwischen Glu1018 und Arg11u in der A3-Domäne an. Die Bindung des vWF an den vWF-Rezeptor GP Ib der Blutplättchen wiederum erfolgt durch Bindungsstellen innerhalb des Loops Cys5o9-Cys695 von vWF (Ruggeri et al. (1992), Thromb. Haemost. 67:594-599). 55 In vergleichenden Untersuchungen konnte eine gute Übereinstimmung der Kollagen-Bindungsdaten mit den Ergebnissen der Ristocetin-abhängigen Plättchenaggregation gezeigt werden (Brown et al. (1986), Thromb. Res. 43:303-311, Favaloro et al. (1994), Am. J. Hematol. 45:205-211, Thomas et al. (1994), Hämostaseologie 14: 133-139) und es wurde vorgeschlagen, den vWF:RCo-Test gegen einen Kollagen- 2

AT 403 963 B ELISA zur Bestimmung der vWF-funktionellen Aktivität in vitro auszutauschen. Aufgrund der hohen Affinität der hochmolekularen vWF-Multimeren für Kollegen (Favaloro et al. (1995), Am. J. Clin. Pathol. 104:264-271) eignet sich dieser Test besonders gut zur Differenzierung von vWD Typ II- und Typ Ill-Patienten und Gesunden. Die wesentlichen Vorteile des Kollagenbindungstests im Vergleich zum Ristocetin-Bindungstest 5 liegen aber nicht nur in der besseren physiologischen Relevanz, sondern auch im geringeren apparativen Aufwand und der einfacheren und schnelleren Durchführung. Neben einer Anwendung des Kollagenbin-dungstest bei der Klassifizierung der von Willebrand-Krankheit wurde vorgeschlagen, diesen Test auch zum Monitoring von Patienten mit vWD während und nach der Behandlung mit Desmopressin, für die Qualitätssicherung des vWF in Blutgerinnungsfaktor Vlll-Präparaten, sowie zur Beobachtung von Patienten mit io anderen Erkrankungen, wie beispielsweise akuter lymphoblastischer Leukämie, hämolytisch-urämischem Syndrom (Moschkowitz-Syndrom) oder autoimmun-thrombotischer Purpura anzuwenden (Favaloro et al. (1994), Am. J. Hematol. 45:205-211, Brown et al. (1986), Thromb. Res. 43: 303-311, Thomas et al. (1994), Hämostaseologie 14:133-139) oder ein Einsatz des Kollagenbindungstest zum Nachweis und zur Klassifizierung der Kollagen-spezifischen Autoantikörper bei rheumatoider Arthritis und bei systemischem Lupus 75 ’ erythematosus.

Zur Bestimmung der vWF-Kollagen-Bindung wurden bisher solche Systeme vorgeschlagen, in denen Kollagen mittels unspezifischer hydrophober Wechselwirkungen an synthetische Oberflächen, z.B. Mikrotitrationsplatten, angelagert wurde. Aufgrund seiner Funktion als fibrilläres Protein ist Kollagen unter physiologischen Bedingungen nicht löslich. Im gereinigten Zustand kann es nur durch starke Säuren oder Salze in 20 Lösung gebracht werden. Insbesondere im neutralen und basischen pH-Bereich wird gelöstes Kollagen wieder unlöslich und fällt aus der Lösung aus. Bei der Verwendung von synthetischen Oberflächen, z.B. Mikrotitrationsplatten, zur Immobilisierung von Proteinen müssen neutrale bis basische Pufferbedingungen erzeugt werden, um Proteine über unspezifische Bindungen an diese Oberflächen zu binden. Durch die Unlöslichkeit von Kollagen, insbesondere unter basischen Bedingungen, ist dieser Weg zur Bindung von 25 Kollagen an synthetische Oberflächen nicht erfolgreich. Um dennoch Kollagen über einen unspezifischen Mechanismus an synthetische Oberflächen zu binden, war es bisher notwendig, sehr hohe Kollagenkonzen-trationen einzusetzen, um zumindest geringe Bindungen zur synthetischen Oberfläche herzustellen.

Brown et al. (1986, Thromb. Res. 43:303-311) inkubierten 3,3 ug Kollagen/Mikrotiterplattenvertiefung ( = 33 mg/ml) über Nacht, wobei bei der Verdünnung darauf geachtet wurde, daß Kollagen nicht ausfällt. Um 30 die Dauer der Bindung von Kollagen an synthetische Oberflächen zu verkürzen, verwendete Bockenstedt et al. (1986, J. Clin. Invest. 78:551-556) 187 ug Kollagen/Mikrotiterplattenveiüefung (1,87 mg/ml, in 0,05 M Essigsäure gelöst) und eine Inkubationsdauer von 1,5 Stunden zur Herstellung einer synthetischen Kolla-genoberfläche. Unter diesen Bedingungen wurden maximal 10 ug Kollagen/Mikrotiterplattenvertiefung, also 1/18 der eingesetzten Menge, gebunden. Die Bindungskapazität betrug dabei 7,5 ng vWF/ug Kollagen. 35 Favaloro et al. (1991, Blood Coagul. Fibrinol. 2: 285-291) benutzen ein spezielles HORM-Kollagen und eine isotonische Glucoselösung mit pH 2,8 als Bindungslösung und eine Inkubationszeit von mindestens 48 Stunden, um eine Bindung von 10 ug Kollagen/Mikrotiterplattenvertiefung ( = 50 ug/ml, in einer isotonischen Glucose-Lösung mit pH 2,8) an die Oberfläche zu erzielen, van Genderen et al. (1994, Blood 84: 3378-3384) benutzen 20 ug Kollagen/Mikrotiterplattenvertiefung (=200 ug/ml, gelöst in 20 mmol Essigsäure) mit 40 einer Kontaktdauer von mehr als 12 Stunden zur Darstellung einer synthetischen Kollagenoberfläche. 5 ug Kollagen/Mikrotiterplattenvertiefung ( = 50 ug/ml, in Essigsäure gelöst) und Bindungszeiten von mehr als 12 Stunden wurden von Niesvizky et al. (1994, J. Lab. Clin. Med., 123:137-142) verwendet.

Die angeführten Verfahren zur passiven Immobilisierung von Kollagen benötigen entweder hohe Kollagenkonzentrationen und/oder eine lange Kontaktzeit, um synthetische Kollagenoberflächen darzustel-45 len. Durch die Länge der Inkubationszeit von Kollagen mit der synthetischen Oberfläche ist außerdem davon auszugehen, daß ein Großteil des Kollagens frühzeitig aus der Inkubationslösung ausfällt und somit nicht für die Bindung an der Oberfläche zur Verfügung steht.

Thomas et al. (1994, Hämostaseologie 14: 133-139) beschreiben eine vWF-Kollagenbindungsaktivitäts-(CBA)-ELISA, der für die Handhabung im Routinelabor geeignet und standardisierbar ist, und bei dem so diesselben Probenverdünnungen, Puffer und Instrumente wie bei einem ELISA für vWF:Ag benutzt werden können. Sie konnten zeigen, daß die mit dem vWF:CBA-ELISA ermittelten Daten gut mit den vWF:RCo-Werten korrelieren. Die durch unspezifische Wechselwirkung mit 3 ug Koliagen/Mikrotiterplattenvertiefung beschichteten Platten konnten bei 4*C jedoch nur 48 h gelagert werden.

Zur Bestimmung der Kollagenase-Aktivität wurde von Wilkinson et al. (1990, Anal. Biochem. 185:294-55 296) ein alternatives Verfahren zur Kopplung von Kollagen an Mikrotiterplatten beschrieben. Kollagen wurde mittels Biotin-N-Hydroxysuccinimid-Ester im Proteinanteil biotinyliert und an Avidin-modifizierte Mikrotiter platten durch hochaffine Bindung immobilisiert. Durch dieses Vorgehen konnte bei einer Konzentration von 5 ug biotinyiiertem Kollagen/Mikrotiterplattenvertiefung (50 ug/ml) die Beschichtungszeit auf 1 Stunde bei 3

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Raumtemperatur reduziert werden. Die so erhaltene Kollagenoberfläche wurde mit Koilagenase inkubiert und über die freigesetzten, biotinylierten Kollagenbruchstücke die Koliagenase-Aktivität bestimmt. Die Biotinylierung führt dabei zur Bindung an die primären Aminosäuren des Kollagens, wodurch ein derart modifiziertes Molekül möglicherweise in seinen Bindungseigenschaften und seiner Affinität zu funktionell Kollagen-bindenden Proteinen beeinträchtigt wird Ob ein im Proteinteil verändertes Kollagen noch in der Lage ist, an ein adhäsives Protein zu binden, ist daher nicht vorhersagbar.

Die EP 0 713 707 beschreibt eine Kollagen-Polymer-Matrix, bei der Kollagen über primäre Aminogruppen, insbesondere Lysinreste im Proteinteil kovalent an ein aktiviertes, synthetisches Polymer gebunden wird. Die nicht an das Polymer gebundenen primären Aminogruppen des Kollagens werden zur weiteren Kopplung eines biologisch aktiven Agens benutzt. Die Kollagen-Polymer-Matrix wird zur Herstellung von Implantaten in der Medizin verwendet.

Siekmann et al. (1995, Thromb. Haemost. 73:1160) beschreiben mehrere Varianten eines vWF-Kollagenbindungs-ELISAs und stellten fest, daß abhängig von der Art der Kopplung des Kollagens an die Matrix (unspezifische Bindung oder Bindung über polyklonale Kollagen-Antikörper) das Detektionslimit zwischen 15 und 50 ng vWF/ml Ausgangslösung liegt. Die Variante der Bindung von Kollagen über polyklonale Antikörper an die Matrix benötigten dabei eine geringere Kollagenkonzentration und lieferte eine höhere Sensitivität als eine passive Immobilisierung.

Santoro et al. (1977, J. Clin.lnvest. 60:1054-1060) charakterisieren Periodat-oxidiertes Kollagen und zeigen, daß der Kohlenhydratanteil des Kollagens nicht für die Plättchenaggregation notwendig ist.

Shadle et al. (1982, J. Cell Biology 95: 361-365) koppelten Kollagen kovalent an Plastikträger und modifizierten die Oligo saccharide des Kollagens, um dem Einfluß des Kohlenhydratanteils des Kollagens auf die Plättchenadhäsion zu untersuchen.

Ein Problem der Verwendung eines Kollagenbindungstestsystems zur Bestimmung der Affinität eines Adhäsionsproteins an Kollagen stellt die Bereitsstellung einer einheitlich mit Kollagen beschichteten Oberfläche dar. Ein weiteres Problem bei der Verwendung von mit herkömmlichen Methoden beschichteten Kollagen-Trägern ist ihre kurze Lagerfähigkeit, da das Kollagen auch im sauren pH-Bereich nach einiger Zeit ausfällt und sich wieder vom Träger löst oder auch aggregiert. Dadurch wird die Sensitivität und die Reproduzierbarkeit des Testsystems stark beeinträchtigt. Für einen ausreichend guten CBA-Test wurden daher bisher die beschichteten Träger erst kurz vor Gebrauch hergestellt und anschließend unmittelbar verwendet. Für den Einsatz in der Routine oder gar die kommerzielle Produktion von Testsystemen zur Bestimmung der CBA eines Kollagen-bindenden (Plasma)-Proteins sind die im Stand der Technik beschriebenen beschichteten Träger daher nur begrenzt ersetzbar.

Aufgabe der Erfindung ist es daher eine stabile Kollagen-Oberfläche zur Verfügung zu stellen, die die oben beschriebenen Nachteile nicht aufweist, einfach herzustellen und zu standardisieren ist. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Kollagen-bindenden Proteinen, insbesondere von Proteinen mit adhäsiven Eigenschaften.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Kollagen-Konjugat zur Verfügung gestellt wird, das aus einem Träger und Kollagen, das mindestens eine Modifikation im Kohlenhydratanteil aufweist, über die eine stabile Immobilisierung an einen Träger erfolgt, ohne die Bindungskapazität des Kollagens zu einem Kollagen-bindenden Protein im wesentlichen zu beeinflussen, besteht. Überraschenderweise wurde gefunden, daß es möglich ist, Kollagen chemisch zu modifizieren und modifiziertes Kollagen mittels kovalenter Bindung, an einen Träger zu fixieren, ohne die Affinität zwischen einem Kollagen-bindenden Protein und Kollagen zu beeinflußen, indem eine Modifikation im Kohlenhydratanteil eingeführt wird. Die Bindungskapazität und Bindungseigenschaften des Kollagens zu einem Kollagen-affinen Protein bleiben im erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat insbesondere dadurch unbeeinträchtigt, da gemäß der vorliegenden Erfindung die Modifikation des Kollagens im Kohienhydratanteil des Moleküls erfolgt, wodurch mögliche Bindungsstellen für adhäsive Proteine, die im Proteinteil des Moleküls liegen, durch Wechselwirkung zwischen Kollagen-Träger über eine direkte Bindung des Proteinteils an den Träger nicht beeinträchtigt werden. Bei bisher im Stand der Technik beschriebenen kovalent gebundenen Kollagen-Konjugaten erfolgte die Bindung über Aminosäurereste des Kollagens, wie etwa bei Wilkinson et al. (1990, Anal. Biochem. 185: 294-296) oder in EP 0 713 707 beschrieben. Dabei konnte nicht ausgeschlossen werden, daß ein Teil der für die Affinität zu Proteinen notwendigen Bereiche des Kollagens blockiert oder die Bindungstellen durch eine Konformationsänderung aufgrund der Kopplung an einen Träger maskiert werden, wodurch die Bindungskapazität des Kollagens zum adhäsiven Protein erniedrigt wird. Das Kollagen weist daher im erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat mindestens eine Modifikation im Kohlenhydratanteil auf. Die Modifikation kann dabei durch alle gängigen Verfahren chemischer Art in nicht-modifiziertes, natives Kollagen eingeführt werden, insbesondere durch Oxidation, Sulfatierung, Acylierung, Veresterung, etc. Bevorzugt sind dabei Modifikationen die mindestens eine reaktive Gruppe in den Kohlenhydratanteil 4

AT 403 963 B des Kollagens einführen, wobei besonders bevorzugt solche Modifikationen sind, die durch eine Oxidation, vorzugsweise der Zuckerreste der Oligosaccharide, wie Galaktose und Glukose, entstehen. Ourch die chemische Reaktion oder Modifikation entsteht so ein aktiviertes Kollegen, das in der Lage ist, mit einem weiteren Bindungspartner zu reagieren und eine chemische Verbindung, etwa eine kovalente Bindung einzugehen.

Es wurde festgestellt, daß die spezifische Ausbildung von reaktiven Gruppen im Zuckeranteil des Kollagenmoleküls eine kovalente Immobilisierung an einen Träger erlaubt, ohne die Affinität des Kollagens zu Proteinen mit Koliagen-bindenden, adhäsiven Eigenschaften zu beeinträchtigen. Reaktive Gruppen im Kollagen, die kovalente Bindungen eingehen können, können etwa dadurch erhalten werden, daß durch Oxidationsmittel, wie etwa Periodat-(Salze) Zuckerreste, wie Galaktose oder Glukose, im Kohlenhydratanteil des Kollagens zu Aldehydresten oxidiert werden und diese Aldehydgruppe mit anderen, chemisch reaktiven Gruppen eine kovalente Bindung eingehen. Dadurch ist es möglich, chemisch modifiziertes Kollagen an einen Träger stabil kovalent zu binden. Das Kollagen weist daher im erfindungsgemäBen Kollagen-Konjugat als Modifikation eine reaktive Gruppe, insbesondere eine Aldehydgruppe innerhalb des Kohlenhydratanteils des Kollagens auf. Das Kollagen ist gemäß der vorliegenden Erfindung über mindestens eine reaktive Gruppe kovalent an den Träger gebunden.'

Als Träger können zur Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugates alle unlöslichen polymeren Träger eingesetzt werden, die mit den reaktiven Gruppen des modifizierten Kollagens eine kovalente Bindung eingehen können oder nach entsprechender Aktivierung zur kovalenten Bindung fähig sind. Als Trägermaterialien kommen dabei in Betracht organische Polymere, wie Polyamide und Vinylpolymere (Polyacryl, Polystyrol und Polyvinylalkohole und deren Derivate), weiters natürliche Polymere, wie Cellulose, Dextrane, Agarose, Chitin und Polyaminosäure und anorganische Polymere, wie Kieselgel, Glas und Metallhydroxide. Diese Trägermaterialien können in Form von Mikroträgern, Partikeln, z.B. Latex-Partikel, in Form von Membranen, Streifen oder von Platten, wie etwa Mikrotiterplatten, verwendet werden. Besonders bevorzugt wird Kollagen kovalent an einen Träger in Form einer Mikrotiterplatte fixiert.

Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung weist der Träger im erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat mindestens eine reaktive Gruppe auf, die mit mindestens einer reaktiven Gruppe des modifizierten Kollagens eine kovalente Bindung eingehen kann. Die kovalente Fixierung des modifizierten Kollagens erfolgt dabei direkt Uber eine Bindung der reaktiven Gruppen. Funktionell reaktive Gruppen des Trägers sind gemäß der vorliegenden Erfindung solche funktionellen Gruppen, die chemisch aktiviert sind und die mit mindestens einer reaktiven Gruppe des modifizierten Kollagens reagieren können. "Funktionell aktiviert" bedeutet in diesem Zusammenhang chemische Derivatisierung einer oder mehrerer chemischer Gruppen des Trägers, die durch die chemische Reaktion in der Lage sind, mit reaktiven Gruppen des modifizierten Kollagens eine Bindung einzugehen. Funktionell reaktive Gruppen des Trägers können dabei beispielsweise Aldehydgruppen, Anhydridgruppen, Hydrazidgruppen oder Succimidgruppen sein, die mit reaktiven Gruppen des modifizierten Kollagens, wie etwa Aldehydgruppen, eine kovalente Bindung eingehen können. Durch die Verwendung von aktivierten Trägem ist auch gewährleistet, daß über die kovalente Kopplung des modifizierten Kollagens eine möglichst einheitlich beschichtete synthetische Oberfläche zur Verfügung gestellt wird. Zudem kann durch die Bindung zweier reaktiver Gruppen gegebenenfalls eine beschleunigte Herstellung des Konjugates und eine höhere Stabilität erreicht werden.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht das erfindungsgemäße Kollagen-Konjugat aus einem modifizierten Kollagen, das als reaktive Gruppe vorzugsweise eine Aldehydgruppe aufweist und einem Träger, der als reaktive Gruppe vorzugsweise eine Hydrazidgruppe aufweist.

Das modifizierte Kollagen wird vorzugsweise in Lösung oder in Suspension an den Träger kovalent gebunden. Durch die stabile, kovalente Bindung des modifizierten Kollagens an den Träger kann dabei nicht-gebundendes und im Überschuß vorhandenes vorliegendes Kollagen leicht entfernt werden, etwa durch einen speziellen Waschschritt.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann der Träger auch als Verbindungsglied oder Spacer zwischen dem modifizierten Kollagen und einer festen Matrix dienen. Dabei kann der Träger im erfindungsgemäBen Kollagen-Konjugat ein Antigen, ein Coenzym oder ein Antikörper sein. Ist der Träger ein Antigen bzw. ein Antikörper, so kann jedes Antigen, zu dem ein spezifischer Antikörper hergestellt werden kann, bzw. jeder Antikörper, der mit einem bestimmten Antigen reagiert, eingesetzt werden. Das Antigen bzw. der Antikörper wird zur Herstellung des erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugates derart an Kollagen gebunden, daß durch die chemische Reaktion und der Bindung zwischen modifiziertem Kollagen und Träger, die Bindungseigenschaften des Antigens zum spezifischen Antikörper nicht verloren gehen und die Bindungskapazität von Kollagen zu einem adhäsiven Protein im wesentlichen nicht beeinträchtigt wird. Das Kollagen-Antigen-Konjugat bzw. Kollagen-Antikörper-Konjugat kann gemäß der vorliegenden Erfindung anschließend Uber eine Antigen-Antikörper-Wechselwirkung an eine feste Matrix gebunden werden. Dazu 5

AT 403 963 B wird an eine feste Matrix, vorzugsweise eine synthetische Polymermatrix, ein spezifisch gegen das bestimmte Antigen reagierender Antikörper bzw. ein Antigen, gegen das ein Antikörper zur Verfügung steht, gekoppelt, und das Kollagen-Antigen-Konjugat über den matrixgebundenen Antikörper bzw. das Kollagen-Antikörper-Konjugat mit dem matrixgebundenen Antigen an die feste Polymermatrix immobilisiert. 5 Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bindung des modifizierten Kollagens im Kollagen-Konjugat an ein Coenzym. Dieses Coenzym ist insbesondere ein Coenzym, das mit einer bestimmten chemischen Verbindung eine sehr stabile Bindung mit einer Dissoziationskonstante von mindestens K=10-13 M, vorzugsweise von mindestens K = 10-15 M, eingehen kann. Diese Eigenschaft des Coenzyms wird insbesondere dadurch ausgenutzt, daß die chemische Verbindung an eine feste io Matrix stabil immobilisiert wird, und über die Matrix-gebundene chemische Verbindung eine stabile Immobilisierung des erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugats erfolgt. Das Coenzym im Kollagen-Konjugat ist gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Biotin und die chemische Verbindung, die mit Biotin eine stabile Bindung eingeht, Avidin oder Streptavidin.

Die feste Matrix, an die vorzugsweise Avidin oder Streptavidin gekoppelt ist, wird so über die als 15 Spacer dienende chemische Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat assoziiert. Die feste Matrix kann dabei eine synthetische oder natürliche Polymermatrix sein. Die Polymermatrix kann aus jedem bekannten Trägermaterial, wie schon oben erwähnt, bestehen.

Gemäß einem besonderen Aspekt der Erfindung wird das Kollagen-Biotin-Konjugat an eine feste Matrix in Form einer Mikrotiterplatte, an die Avidin oder Streptavidin gebunden ist über eine Biotin-(Strept)-Avidin-20 Bindung immobilisiert. Diese Art des erfindungsgemäßen Koilagen-Konjugates ist deshalb bevorzugt, da die Herstellung von Polymermatrices mit daran gekoppeltem (Strept)-Avidin zum allgemeinen Stand der Technik gehört und leicht durchzuführen ist. Durch Einsetzen eines Kollagen-Biotin-Konjugates gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch die Bindung, über den Biotin-Streptavidin-Komplex ebenfalls eine einheitlich mit Kollegen beschichtete Matrix zur Verfügung gestellt werden. 25 Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, daß durch die chemische Kopplung von im Zuckeranteil modifiziertem Kollegen an einen Träger, insbesondere an eine synthetische Oberfläche sowohl eine wesentlich kürzere Kontaktzeit als auch wesentlich geringere Kollagenmengen verwendet werden müssen, um ein erfindungsgemäßes stabiles Kollagen-Konjugat herzustellen. So wurde gefunden, daß 1 ug des erfindungsgemäß modifizierten Kollagens und eine Inkubationszeit von 1 Stunde ausreichen, um chemisch 30 Kollagen an einen Träger, wie etwa eine synthetische Oberfläche zu binden. Durch die wesentlich verkürzte Kontaktzeit aufgrund der chemischen Kopplung von Kollagen an die synthetische Oberfläche kommt es zu keinem Verlust durch Präzipitation an "aktivem” Kollagen und somit reichen wesentlich geringere Kollagenmengen aus, um eine stabile synthetische Kollagenoberfläche zu bilden. Zur Beschichtung des Trägers können daher Kollagenkonzentrationen von weniger als 3 ug/ml, vorzugsweise weniger als 2 ug/ml 35 eingesetzt werden. Die Beschichtung erfolgt für mindestens 10 min bis zu 24 Stunden, bevorzugt ist jedoch eine Beschichtungsdauer von 30 bis 60 min. Die Temperatur kann dabei zwischen 20 *C bis 37 *C gewählt werden.

Es wurde gefunden, daß es beim erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat zu keiner Aggregierung des Kollagens kommt und daß es auch nach der kovalenten Bindung des Kollagens an einen festen Träger über 40 einen längeren Zeitraum zu keiner Aggregatbildung des immobilisierten Kollagens kommt. Dadurch ist es möglich, ein stabiles Kollagen-Konjugat, das gegebenenfalls an eine feste Polymermatrix gebunden ist, unter Aufrechterhaltung der funktionellen Bindungsstellen für adhäsive Proteine bereitzustellen. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn die erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugate vor der Weiterverwendung über einen längeren Zeitraum gelagert werden sollen. Die Lagerung kann dabei bei 4’C in Lösung, 45 vorzugsweise jedoch in lyophilisierter Form, über einen Zeitraum von mehreren Monaten oder Jahren erfolgen.

Durch die Stabilität des erfindungsgemäßen Koilagen-Konjugates wird gewährleistet, daß bei Verwendung zu verschiedenen Zeitpunkten nach Herstellung des Koilagen-Konjugates, reproduzierbare Meßdaten ermittelt bzw. direkt miteinander verglichen werden können. Ein Vergleich von Daten, z.B. bei der so Bestimmung von vWF:CBA war bisher insbesondere deshalb schwierig, da durch die passive Immobilisierung keine einheitlich beschichteten Kollagen-Oberflächen zur Verfügung standen, und durch die unterschiedliche Verteilung von an die Matrixoberfläche-gekoppeltem Kollagen nur begrenzt eine Aussage zu anderen Meßdaten bzw. zu Verleichsproben oder Kontrollen gemacht werden konnten. Durch die kovalente Kopplung von Kollagen an den Träger kann es auch bei der weiteren Handhabung der synthetischen 55 Kollagenoberfläche, wie z.B. Waschen der Oberfläche mit Lösungen oder Puffern, und im Unterschied zur passiven, unspezifischen Kollagenanlagerung, zu keinem Verlust an Kollagen kommen. Auch besteht in der Verwendung der eingesetzten Lösungen und Puffern eine bessere Flexibilität, da nicht wie bei der passiven Kopplung von Kollagen an eine Oberfläche befürchtet werden muß, daß durch die Änderung des pH-Wertes 6

AT 403 963 B des Puffers das Kollegen aggreggiert oder ausfällt, wodurch Meßergebnisse oder andere Verfahren, für die das erfindungsgemäße Kollegen eingesetzt wird, stark beeinträchtigt werden. Durch die kovalente Kopplung von Kollegen können darüberhinaus während der Kollagen-Kopplung neutrale bis saure Bedingungen gewählt werden, wodurch die Löslichkeit des Kollagens erhöht wird. Die erhöhte Löslichkeit des Kollagens wiederum wirkt sich positiv auf die einzusetzende Menge an Kollagen aus, die zur Herstellung von Kollagen-beschichteten Trägern notwendig ist. Das erfindungsgemäße Kollagen-Konjugat eignet sich insbesondere zur Durchführung von diagnostischen Tests. Dabei haben sich als Vorteil des Konjugates insbesondere die leichte Standardisierung und die Reproduzierbarkeit von Meßergebnissen gezeigt, wodurch ein Vergleich von Ergebnissen ermöglicht wird.

Das Kollagen im erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat kann von natürlich vorkommendem oder biotechnologisch oder chemisch hergestelltem Kollagen gewonnen werden, wobei das Kollagen vom Typ I, Typ III, Typ IV, Typ V, Typ VI, Typ VII oder Typ VIII oder deren Derivaten sein kann. Das Kollagen kann humanen, bovinen, porcinen oder equinen Ursprungs sein, wobei jedoch humanes Kollagen, insbesondere des Typs III, bevorzugt ist. Es können jedoch alle von Kollagen abgeleiteten Derivate zur Herstellung des Konjugates eingesetzt werden, sofern sie noch die für Kollagenbindenden Proteine spezifischen Bindungssteilen aufweisen.

Das Kollagen-Konjugat gemäß der vorliegenden Erfindung zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß das im Konjugat an einen Träger kovalent gebundene Kollagen in seinen Bindungseigenschaften sowie seiner Bindungskapazität zu Kollagen-affinen Proteinen, insbesondere zu Proteinen mit hämostatischer Eigenschaft oder Aktivität nicht beeinträchtigt ist. Dies ist insbesondere deshalb wichtig, da das Kollagen-Konjugat bei Verwendung in einem diagnostischen Test durch Beeinträchtigung der Bindungsstellen zu Proteinen eine verringerte Spezifität aufweisen würde. Es wurde jedoch überraschenderweise gefunden, daß im erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat, die Bindungskapazität des modifizierten Kollagens zu einem affinen Protein nicht beeinträchtigt ist, sondern im Gegensatz dazu die Bindungskapazität des kovalent gebundenen Kollagens im Konjugat zu einem Kollagen-adhäsiven Protein im Vergleich zu nicht-modifizier-tem Kollagen, das über passive Immobilisierung adsorptiv an einen Träger gebunden ist, wesentlich verbessert und erhöht ist. Dies war deshalb überraschend, da nicht zu erwarten war, daß im Zuckeranteil des Kollagens modifiziertes Kollagen in gleicher Weise ein affines Protein oder eine Substanz binden kann wie nicht-modifiziertes Kollagen und daß zudem eine kovalente Immobilisierung von modifiziertem Kollagen an einen Träger die Bindungskapazität des Kollagens nicht negativ beeinflußt. Vielmehr wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt, daß durch eine verbesserte und effizientere Kopplungsrate des modifizierten Kollagens an einen Träger, eine synthetische Kollagen-Oberfläche zur Verfügung gestellt werden kann, die weniger Kollagen pro hergestellter Kollagen-Trägeroberfläche benötigt und eine verbesserte Bindungskapazität aufweist.

Eine wesentliche Zielsetzung bei der Durchführung von Substanzuntersuchungen und funktionellen Charakterisierungen besteht in der Bereitstellung einer sehr hohen Empfindlichkeit zum Nachweis von Spuren des Proteins in Substanzgemischen. Das Kollagen-Konjugat in der vorliegenden Erfindung ist insbesondere in der Lage, noch geringste Mengen von beispielsweise vWF in Gemischen nachzuweisen. Dies entspricht einer über 1:20Q0-fachen Verdünnung von humanem Plasma. Die Sensitivitätsgrenze für den Nachweis eines Kollagen-bindenden Proteins in einer Probe, insbesondere von vWF, liegt daher im erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat bei vorzugsweise 2 ng, besonders bevorzugt 1 ng und insbesondere bevorzugt 0,5 ng vWF.

Das erfindungsgemäße Kollagen-Konjugat ist insbesondere dadurch erhältlich, daß nicht-modifiziertes Kollagen einer chemischen Reaktion, unterzogen wird, wodurch es chemisch modifiziert wird. Die chemische Reaktion ist vorzugsweise eine Oxidationsreaktion, bei der insbesondere die Moleküle im Kohlenhydratanteil des Kollagens chemisch verändert werden. Vorzugsweise werden die im Zuckeranteil des Kollagenmoleküls befindlichen Zuckerreste oxidiert, wodurch mindestens eine reaktive Gruppe entsteht. Die Zuckerreste sind vorwiegend Galaktose oder Glukose, bei denen durch den Oxidationsprozeß reaktive Aldehydgruppen entstehen. Mindestens eine reaktive Gruppe des modifizierten Kollagens ist in der Lage, mit mindestens einer reaktiven Gruppe eines Trägers eine kovalente Bindung einzugehen, wodurch ein Kollagen-Konjugat entsteht. Das Kollagen-Konjugat kann gegebenenfalls mit einer festen Matrix assoziiert sein, sofern der Träger im Kollagen-Konjugat nicht selbst eine feste Polymermatrix darstellt.

Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung herausgestellt, daß sich das erfindungsgemäße Kollagen-Konjugat für eine Verwendung in einem Testsystem zur Bestimmung von Kollagen-bindenden Proteinen, insbesondere von Proteinen mit hämostatischer Aktivität, in Proben oder biologischen Materialien eignet.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird daher ein Testkit zur Bestimmung der Funktionalität und/oder Quantifizierung eines Kollagen-affinen Proteins oder einer Substanz auf der Basis des erfindungs- 7

AT 403 963 B gemäßen Kollagen-Konjugates zur Verfügung gestellt. Der Testkit enthält gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ein Kollagen-Konjugat der oben beschriebenen Art, wobei das Koilagen im erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat an einen festen Träger in Form einer Polymermatrix, vorzugsweise an eine Mikrotiterplatte, gebunden ist. Desweiteren enthält der Testkit mindestens eine Substanz oder ein Reagens zur Durchführung einer spezifischen Detektionsreaktion, insbesondere zum Nachweis eines an Koilagen gebundenen Proteins und gegebenenfalls eine Standard(Referenz)-Lösung enthaltend eine bestimmte Menge eines Kollagen-bindenden Proteins. Als bevorzugte Substanzen oder Reagentien für die Detektionsreaktion dienen dabei besonders markierte Antikörper, die gegen das Kollagen-affine Protein gerichtet sind, und insbesondere gegen Kollagen-gebundene Adhäsionsproteine, wobei monoklonale Antikörper besonders bevorzugt sind. Als Referenzlösung können eine kalibrierte Menge oder Aktivität des zu testenden Proteins oder der Substanz verwendet werden.

Durch die Bindung des vWF einerseits an Koilagen der Gefäßwand und an Rezeptoren der Blutplättchen andererseits, kommt es zur blutstillenden Wirkung des vWF. Die Bindungen des vWF an den vWF-Rezeptor GP Ib der Blutplättchen erfolgt durch Bindungsstellen innerhalb des Loops Cys 509-Cys 695 des vWF. Überraschenderweise haben die vorliegenden Untersuchungen gezeigt, daß nach der Bindung des vWF an das Kollagen-Konjugat der gebundene vWF mittels einem monoklonalen Antikörper qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden kann, der selektiv an die funktionelle Rezeptorbindungsstelle innerhalb des Loop Cys 509-Cys 695 bindet. Damit konnte erstmals ein Testsystem entwickelt werden, das beide funktionell notwendigen Eigenschaften des vWF einbezieht; Bindung an Koilagen und Funktionalität der GP Ib-Rezeptorbindungsstelle.

Besonders bevorzugt enthält der Testkit daher einen monoklonalen Antikörper gegen vWF, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, der an das funktionelle aktive Epitop des vWF zur Plättchenbindung bindet (Goddall et al. (1985), Brit. J. Haemotol. 59:565-577), und vWF einer bestimmten Aktivität als Standard. Durch die Kombination der Bindung des vWF an eine Kollagenoberfläche einerseits und die Bindung des monoklonalen Antikörpers an das für die vWF-Plättchenbindung verantwortliche Epitop des vWF andererseits, wird in einzigartiger Weise die in vivo-Funktionalität des vWF, Brückenbildung zwischen Kollagen-Epithel und Blutplättchen, simuliert, und somit erstmalig ein neuartiges diagnostisches System dargestellt, welches in vitro die vollständige Funktionalität des vWF hinsichtlich primärer Hämostase berücksichtigt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Bestimmung der Funktionalität und/oder Quantifizierung eines Kollagen-bindenden Proteins, vorzugsweise eines adhäsiven, hämostati-schen Proteins oder einer Substanz mit derartigen Eigenschaften zur Verfügung gestellt. Das erftndungsge-mäße Verfahren wird dabei so durchgeführt, daß ein biologisches Material, eine Lösung oder Probe, das (die) gegebenenfalls ein zu bestimmendes Kollagen-bindendes Protein oder eine Substanz enthält, mit einem Kollagen-Konjugat der oben beschriebenen Art in Kontakt gebracht und das Protein/die Substanz an Koilagen gebunden wird. Dabei werden die Bedingungen so gewählt, daß eine Bindung des Proteins/der Substanz an Koilagen ermöglicht wird. Zu den Parametern, unter denen die Bindungsreaktion durchgeführt wird, gehören die Temperatur, die Art des Puffers, der pH-Wert und die Inkubationsdauer. Diese Parameter können zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens von jedem Fachmann ohne Schwierigkeiten ermittelt und eingesetzt werden. Die Inkubation erfolgt dabei vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 15 *C bis 37 *C, insbesondere jedoch bei Raumtemperatur. Die Auswahl des bei der Durchführung des Verfahrens verwendeten Puffersystems ist dabei nicht eingeschränkt, und es kann ein Puffer mit einem beliebigen pH-Wert oder lonenstärke verwendet werden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, falls in einem Paralleltest etwa der Antigengehalt des Proteins bestimmt wird und für beide Systeme der gleiche Puffer eingesetzt werden kann.

Nach der Bindung des zu Kollagen-affinen Proteins an das erfindungsgemäße Kollagen-Konjugat wird eine erfolgreiche Bindung der Bindungspartner mit einer spezifischen Detektionsreaktion bestimmt. Dazu werden in einem ersten Schritt alle nicht-gebundenen Moleküle und Substanzen durch Waschen entfernt und anschließend das gebundene Protein durch eine spezifische Reaktion nachgewiesen. Der Nachweis der Bindung eines Kollagen-bindenden Proteins an Koilagen erfolgt durch eine spezifische Detektionsreaktion, wodurch die spezifische Kollagenbindung des adhäsiven Proteins ermittelt wird.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform erfolgt die spezifische Detektionsreaktion als Immunassay. Dabei wird die spezifische Bindung zwischen dem Kollagen-bindenden Protein oder der Substanz und dem Koilagen dadurch nachgewiesen, daß das an das Kollagen-Konjugat gebundene Protein oder Substanz mit einem spezifisch gegen das Protein oder die Substanz gerichteten Antikörper inkubiert wird. Dazu können besonders markierte Antikörper eingesetzt werden, wobei monoklonale Antikörper besonders bevorzugt sind. 8

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Der Kollagen-Konjugat-Protein/Substanz-Antikörper-Komplex kann dann über den Nachweis des gebundenen Antikörpers bestimmt werden. Dies kann durch allgemeine, im Stand der Technik gängige Methoden, wie ein Enzym-, Chromo-, Lumino-, Fluoro- oder Radioimmunassay, durchgeführt werden. Dazu wird die Bindungsreaktion sowie die Effizienz der Bindung durch die jeweilige Technik ermittelt und die Menge des gebundenen Proteins/der gebundenen Substanz über die Intensität der Färbung, der radioaktiven Strahlung etc. bestimmt. Durch dieses Verfahren kann mit einfachen Mitteln die Funktionalität sowie die Konzentration eines Kollagen-affinen Proteins/Substanz in einem biologischen Material oder einer Probe festgestellt werden.

Gemäß einem besonderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Funktionalität und Konzentration von Kollagen-bindenden Proteinen, insbesondere von Proteinen mit adhäsiven Eigenschaften oder Aktivitäten eingesetzt. Ein bevorzugtes Protein ist dabei vWF, ein Derivat von vWF, das ein Fragment des kompletten vWF sein kann, das jedoch die spezifischen Kollagen-bindenden Regionen des vWF noch besitzt, eine vWF-Fraktion oder hochmolekularer vWF. Desweiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Fibronektin oder Derivaten davon eingesetzt werden. Es kann jedoch jedes weitere Protein oder ein Fragment oder Derivat davon, das eine Affinität zu Kollagen aufweist, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden. Dazu zählen u.a. Antikörper oder Fragmente davon, Rezeptorproteine, Laminin, Fibrinogen oder Thrombospondin.

Die Quelle, aus der das biologische Material stammt, kann vielfältig sein. Das biologische Material kann natürlichen Ursprungs oder durch ein gentechnisches Verfahren hergestellt sein. Zu biologischen Materialien natürlichen Ursprungs gehören gemäß der Erfindung etwa Blut, Plasma, eine Plasmafraktion, während zu durch gentechnische Verfahren hergestellten Materialien rekombinante Zellkulturen oder Überstände von Zellkulturen gehören.

Der erfindungsgemäße Testkit sowie das Verfahren eignen sich in besonderer Weise zur Durchführung von Routinetests bei der Bestimmung der Funktionalität von Kollagen-affinen, insbesondere von adhäsiven, hämostatisch aktiven Proteinen und deren Quantifizierung bzw. dem Nachweis der Funktionalität. Eine Anwendung kann dabei erfolgen bei der Bestimmung von vWF bei der Diagnose der vWD und der Differenzierung und Klassifizierung des vWF-Typs, da durch die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens auch nur geringe Abweichungen der vWF-CBA vom Normalzustand festgestellt werden können. Da im Vergleich zu herkömmlichen passiv gekoppelten CBA-Assays, die Bindungskapazität des Kollagens an vWF verbessert ist, ist eine genauere Darstellung des Gehaltes an vWF im Plasma möglich. Der Test kann für alle bisher bekannten Verfahren, bei denen der CBA von vWF bestimmt wird, verwendet werden, wie etwa zum Monitoring von Patienten mit vWD während und nach Behandlung mit Faktor VIII-, vWF-, Faktor VIII/vWF-Komplex-Präparaten oder Desmopressin, für die Qualitätssicherung von Faktor Vlll-Kom-plex- oder vWF-Präparaten, die entweder aus Plasma oder über gentechnologische Verfahren hergestellt sind. Ebenso eignet sich das Testsystem zum Routine-Screening von Kollagenadhäsionsprotein-exprimie-renden Klonen in der Biotechnologie, da so effizient eine Auswahl von rekombinanten Klonen, die große Mengen des Proteins exprimieren, getroffen werden kann.

Bisherige Testsysteme mit passiv gekoppeltem Kollagen hatten nur eine begrenzte Kapazität Kollagen-bindender Proteine zu binden, und es wurde schon bei geringen Mengen an z.B. vWF eine Sättigung des immobilisierten Kollagens erreicht. Damit war eine sensitive Differenzierung zwischen rekombinanten Klonen, die unterschiedliche Mengen an Protein exprimieren, nicht möglich. Erst durch die Bereitstellung des erfindungsgemäßen Tests, der eine verbesserte Sensitivität zu Kollagen-bindenden Proteinen aufweist, ist eine einfache Differenzierung von rekombinanten Klonen, die ein Kollagen-bindendes Protein mit unterschiedlicher Stärke exprimieren, möglich.

Eine weitere Anwendung des erfindungsmäßen Verfahrens bietet sich insbesondere bei der Quantifizierung von Kollagen-bindenden Proteinen bei der kommerziellen Herstellung von Blutprodukten aus Plasma, da die Reinheit solcher Produkte innerhalb der Qualitätssicherung gewährleistet sein muß. Durch die verbesserte Sensitivität und Spezifität des erfindungsgemäßen Tests können auch geringste Mengen, etwa an Fibronektin, vWF oder einem anderen Kollagen-bindenden Protein in einem gereinigten Blutprodukt festgestellt werden. Die Sensitivitätsgrenze für den Nachweis eines Kollagen-bindenden Proteins in einer Probe, insbesondere von vWF, liegt dabei vorzugsweise bei 5 ng, besonders bevorzugt bei 1 ng und inbesondere bevorzugt bei 0,5 ng. Die Bindungskapazität beträgt vorzugsweise mindestens 100 ng vWF/ug Kollagen, insbesondere 300 ng/ug Kollagen.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren näher erläutert, wobei sie jedoch nicht auf diese eingeschränkt ist.

Es zeigen:

Figur 1: die Bindung von vWF an kovalent gebundenes modifiziertes Kollagen-Konjugat;

Figur 2: die Bindung von vWF an Kollagen-Biotin-Konjugat; 9

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Figur 3: den Vergleich der Bindung von vWF an modifiziertes Kollagen-Konjugat (—) und nicht- modifiziertes Kollagen (.......);

Figur 4: die Bindung von Fibronektin an kovalent gebundenes modifiziertes Kollagen-Konjugat; und.

Figur 5: die Bindung von vWF an modifiziertes Kollagen-Konjugat und Detektion mittels monoklonalem Antikörper mit Spezifität für das funktionell aktive vWF-Epitop.

Beispiel 1 beschreibt die Herstellung einer Kollagenlösung. Beispiel 2 beschreibt die chemische Modifikation von Kollagen durch Einführen reaktiver Aldehydgruppen im Kohlenhydratanteil des Moleküls und Beispiel 3 die chemische Kopplung von modifiziertem Kotlagen an Mikrotiterplatten. Beispiel 4 beschreibt die Biotinylierung von Kollagen und Beispiel 5 die Kopplung von Biotin-Kollagen-Konjugat an eine Strepavidin-haltige Oberfläche. Beispiel 6 beschreibt die Bindung von vWF an Kollagen-Konjugat. Beispiel 7 beschreibt einen Vergleich der Bindungskapazität von kovalent gebundenem modifizierten und passiv immobilisiertem nicht-modifizierten Kollagen. Beispiel 8 beschreibt die Charakterisierung von vWF unterschiedlichen Multimerisierungsgrades durch das erfindungsgemäße Kollagen-Konjugat. Beispiel 9 beschreibt die Bindung von Fibronektin an kovalent gebundenes modifiziertes Kollagen-Konjugat. Beispiel 10 beschreibt die Bindung von vWF an modifiziertes Kollagen-Konjugat und Detektion des gebundenen vWF mittels monoklonaler vWF-Antikörper. Beispiel 11 beschreibt den Aufbau eines vWF-Kollagen-Bin-dungs-EUSAs.

Beispiel 1 : Auflösen von Kollagen

Humanes Kollagen Typ III wurde zu 5 mg/ml in 500 mM Essigsäure bei 4‘C aufgelöst und anschließend mit Wasser auf 1 mg/ml verdünnt. Das gelöste Kollagen wurde bei -20* C gelagert.

Beispiel 2 : Chemische Modifikation von Kollagen

Zur chemischen Modifikation wurde Kollagen (Beispiel 1) in 10 mM Na-Acetatpuffer, pH 4. zu 10 ug/ml verdünnt. Zu 10 ml der Lösung wurden 32 mg NalO* zugegeben und die Modifikation für i Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt, in der es zu einer chemischen Modifikation und zur Herausbildung von reaktiven Aldehydgruppen im Kollagenmolekül kommt.

Beispiel 3: Chemische Kopplung von modifiziertem Kollagen

Zur Herstellung eines an eine synthetische Oberfläche kovalent gebundenen Koilagens wurde modifiziertes Kollagen mit einer Hydrazid-Oberfläche in Kontakt gebracht. Dazu wurde Kollagen nach Beispiel 2 an Mikrotitrationsplatten mit Hydrazid-Oberfläche (Fa. Costar) kovalent gebunden. Je 100 ul der Lösung mit modifiziertem Kollagen wurden je Vertiefung der Mikrotitrationsplatten aufgetragen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde 3 x mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Anschließend wurde die Mikrotitrationsplatte deaktiviert durch Zugabe von 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,2, enthaltend 1 % Rinderalbumin. Danach wurde die Deaktivierungslösung entfernt.

Beispiel 4 : Biotinylierung von Kollagen

Zur Gewinnung von biotinyliertem Kollagen wurde 1 ml gelöstes Kollagen (1 mg/ml in 100 mM Essigsäure) mit 1 ml Nal04 (20 mM in 100 mM Na-Acetatpuffer, pH 5,5) gemischt und für i Stunde inkubiert. Danach wurde 3 u-l Glycerin zugegeben und der Überschuß an Glycerin und NalO* durch Gelfiltration abgetrennt. Anschließend wurde Biotin-LC-Hydrazid bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben und für 2 Stunden inkubiert. Der Überschuß an Biotin wurde durch Dialyse entfernt. Durch die Oxidation der Oligosaccharide des Koilagens entstehen reaktive Aldehydgruppen, die mit reaktiven Amingruppen, wie Hydrazid, reagieren und an diese kovalent binden, wodurch ein stabiler Komplex aus Biotin und Kollagen entsteht.

Beispiel 5 : Kopplung von Biotin-Kollagen an Mikrotiterplatten

Zur Herstellung einer synthetischen Kollagen-Oberfläche wurde kovalent gebundenes Biotin-Kollagen mit einer Streptavidin-haltigen Oberfläche in Kontakt gebracht, damit sich der Biotin-Kollagen-Komplex über die hochaffine Bindung zwischen Biotin und Streptavidin an die synthetische Oberfläche anlagert. Dazu wurde Biotin-Kollagen nach Beispiel 4 an Mikrotitrationsplatten mit Streptavidinoberfläche gebunden. 100 ul 10

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Biotin-Kollagen (10 ug/ml in 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,4, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05% Tween 20, wurden je Vertiefung der Mikrotitrationsplatten aufgetragen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde 3 x mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI, 0,1% BSA und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Anschließend wurde die Mikrotitrationsplatte deaktiviert durch Zugabe von 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,2, enthaltend 1 % Rinderalbumin. Danach wurde die Deaktivierungslösung entfernt.

Beispiel 6: Bindung des vWF an Kollagen-Konjugat und Detektion von gebundenem vWF

Humanes Citratplasma wurde so verdünnt, daß sich Konzentrationen des vWF zwischen 330 ng/ml und 5 ng/ml ergaben. Als Verdünnungspuffer wurden 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI, 0,05 % Tween 20 und 1 % Rinderalbumin, verwendet. Jeweils 100 ul der Verdünnungen wurden je Vertiefung der Mikrotitrationsplatte mit gekoppeltem modifizierten Kollagen (gemäß Beispiel 3 bzw. Beispiel 5) eingefüllt und für 1 Stunde inkubiert. Dann wurden die Mikrotitrationsplatten 3 x mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0.05 % Tween 20, gewaschen. Zur Detektion des an Kollagen gebundenen vWF wurde ein Peroxidase-konjugiertes polyklonales Ziegen-anti-vWF-Serum (Dako) 1 : 1000 verdünnt und in jede Vertiefung wurden 100 ul aufgetragen. Nach einer Inkubation von 1 Stunde wurde die Mikrotitrationsplatte 3 mal mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Anschließend wurde durch Zugabe einer Peroxidase-Substratlösung die Farbreaktion gestartet, welche nach 5 Minuten durch Zugabe von 100 ul 1 M H2SCU gestoppt wurde. Die Extinktion der Farblösung wurde dann bei einer Wellenlänge von 450 nm photometrisch bestimmt und in Relation zur verabreichten Konzentration des vWF gesetzt (Figur 1 und Figur 2). Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäße Kollagen-Oberfläche vWF in konzentrationsabhängiger Weise bindet.

Beispiel 7 : Vergleich der Bindungskapazität von kovalent gebundenem modifiziertenKollagen-Konjugat und passiv immobilisiertem nicht-modifizierten Kollagen

Chemisch modifiziertes Kollagen wurde gemäß Beispiel 3 an Mikrotitrationsplatten mit Hydrazid-Oberfläche (Fa. Costar) kovalent gebunden. Je 100 ul der Lösung mit modifiziertem Kollagen wurden je Vertiefung der Mikrotitrationsplatten aufgetragen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde 3 x mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Anschließend wurde die Mikrotitrationsplatte deaktiviert durch Zugabe von 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,2, enthaltend 1 % Rinderalbumin. Danach wurde die Deaktivierungslösung entfernt. In identer Weise wurden Mikrotitrationsplatten mit nicht-modifiziertem Kollagen behandelt. Anschließend wurde für beide Varianten die vWF-Bindung und vWF-Detektion nach Beispiel 6 durchgeführt. Das Ergebnis ist in Figur 3 dargestellt. Es ist ersichtlich, daß durch die spezifische chemische Modifikation des Kollagens und die nachfolgende kovalente Kopplung in einer wesentlich empfindlicheren vWF-Kollagen-Bindung resultiert als mit nicht-modifiziertem Kollagen, das passiv an die synthetische Oberfläche gebunden ist. Insbesondere fällt auf, daß bei nichtmodifiziertem Kollagen eine Sättigung der vWF-Bindungskapazität bei einer wesentlich geringeren vWF-Konzentration eintritt als beim erfindungsgemäßen Kollagen-Konjugat.

Beispiel 8 : Charakterisierung von vWF unterschiedlichen Multlmerisierungsgrades mittels kovalentem Kollagen-Konjugat

Entsprechend der DE 44 35 392 wurde ausgehend von humanem Citratplasma eine niedermolekulare und eine hochmolekulare Fraktion des vWF gewonnen. Die hoch- und niedermolekularen vWF-Fraktionen wurden entsprechend Beispiel 6 hinsichtlich der Kollagenbindung untersucht. Als Referenz wurde die Kollagenbindung des vWF aus humanen Plasma verwendet, wobei die Konzentration des vWF-Antigens (vWF:Ag) im humanen Plasma 10 ug/ml beträgt und die Kollagenbindungsaktivität des vWF im humanen Plasma in 1 ml als 1 Kollagenbindungseinheit (CBE) definiert wurde, woraus sich eine spezifische Kollagenbindung von 100 CBE pro 1 mg vWF:Ag ergibt. Für niedermolekularen vWF wurde eine spezifische Kollagenbindung < 1 CBE pro 1 mg vWF:Ag, für hochmolekularen vWF wurde eine spezifische Kollagenbindung von 65 CBE pro 1 mg vWF:Ag ermittelt.

Beispiel 9 : Bindung von Fibronektin an kovalent gebundenes modifiziertes Kollagen-Konjugat und Detektion des gebundenen Fibronektlns

Humanes Citratplasma wurde so verdünnt, daß sich Konzentrationen des Fibronektins zwischen 150 ng/ml und 2,34 ng/ml ergaben. Als Verdünnungspuffer wurde 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 11

AT 403 963 B mM NaCI, 0,05 % Tween 20 und 1 % Rinderalbumin, verwendet. Jeweils 100 ul der Verdünnungen wurden je Vertiefung der Mikrotitrationsplatte mit gekoppeltem modifizierten Kollegen (Beispiel 3) eingefüllt und für 1 Stunde inkubiert. Dann wurden die Mikrotitrationsplatten 3 x mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Zur Detektion des an Kollagen gebundenen vWF wurde ein Peroxidasekonjugiertes polyklonales Ziegen-anti-Fibronektin-Serum (Dako) 1 : 1000 verdünnt und in jede Vertiefung 100 ul dazugegeben. Nach einer Inkubation von 1 Stunde wurde die Mikrotitrationsplatte 3 x mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Anschließend wurde durch Zugabe einer Peroxidase-Substratlösung die Farbreaktion gestartet, welche nach 5 Minuten durch Zugabe von 100 ul 1 M H2SO< gestoppt wurde. Die Extinktion der Farblösung wurde dann bei einer Wellenlänge von 450 nm photometrisch bestimmt und in Relation zur verabreichten Konzentration des vWF gesetzt (Figur 4). Es wird gezeigt, daß modifiziertes und kovalent gebundenes Kollagen das Plasmaprotein Fibronektin in konzentrationsabhängiger Weise bindet.

Beispiel 10 : Bindung des vWF an modifiziertes Kollagen-Konjugat und Detektion mittels vWF-Aktlvität-spezifischem monoklonalem Antikörper

Humanes Citratplasma wurde so verdünnt, daß sich Konzentrationen des vWF zwischen 330 ng/ml und 5 ng/ml ergaben. Als Verdünnungspuffer wurden 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI, 0,05 % Tween 20 und 1 % Rinderalbumin, verwendet. Jeweils 100 ul der Verdünnungen wurden je Vertiefung der Mikrotitrationsplatte mit gekoppeltem modifizierten Kollagen (Beispiel 3) eingefüllt und für 1 Stunde inkubiert. Dann wurden die Mikrotitrationsplatten 3 mal mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Zur Detektion des an Kollagen gebundenen vWF wurde ein monoklonaler Antikörper (mAK) verwendet, der selektiv nur an das funktionell aktive Epitop des vWF zur Plättchenbindung bindet (Goodall, A.H. et al., Brit. J. Haematol (1985), 59, 565-577). Nach einer 1-stündigen Inkubation wurden die Mikrotitrationsplatten 3 x mit 10 mM Tris/HCl-Puffer pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Zur Detektion des am vWF gebundenen mAK wurde ein Peroxidase-konjugiertes polyklonales Serum aus der Ziege gegen Maus-Immunglobulin (Bio-Rad) 1 : 1000 verdünnt und in jede Vertiefung wurden 100 ul aufgetragen. Nach einer Inkubation von 1 Stunde wurde die Mikrotitrationsplatte 3 x mit 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,2, enthaltend 150 mM NaCI und 0,05 % Tween 20, gewaschen. Anschließend wurde durch Zugabe einer Peroxidase-Substratlösung die Farbreaktion gestartet, welche nach 5 Minuten durch Zugabe von 100 ul 1 M H2SO4 gestoppt wurde. Die Extinktion der Farblösung wurde dann bei einer Wellenlänge von 450 nm photometrisch bestimmt und in Relation zur verabreichten Konzentration des vWF gesetzt (Figur 5). Der verwendete mAK besitzt eine derartige Bindungsspezifität, daß der mAK nur an das funktionell aktive, für die Plättchenbindung verantwortliche Epitop des vWF bindet. Durch die Kombination der Bindung des vWF an eine Kollagenoberfläche einerseits und die Bindung des mAK an das für die vWF-Plättchenbindung verantwortliche Epitop des vWF andererseits, wird in einzigartiger Weise die in vivo-Funktionalität des vWF, Brückenbildung zwischen Kollagen-Epithel und Blutplättchen, simuliert, und somit erstmalig ein neuartiges diagnostiseits, wird in einzigartiger Weise die in vivo-Funktionalität des vWF, Brückenbildung zwischen Kollagen-Epithel und Blutplättchen, simuliert, und somit erstmalig ein neuartiges diagnostisches System dargestellt, welches in vitro die vollständige Funktionalität des vWF hinsichtlich primärer Hämostase berücksichtigt.

Beispiel 11: Aufbau eines vWF-Kollagen-Bindungs-EUSA (Enzymimmunologischer in vitro-Test zur quantitativen Bestimung der vWF-Kollagen-Bindung)

Testprinzip "Sandwich-Assay": In einer ersten Reaktion bindet vWF der Testprobe an auf dem Teststreifen fixierten Kollagen. In der anschließenden Immunreaktion mit POD-markiertem vWF-Antikörper wird ein Sandwich-Komplex gebildet. Die Menge der Sandwich-Komplexe stellt ein Maß für die Kollagenbindung des vWF des Testmaterials dar. Im nachfolgenden Waschschritt wird das nichtgebundene POD-Konjugat entfernt. Nach Zusatz von H2O2 und POD-Substratlösung wird die gebundene POD-Aktivität photometrisch bestimmt.

Packungslnhait 1 Mikrotitrationsstreifen, mit kovalent gebundenem Kollagen 2 anti-vWF polyklonales POD-Konjugat (Fa. Dakopatts, Dänemark) 3 POD-Substrat-Tabletten (Fa. Bio-Rad) 12

Claims (25)

1. AT 403 963 B 4 Puffer-Konzentrat für Probenverdünnung (100 mM Tris/HCI, 1,5 M NaCI, 0,5 % Tween 20, 10 % Albumin) 5 Waschlösungs-Konzentrat (100 mM Tris/HCI, 1,5 M NaCI, 0,5 % Tween 20) 6 vWF-Standard (100 % Normalplasma, IMMUNO AG) 5 Zusätzlich erforderlich - Wasserstoffperoxid (30 %-ig) - Schwefelsäure (1 N) 70 Herstellen der Reagenzien 1. Waschlösungs-Konzentrat 1:10 mit dest. Wasser mischen.
2. 2. Puffer-Konzentrat 1:10 mit dest. Wasser mischen 75
3. ' 3. Substratlösung kurz vor Gebrauch ansetzen
4. 4. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen über die Modifikation kovalent an den Träger gebunden ist.

   4. Antikörper POD-Konjugat 1:1000 mit verdünntem Puffer-Konzentrat verdünnen
5. 5. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß der Träger mindestens eine reaktive Gruppe aufweist, die mit mindestens einer reaktiven Gruppe des modifizierten so Kollagens eine kovalente Bindung eingehen kann.

   5. Verdünnen der Probe: 1 Teil Citratplasma + 50 Teile verdünntes Puffer-Konzentrat 1 Teil Citratplasma +100 Teile verdünntes Puffer-Konzentrat 20 Bestimmungsansatz Wellenlänge : 450 nm Inkubationstemperatur: +15 -25 ’ C 25 In die Vertiefungen der Mikrotitrationsstreifen werden 100 u.l verdünnte Probe/Startdard pipettiert. AnschlieBend wird 1 Stunde inkubiert, dann abgesaugt und 3 x mit 300 ul Waschlösung gewaschen. Nach dem Waschen wird mit 100 ul des verdünnten Antikörpers POD-Konjugat 1 Stunde inkubiert, dann abgesaugt und abermals 3 x mit 300 ul Waschlösung gewaschen. Nach dem erneuten Waschen wird mit 100 ul der POD-Substratfösung exakt 5 Minuten inkubiert, mit 100 ul 1M H2SO+ gemischt und die 30 Extinktion innerhalb von 2 Stunden gegen Blankwert gemessen. Patentansprüche 1. Kollagen-Konjugat bestehend aus einem Träger und daran kovalent gebundenem Kollagen, das 35 mindestens eine Modifikation im Kohlenhydratanteil aufweist, über die eine stabile Immobilisierung an den Träger erfolgt, ohne die Bindungskapazität des Kollagens zu einem Kollagen-bindenden Protein oder einer Substanz im wesentlichen zu beeinflussen. 2. Kollagen-Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifikation im Kohlenhydrat-40 anteil eine Oxidation ist. 3. Kollagen-Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen als Modifikation eine reaktive Gruppe im Kohlenhydratanteil aufweist.
6. 6. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein natürliches oder synthetisches Polymer ist.
7. 7. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Antigen, ein Coenzym oder ein Antikörper ist. 13 AT 403 963 B
8. 8. Kollagen-Konjugat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es an eine feste Matrix gebunden ist.
9. 9. Kollagen-Konjugat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix ein natürliches oder synthetisches Polymer ist.
10. 10. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das modifizierte, kovalent gebundene Kollagen an der festen Matrix stabil über spezifische Bindung, wie etwa Antigen-Antikörper-Reaktion, Biotin-Avidin-Bindung immobilisiert ist.
11. 11. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es lagerstabil ist.
12. 12. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen abgeleitet ist vom Typ I, Typ III, Typ IV, Typ V, Typ VI, Typ VII oder Typ VIII, vorzugsweise von humanem Kollagen Typ III.
13. 13. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen-bindende Protein insbesondere vWF oder ein Derivat davon oder Fibronektin ist.
14. 14. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet daß die Sensitivi-tätsgrenze für den Nachweis eines Kollagen-bindenden Proteins in einer Probe, insbesondere von vWF, vorzugsweise bei 2 ng, besonders bevorzugt bei 1 ng, insbesondere bevorzugt bei 0,5 ng vWF liegt.
15. 15. Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch erhältlich, daß nicht-modifiziertes Kollagen einer chemischen Reaktion, insbesondere einer Oxidationsreaktion, unterzogen wird, wodurch insbesondere Moleküle des Kohlenhdyratanteils chemisch verändert werden, vorzugsweise oxidiert werden, und mindestens eine reaktive Gruppe entsteht, die mit einem, gegebenenfalls aktivierten Träger eine kovalente Bindung eingeht, wobei das trägergebundene, modifizierte Kollagen gegebenenfalls an eine Matrix immobilisiert ist.
16. 16. Testkit zur Bestimmung der Funktionalität und/oder Quantifizierung eines Kollagen-bindenden Proteins oder einer Kollagenbindenden Substanz enthaltend (a) ein Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 15 (b) Substanzen oder Reagenzien für eine spezifische Detektionsreaktion, insbesondere zum Nachweis eines an Kollagen gebundenen Proteins oder einer gebundenen Substanz (c) gegebenenfalls eine Standard(Referenz)-Lösung enthaltend eine bestimmte Menge eines Kollagen-bindenden Proteins/Kollagen-bindenden Substanz.
17. 17. Testkit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet daß die Substanz zum Nachweis einer Bindung ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, ist.
18. 18. Testkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist, der gegen ein funktionell aktives Epitop der Plättchenbindungsstelle des vWF gerichtet ist.
19. 19. Verfahren zur Bestimmung der Funktionalität und/oder Quantifizierung eines Kollagen-bindenden Proteins oder einer Kollagen-bindenden Substanz umfassend die Schritte - Inkubieren eines biologischen Materials oder einer Probe, enthaltend ein zu bestimmendes Koilagen-bindendes Protein oder Substanz, mit einem Kollagen-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 15, unter Bedingungen, die eine Bindung des Proteins/der Substanz an Kollagen erlauben. - Durchführen einer spezifischen Detektionsreaktion, insbesondere zum Nachweis der Bindung eines Kollagen-bindenden Proteins/einer Kollagen-bindenden Substanz an Kollagen, und - Bestimmen der spezifischen Kollagenbindung.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die spezifische Detektionsreaktion als Immunassay erfolgt. 14 AT 403 963 B
21. 21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Immunassay als Enzym-, Chromo-, Lumino-, Fluoro- oder Radioimmunassay durchgeführt wird.
22. 22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß das Kollagen-bindende Protein, vWF, ein Derivat davon oder Fibronektin ist.
23. 23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material natürlichen Ursprungs oder durch ein gentechnisches Verfahren hergestellt ist.
24. 24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische Material Blut, Plasma, eine Plasmafraktion, eine Zellkultur oder ein Zellkuiturüberstand ist.
25. 25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensitivitätsgren-ze für den Nachweis eines Kollagen-bindenden Proteins in einer Probe, insbesondere von vWF, vorzugsweise bei 2 ng, besonders bevorzugt bei 1 ng, insbesondere bevorzugt bei 0,5 ng vWF liegt. Hiezu 5 Blatt Zeichnungen 15