DE2363854A1

DE2363854A1 - Substrat zur proteinasebestimmung

Info

Publication number: DE2363854A1
Application number: DE2363854A
Authority: DE
Inventors: Hermann Erich Dr Karges
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1973-12-21
Filing date: 1973-12-21
Publication date: 1975-06-26
Also published as: FR2255600B1; NL7416360A; ATA1021274A; IE40559L; IE40559B1; ES432961A1; SE7807953L; IL46310A; DE2363854C3; BE823771A; IL46310A0; LU71531A1; JPS5098893A; US3985620A; FR2255600A1; DE2363854B2; SE7415983L; IT1027847B; DK670374A; AT355225B

Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn)

Aktenzeichen: Hoe 73/b 023 - Ma 166

Datum: ²⁰· Dezember 1973

Substrat zur Proteinasebestimiaung

Die Erfindung betrifft ein. festes Substrat zur Proteinase— bestimmung, das sich insbesondere' zur Verwendung in gefärbten Lösungen, beispielsweise in haemoglobin- oder chlorophyllhaltigen Medien, eignet.

Für die Proteinasebestimmimg wird in der Literatur eine grosse Zahl von Verfahren beschrieben, die sich im wesentlichen in zwei Gruppen einteilen lassen, nämlich einerseits solche, bei denen hochmolekulare Eiweisskörper gespalten "werden und andererseits solche die auf einer Hydrolyse von niedermolekularen Substanzen wie Estern und Amiden beruhen. Bei der zweiten Gruppe besitzen die Spaltprodukte häufig eine veränderte Lichtabsorption gegenüber dem intakten Substrat. Die Änderung der Lichtabsorption beim Absorptionsmaximum der Spaltprodukte wird hierbei meist als ein Maß für die Enzymaktivltät verwendet. Üblicherweise wird angenommen, dass die Wirkung der Proteinase auf hochmolekulare Substrate im gleichen Sinne wie am niedermolekularen Material verläuft. Diese Voraussetzung ist .jedoch in komplexen Systemen, . di.e neben den Enzymen auch Inhibitoren enthalten, beispielsweise im Blut, nicht gegeben.

BAD ORIGINAL

Ma

Mit hochmolekularen Substraten wie Haemoglobin, Gelatine oder Casein kann man die proteolytische Wirkung einer Lösung korrekt bestimmen. Sie haben aber den Nachteil, dass sie nach der Inkubationszeit mit dem Enzym durch Fällung von den Abbauprodukten getrennt und anschliessend häufig noch mittels empfindlicher chemischer Reaktionen nachgewiesen v/erden müssen. Dadurch ergeben sich grosse Fehlerbreiten bei diesen Aktivitätsmessungen.. Darüber hinaus treten bei'beiden Gruppen von Bestimmung smethoden beträchtliche Mängel dann zutage, wenn die Messverfahren eine optische Ablesung erfordern, und die proteinasen haltige Lösung eine mit dem Messbereich interferierende eigene Absorption zeigt.

Es ist schon verbucht worden, hochmolekulare Substrate mittels reaktiven Farbstoffen einzufärben und die hydrolytische. Proteinasewirkung durch Messung der abgespaltenen Farbstoffmenge photometrisch zu bestimmen (Liter. : EL Ririderknecht et al., Clin.Chim.Acta 21, 197-203 (1968). Diese Methode hat jedoch den Nachteil, dass ihre Empfindlichkeit bei Verwendung von gefärbtem Hautpulver wesentlich von dessen Partikelgrösse beeinflusst wird. ·

Es wurde nun ein hochempfindliches festes Substrat zur Pro— teinasebestimmung gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Substratprotein in feiner Verteilung in oder auf der Oberfläche eines festen Trägers !covalent gebunden und E»it Reaktivfarbstoffen eingefärbt ist. Durch die feine Verteilung molekularen Substrate für die zu bestimmenden Proteinasen sehr gut zugänglich, und die Spaltung des Substrats führt zu einer von der Enzymaktivität abhängigen Freisetzung d.es daran gekoppelten Farbstoffes.

*werden die hoch-

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Als Substratproteine im Sinne der Erfindung eignen sich alle durch Proteinasen spaltbaren Proteine - insbesondere Haemoglobin, Casein» Fibrinogen oder Kollagen sowie deren Um- oder Abwandlungsprodukte wie Hitzefibrin, ζΡ -Casein, Gelatine, ferner wiedervernetzte Hydrolyseprodukte dieser Verbindungen, beispielsweise wiedervernetzte Polypeptide aus abgebauter .Gelatine, welche nach DP 1 118 792 hergestellt und als Haemaccel® (Warenzeichen der Behringwerke AG) im Handel sind»

Als Träger für diese Substrate eignen sich vor allem Copolymerisate aus einem aktiven Monomeren, d.h. einem solchen,-das aktive Gruppen wie die Carbonsaureanhydrid- oder die Isothiocyanat-Gruppierüng enthält, und einem inaktiven Monomeren ohne derartige Gruppen, z.B. "eine Äthenverbindung. Als aktive Monomere eignen sich insbesondere Maleinsäure-, oder Crotonsäureanhydrid oder Allylisothiocyanat, als inaMbive Monomere z.B. Propylen, Acrylamid oder Butadien.

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BAD ORIGINAL

^Ma

Die Copolymerisate können aus aktivem und inaktivem Monomeren in beliebigen Mengenverhältnissen bestehen. Entsprechend können Monomereneinheiten des aktiven Monomeren zu 0.01 bis 99.99 Mol-% im Polymerisat enthalten sein. Das Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Acrylamid wird vorteilhaft weniger als etwa 6 Mol-% Maleinsäureanhydrid, das Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Butadien weniger als etwa 90.Mol-% Maleinsäureanhydrid enthalten, während das Copolymere aus Maleinsäureanhydrid und Propylen vorteilhaft aus etwa 50?f Maleinsäureanhydrid und 50% Propylen besteht. Soll ein besonders hoher Anteil an aktiven Gruppen vorliegen, so lässt sich auch Homopolymeres des aktiven Monomeren, beispielsweise des Maleinsäureanhydrids als Trägermaterial für das Substrat-Protein einsetzen.

Der Träger muss sodann mit dem Substratprotein zur Umsetzung gebracht werden, so dass die aktiven Gruppen beider Partner kovalente Bindungen miteinander eingehen. Die Art der Reaktion und der dabei entstehenden kovalenten Bindung hängt naturgemäss von dem Charakter der in Reaktion tretenden aktiven Gruppen ab. Beispielsweise können unter entsprechenden Additions- oder Kondensationsreaktionen Peptid-, Harnstoff-, Thioharnstoff- _t Ester-, Acetal- oder Ätherbindungen geknüpft werden.

Sollten im Trägermaterial überschüssige aktive Gruppen zurückbleiben, die nicht mit den Substratproteinen in Reaktion getreten sind, so können diese gewünschtenfalls durch geeignete

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niedermolekulare Reagentien, z.B. Säureanhydridgruppen durch ein Arain wie Hexamethylendiamin abgebunden werden.

Weitere erfindungsgemässe Möglichkeiten zur Bindung in oder an einen inerten Träger (z.B. Polyacrylamid, Polyamid) bestehen in der Einführung von reaktionsfähigen Gruppen wie Isothiocyanat, reaktionsfähigen Doppelbindungen, Diazoniumgruppeji, Azogruppen oder reaktionsfähigen Halogenen in die Substratproteine, die demnach nach den üblichen chemischen Methoden mit dem Träger umgesetzt werden. Ist der Träger seinerseits mit reaktionsfähigen Gruppen ausgestattet, so lässt sich das Substrat sinngemäss wie vorstehend gezeigt daran binden.

Die Auswahl des Reaktivfarbstoffes richtet sich nach dem bevorzugten Verwendungsbereich des Substrats. Für die Messung der Proteinase im Blut oder haeiuoglobinhaltigen Medien insbesondere Organextrakten - werden vorzugsweise Farbstoffe verwendet, deren Absorptionsmaximum im Wellenlängenbereich >600 nm liegt, da hierbei eine Beeinflussung durch die Eigenabsorption des Haemoglobins stark zurücktritt. Besonders geeignet ist hierbei das im Handel erhältliche Remazol® (Remazol® = reg. Warenzeichen der Farbwerke Hoechst AG) türkisblau B (CI. (= Colour Index) Reactive blue 77). Andere Farbstoffe, die zur Substratfärbung geeignet sind, sirid Procion® ^türkisblau H 7 G (CI. Reactive blue 3), Remazol® schwarz RL (CI. Reactive black 31), Cibacron® ^xx^ türkisblau G-E (CI. reactive blue 7), Cibacron® türkisblau FGF-P (CI. 74460, Reactive blue 15), um einige Beispiele herauszugreifen. . ·

Bei chlorophyllhaltigen Pflanzenextrakten kann man Farbstoffe

x) Procion® = reg. Warenzeichen der ICI xx)Cibaeron®=: reg. Warenzeichen der Ciba AG

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wählen, die mindestens ein mit dem Pflanzengrün nicht interferierendes Absorptionsmaximum haben, z.B. Remazol® brilliantrot FB (CI. Reactive red 104) Remazol® briiliantrot BB (CI. Reactive red 21).

Zur Ein'färbung des auf oder in dem Träger !covalent gebundenen Substrats werden pH- und Temperaturbedingungen gewählt, wie sie vom Farbstoffhersteiler empfohlen werden. Nach der Reaktion des Farbstoffes mit dem Substrat wird der überschüssige Farbstoff· unter Kontrolle der Extinktion in dem entsprechenden Absorptionsmaxinrum ausgewaschen. Ein nach diesem Verfahren hergestelltes festes Substrat zur Proteinase-Bestimmung ist um den Faktor 5 bis 100 empfindlicher als die nach dem Stand der Technik eingefärbten hochmolekularen Substrate.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Substrats und von Mitteln, die das Substrat enthalten, zur Messung von Proteinaseaktivitäten. Nach Inkubation der proteinasehaltigen Lösungen mit dem gefärbten trägergebundenen Substrat^ die bei 0⁰C - 80⁰C je nach der Temperaturempfindlichkeit der zu bestimmenden Proteinase durchgeführt werden kann - vorzugsweise v/erden Temperaturen von 20~40°C angewendet - wird der leicht zentrifugierbare und filtrierbare Träger abgetrennt und'der freigesetzte Farbstoff in dessen Absorptionsmaximum gemessen. Die dabei erhaltene Extinktion ist in weitem Bereich linear von der zu messenden Proteinaseaktivität abhängig. Extinktionen ausserhalb des linearen Bereichs können durch Verdünnung der Enzymlösung vermieden werden. Durch die kovalente Bindung des Substratproteins an den Träger und des Farbstoffes an das Substratprotein ist das Substrat in weiten pH-Bereichen (pH 2 pH 12) während der für den Test benötigten Zeit stabil. Während adsorptiv am Träger angelagerte Substrate durch Änderung

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des Salzmilieus oder Anwesenheit von Proteinen, z.B. Albumin, leicht abgelöst werden, erlaubt das Substrat gemäss der Erfindung die Verwendung verschiedener Puffersysteme, je nachdem welches für die Messung der betreffenden Proteinase als optimal angesehen wird.

Die erfindungsgemässen Substrate sind geeignet, Proteinasen mit einer bei bekannten Substraten bisher nicht beobachteten 'Empfindlichkeit zu bestimmen, so z,B. Trypsin, Chymotrypsin, Kollagenase, Bromelain, Ficin oder Pronase. Die erfindungsgemässe Herstellung des Substrats und dessen Verwendung zur Bestimmung von Proteinasen, insbesondere im Blut, Gewebe- und Pflanzenextrakten, ist in den nachstehenden Beispielen beschrieben.

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Beispiel 1

400 mg eines pulverförmigen Polymerisats aus Maleinsäureanhydrid und Propylen im Molverhältnis 1:1 werden in 10 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 7.5 angeteigt und in einem Kältebad aus Eiswasser-Gemisch mit dem gleichen Phosphatpuffer auf 20 ml aufgefüllt. Eine Lösung von 120 mg Humanfibrinogen in 12 ml 0,15 M NaCl-Lösung wird zugefügt. Sodann werden zur Ver-Schliessung der überschüssigen Anhydridgruppen 8 ml Hexamethylendiamin hinzugefügt. Der Ansatz wird über Nacht gerührt, abdekantiert und das Gel dreimal mit je 40 ml 0.9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Nach diesem Auswaschen nicht-gebundenen Fibrinogens wird das Gel in 75 ml eines TrinatriumphosphatpufferSj der 720 mg Na-,ΡΟ/ . 12 HpO enthält, suspendiert und unter Zusatz von 360 mg Remazol® türkisblau B (CI. Reactive blue 77) 3 Stunden bei 40⁰C in einem Wasserbad gerührt. Anschliessend wird das Gel durch Zentrifugation niedergeschlagen mit 400 ml einer O,9?oigen Kochsalzlöspng bei 80 C aufgerührt und danach wiederum zentrifugiert. Dieser Waschvorgang 'zur Entfernung des überschüssigen, nicht kovalent gebundenen Farbstoffes wird insgesamt 10 mal wiederholt, wobei die ersten beiden Waschungen mit einer Kochsalzlösung durchgeführt werden, die auf 100 ml 0,2 ml einer 2 η Natronlauge enthält. Die folgenden 5 Waschungen erfolgen mit Kochsalzlösung ohne Zusatz. Die 8. Waschung wird mit Kochsalzlösung durchgeführt, die auf 100 ml 0,5 g Rinderalbumin enthält. Die Waschlösung für die letzten beiden Waschungen enthält keine-Zusätze. Danach wird abermals zentrifugiert und die Ausbeute bestimmt. Es werden 1,2 g feucht gewogenes Substrat erhalten. Für die Herstellung einer Substratpräparation zur Bestimmung.von Plasmin wird der Niederschlag in 3,6 ml eines 0,1 M Natriumeitratpuffers vom pH-Wert 7,4 suspendiert.

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Das auf diese Weise erhaltene Proteinasesubstrat kann direkt zur Aktivitätsbestimmung verwendet werden.

Gleich gute Werte werden erhalten, wenn das Substrat zur Lagerung lyophilisiert und unmittelbar vor der Verwendung in der entsprechenden Menge Wasser resuspendiert wird.

Beispiel 2

150 rag Fibrinogen vom Rind in 20 ml 0,15 M NaCl werden mit 5 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,6 und anschliessend portionsweise mit 15 mg Maleinsäureanhydrid versetzt und eine halbe Stunde bei Zimmertemperatur reagieren gelassen. Das so erhaltene MalepyLfibrinogen wird in einem Polymerisationsansatz nach L. Ornstein (Annal. N.Y. Acad. Sei. 121__f 321,1964) mit Acrylamid kopolymerisiert. Für den Polymerisationsansatz werden die von Ornstein vorgeschlagenen Lösungen A und C sowie eine Ammoniumperoxydisulfatlösung folgender Zusammensetzung verwendet: '

Lösung A :

48 ml 1'n HCl

36,3 g Trishydroxymethylami-nomethan ■

0,46 ml TEMED = Tetraäthylmethyl--äthylen-

diarain ad 100 ml desti7i.liertes Wasser

Lösung C :

(nach Ornstein, abgewandelt)

30 g Acrylamid

1,5 g Methylenbisacrylamid

ad 100 ml destilliertes Wasser Ammoniumperoxydisulfat:

1?£ige Lösung in destilliertem Wasser

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Die KopJLymerisation von 23 ml der oben erhaltenen Mäeoylflbrinogen-Lösung wird durch Zusatz von 5 ml der Lösung A, 6,25 ml der Lösung C .und 1,25- ml Ammoniumperoxydisulfatlosung eingeleitet und durch einstündiges Stehenlassen "bei Zi-immertemperatur vollendet. Danach wird das Gel mit 80 ml 0,9%iger Kochsalzlösung überschichtet und mit einem Laborhomogenisator (Ultra Turrax), zerkleinert. Das Produkt wird zentrifugiert und mit der gleichen Menge einer O,956igen" . Kochsalzlösung gerührt, darauf abermals abzentrifugiert und der Rückstand in 24 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 0,9 g Trinatriumphosphat enthält,, .suspendiert. Dazu werden 0,45 g Remazol® türkisblau B (CI. Reactive blue 77) gegeben. Die Mischung wird 3 Stunden bei 40°C gerührt. Der überschüssige Farbstoff wird sodann wie in Beispiel 1 ausführlich dargestellt ausgewaschen, wobei für einen Waschvorgang jeweils 240 ml einer 0,9%igen Kochsalzlösung und ggf. die in Beispiel 1 angeführten Zusätze verwendet v/erden.

Beispiel 3

3 g Haemoglobin" vom Pferd werden in 300 ral 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 gelöst und mit 900 mg pulverisiertem Kaieinsäureanhydrid versetzt. Anschliessend wird noch eine halbe Stunde gerührt. Das dabei entstandene Maleoylhasmoglobin wird entsprechend Beispiel 2 mit Acrylamid zu einem 5%igen Acrylamidgel kopolymerisiert. Für die Polymerisation \v^rerden die in Beispiel 2 angegebenen Lösungen nach Ornstein in folgenden Mengenverhältnissen eingesetzt:

Zu 300 ml der Maleoylhaemoglobinlösung werden 60 ml der Lösung A nach Ornstein, 75 ml der Lösung C. und 15 ml der 1?oigen Ammoniumperoxydisulfatlösung gegeben.

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- 1-er-

Nach 1 Stunde bei Zimmertemperatur wird das Gel mit 900 ml O, Seiger Kochsalzlösung überschichtet und mit einem Laborhomogenisator (Ultra Turrax) zerkleinert. Das Kopolymerisat wird zentrifugiert und mit dem gleichen Volumen einer 0,9%igen Kochsalzlösung kurz gerührt, danach zentrifugiert und der Rückstand in 450 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 10,8 g Na,P0^ . T2 H₂O enthält, suspendiert und bei 25⁰C mit 5,-4 g Remazol® türkisblau B (CI. Reactive blue 77) 18 Stunden gerührt. Der überschüssige Farbstoff wird wie in Beispiel 1 beschrieben ausgewaschen, wobei in der angegebenen Reihenfolge jeweils 4,5 1 der Waschlösung eingesetzt werden.

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Beispiel 4 yr

1 g Fibrinogen wird in 100 ml 0,2 M Phosphatpufi'er pH 7,4 .

gelöst und rail:. 10,4, mg (10 ul) Cr ο tonspure anhydrit üiirge-• ^J .beim Stehen des !Ansatzes gebildete ^ EC-jtst. Das/Crotonylderivat des Fibrinogens wird mxt Acrylaraid bei pH 8,5 zu einem 4%igen Gel !copolymerisiert. Ilier&u werden 100 ml der Crotonylfibrinoaenlösung mit den in Beispiel 2 beschriebenen Polymerisatslösungen nach Onistein umgesetzt, wobei hier 25 ml Lösung Λ, 20 ml Lösung C und 5 ml ftmifioniuifiperoxydisulfat zugegeben werden- Nach 1 Stunde wird das Gel mit 300 ml 0,9%iger Kochsalzlösung überschichtet, mit einem Laborhoinogenisator zerkleinert, anschließend zentrifugiert, einmal mit-Kochsalzlösung gewaschen, abermals zentrifugiert und. in 150 ml eines -IrinaLriumphosphatpuffers, der 1 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mitO,5.g Remazol'^R' türkisblau B (CI. Reactive bl\ie 77) bei 40°C umgesetzt.. Der überschüssige Farbstoff wird gemäß Beispie3 1 .unter Verwendung von jeweils 1,5 1 der Waschlösung ausgewaschen.

*) entsprechend Beispiel 2 Beispiel 5 · ■ ·

10 g Gelatine werden in 0,1 M Phosphatpuffer pH .8,5 bei 60°C gelöst und bei etv/a 30°C mit-56,5 ul (58,5 mg) Allylisothiocyanat umgesetzt. Es entsteht das Allylisothioharnstoff-*

/entsprechend Beispiel 2 derxvat. Dieses wird/mit Acrylainxd bei pH 8,5 zu einein -4%xgen Gel !copolymerisie.rt. irierzu v/eräen 100 ml einer 10%igen 7i.llylsiothioharnstoff-Gelatine-Lösung mit den in Beispiel 2 -angeführten Lösungen nach Ornstein umgesetzt, wobei hier 25 ml Lösimg A, 20 ml Lösung C uiad 5 ml Ammoniumperoxydisulfatlösung zur Anwendung gelangen. Nach 1 Stunde wird das Gel mit 3OO ml Ö,9%iger Kochsalzlösung überschi-chtet, mit .einem Laborhomogenisator zei'kleinert, zentrifugiert,. einm?il mit Kochsalzlösung gewaschen, abermals zentrifugiert und in 150 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 9,2 g Trinatriumphosphat enthalt_T suspendiert und mit 4,6 g Remazol^ ' türkisblau B (CI. .Reactive blue 77) bei 40^cC umgesetzt. Der überschüssige Farbstoff wird, gemäß J3eispiel 1 xuiter Verwendung von jeweils 1>5 1 der Vvaschlösuna ausqeya sehen . ·

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BAD ORiGlMAL^x

Beispiel 6 .. -

100 ml Haemaccel *' ^K'' mit einem Eiv;e.ißgehalt von 10/& v;erden mit 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer pH 8,5 gemischt und mit 56,5 mg Male ins äur eanhvdrid bei 30°C umgesetzt. Das maleoylier-

gemäss Beispiel 2
te Haemaccel wire/ mit "Acrylcimid bei pH 8,5 zu einem 4%igen Gel !copolymer!siert. Hierzu werden 2OO ml der Maleoyl-Hac.maecel-Lösung mit den in Beispiel 2 beschriebenen Polymerisationslösungen nach" Ornstein 'umgesetzt, wobei hier 50 ml Lösung Ά, 40 ral Lösung C und 10 ml Ämmoniumperoxydisulfatlösung zugegeben werden. Nach 1 Stunde wird das Gel mit 600 ml 0,9%iger Kochsalzlösung über schichtet, mit einer La.borhomogenisator zerkleinert, zentrifugiert, einmal mit Kochsalzlösung gewaschen,.· abermals zentrifugiert und in 300 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 9,2- g Trinatriumphosphat ent- . · hält, suspendiert'und mit 4,6 g Remasoi' ' türkisblau B (CI, Reactive blue 77) bei 4Ö°C umgefvotzt- Der überschüssige Farbstoff wird gemäß Beispiel Ί unter Verwendung· von jeweiJ.s 3 3. der Waschlösung ausgewaschen. '

Beispiel 7 ■ · · .

i .

1 g Casein wird in 0,1 M Citratpuffer pH 7,4" zu einer !Obigen Lösung gelöst. Bei Zimmertemperatur werden 0,2 ml Polyäthylenglycol-Ä, <λ) di-(SuIfophenyl-4-isothiocyanat) mit einem Molekulargewicht zwischen 1000 und 6000 zugesetzt und bis zum Erstarren gerührt. Nach i Stunde wird das Gel zerkleinert. Each.Auswaschen des nicht gebundenen Proteins mit 2 χ 50 ml eines O,l M Citratpuffers pH 7,4 wird das Gel zentrifugiert und in 50 ml eines Trinatriumphosphatpuffers, der 1 g Trinatriumphosphat enthält, suspendiert und mit 0,.5 g Remazol. brilliantrot FB (C.I. Reactive red 104) versetzt und 3 Stunden bei 4O°C gehalten., Der überschüssige Fcurbstoff wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von jeweils 1 1 Waschlösung ausgewaschen.

BAD ORtGlNAL 9826/0aA8

^fEt- - - <& - ' Me' 166 "

600 rag #—Casein werden in 0,05 M Trispuffer pH 7,5', der 0,09 M KaCl enthält, zu einer 3%igen Lösung gelöst und Ί Stunde auf 80°C erhitzt. Nach Abkühlen auf 30⁰C werden 0,15 rnl PolyäthyD.englycol-Φ, O di- (SuIfopheny1-4—isofchiocyanat) mit einem Molekulargewicht zv/isehen 500 und 1000 zugesetzt und das Gemisch bis zum Erstarren gerührt. Nach 1 Stunde'wird das Gel zerkleinert und das nicht gebundene Protein mit 2 χ 100 ml eines 0,1 M Citratpuffers pH 7,4 ausgewaschen, zentrifugiert und in 20 ml eines Tr ina tr xumphosphatpuf fers, der 600 reg Trinatriumphosphat enthält, suspendiert. Zu dieser Suspension werden 300 rag Procion türkisblau H 7 G (C..1. Reactive blue 3) zugesetzt, 30 Min. bei.40°C gehalten und anschließend noch 30 Min. auf 80⁰C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird der überschüssige Farbstoff gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von jeweils. 200 ml Wcischlösung. ausgewaschen-

£Q9826/QS48

Versuch · 1

Ma 166

Zu 50 rag eines aus Suspension in phys. Kochsalz gefriergetrockneten Substrats nach Beispiel 2 werden 2 ml'aqua dest. und 2 ml O,l molaren Citratpuffers pH 7,4 pijpettiert und der /insätz 5-Min» bei Zimmertemperatur gelassen. Anschließend wird mit einem_Glasstab eine homogene Suspension hergestellt und diese 5 Min. bei 37°C im Wasserbad inkubicrt. 2 ml Citratblut von einem Patienten unter Fibrinolysetherapie werden sofojrt nach der Abnahme aus der Armvcne zürn Substrat gegeben und der Einsatz gut durchgemischt. Es wird 15.Min, bei 37°C unter 3maligem' Umschütteln inkulpiert.. Der-Abbau wird nach 15 Min. durch Zusatz von 1 ml einer verdünnten Lösung des Kunitz Trypsin-lnhibitors mit 500 KIE/ml gestoppt. Nach Jibschleudern des Substrats durch 10 Min. Zentrifugation bei 3000 UpM in einer Laborzentrifuge wird der klare Überstand' abgehebert und bei 665 nm im Spektralfotometer gemessen. Anhand einer Eichkurve läßt sich die Plasminaktivität ablesen. Für einen Patienten nach 10_Min► Fibrinolysetherapie ergab sich z.B. eine /|E 665 nm von 0,235 0Ξ. Aus einer Eichkurve , die mit Hilfe definierter Mengen Plasmin erstellt wurde und QS als Pig.1 beigefügt ist, .liest man eine Plasminaktivität von Oi 16 Einheiten nach Remmert & Cohen für diesen" Zeitpunkt ab.

Unter Abänderung der Versuchsbedingungen lassen sich beispielsweise folgende Enzyme bestimmen;

Enzym	Substrat⁵¹-'	• Puffer	pH	Inkubation s- temperatur	Inkubations dauer
Trypsin	Haemaccel	0,05 M Tr is	8,0	37°C	15'Min.
Chymo trypsin	Gelatine	0,05 M .Phosphat	7,5	37°C	15 Min,
KoIla- qena se	Ko3.1agen	0,1 M Citrat	7,4	. 37°C	. 30 Min.
Bro mcia in	Casein	0,1 M Acetat	4,0	40°C	30 Min.
F ic in	Haemo globin	0,05 M Tris '	8,5	40⁰C	20 Min.
Pronase ... . J	Casein	0,06 M Borat	•9,0	. 40°C	10 Min,

x) Träger und. Farbstoff können ira Rahmen der Erfindung ' beliebig gewählt v/erden.

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BAD 0RK3INAL

Versuch 2 _ >9^~ ^a "'66

Vergleich der Empfindlichkeit des erfindungsgemäß hergestellten Substrats.mit einem dem Stand der bisherigen Technik entsprechenden Handelsprodukt/ hergestel.lt aus dem denaturierten Kollagen der Kuhhaut, an welcher ein blauer Farbstoff gebunden ist, beim jeweiligen Absorptionsmaximum. Als Enzym wir .'Ü Trypsin (Serva, 2 χ kr ist.) verwendet. Der Abbau \\vird· in 0,05 M Tris pH. 7,8 bei 37°C 15 Minuten durchgeführt vind mit einem Proteinaseninhibitor gestoppt. Das Volumen des Reaktionsansatzes betrug 6 rnl.

Trypsinmcnge . ng	Substrat I " (Handel.^produkt) A E 595 ran	Substrat II • (erfindungsgern. Substrat) /χ E 665 »in
* 0 10 50 100 10.000	Ο,ΟΟ nicht getestet 0,001 0,004 0,670	0,00 0,045 0,2 60 0,485 η i-cht ge te s te t

Wie aus den Vergleichszahlen ersehen werden kann, ist daserfindungsgernäß hergestellte Substrat wesentlich empfindlicher als das Substrat des Standes der Technik.

ORfGiNAL

50S826/0.8 48

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EicWcurve für Plasmin

"Festes Substrat zur Proteinasebestimmung"

Claims

Ma

Pat entansp-rU ehe

IJ Substrat zur Proteinasebestimmung, gekennzeichnet durch ein Substratprotein, das in feiner Verteilung in oder auf der Oberfläche eines festen Trägers kovalent gebunden und mit einem Reaktivfarbstoff eingefärbt ist.
2. Substrat gemäss.Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Substratprotein Haemoglobin» Casein, Fibrinogen, Kollagen oder ein Umwandlungsprodukt eines dieser Proteine ist.
3* Substrat gemäss Ansprüchen 1-2, dadurch gekeimzeichnet, ..?. dass der Träger ein Homopolymeres eines aktiven Monomeren oder ein Copolymeres aus einem aktiven und einem inaktiven Monomeren "d:st.
4. Substrat gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das aktive Monomere Kaieinsäureanhydrid, Crotonsäurean— hydrid oder Allylisothioeyanat ist.
5. Substrat gemäss Anspruch 3, dadurch .gekennzeichnet, dass das inaktive Monomere Propylen, Acrylamid oder Butadien ist.
6. Substrat gemäss Ansprüchen 3—5, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Copolymeres aus Maleinsäureanhydrid und Acrylamid mit einem Anteil von bis zu etwa 6 Mol-% Maleinsäureanhydrid ist.
7. Substrat gemäss Ansprüchen 3-5, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Copolymeres aus Maleinsäureanhydrid und Butadien mit einem Anteil von bis zn etwa 90 MoI-^o Maleinsäureanhydrid ist.
8. Substrat gemäss Ansprüchen 3 - 5, dadurch gekennzeichnet,

BADORiGINAL

dass der Träger ein Copolymeres aus gleichen Teilen Maleinsäureanhydrid und Propylen ist.
9. Substrat gemäss Ansprüchen 1-2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger ein Homopolymeres aus Maleinsäureanhydrid ist.
10. Substrat gemäss Ansprüchen 1-9» dadurch gekennzeichnet,, dass der Reaktivfarbstoff ein solcher mit einem Absorptionsmaximum im Wellenbereich >600 nm -ist»
11. Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Proteinasebestiiranung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger aus einem Copolymerisat eines aktiven und eines inaktiven Monomeren mit einem Substratprotein derart umgesetzt wird, dass die aktiven Gruppen des Trägers mit denen des Substratproteins kovalente Bindungen eingehen und das Reaktionsprodukt mit einem Reaktivfarbstoff eingefärbt wird,
12. Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Proteinasebestimmung, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger, der keine aktiven Gruppen enthält, mit einem SubstratprotQin unter Zuhilfenahme eines aktive-Gruppen liefernden Stoffes umgesetzt und das Reaktionsprodukt mit einem Reaktivfarb» stoff eingefärbt wird.
13. Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Proteinasebestimmung, dadurch gekennzeichnet, dass in ein Substratprotein reaktive Gruppen eingeführt werden, das sodann mit einem inaktiven Monomeren copolyraerisiert \\rird„
14. Verfahren zur Herstellung eines Substrats zur Proteinassbestinxfiung, dadurch gekennzeichnet, dass ein mit reaktiven Gruppen ausgestattetes lösliches Polymeres mit dem Substratprotein vernetzt vircl.

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* - . Ma:.·
15. Verwendung eines Substrats nach Ansprüchen 1-14 riur Messung von Proteinaseaktivität insbesondere in gefärbten Lösungen.
16. Mittel zur Proteinasebestimmung enthaltend ein Substrat gemäss Ansprüchen 1 ~ 14.

^BAD ORK3/NfAL 509826/0848