DE2900546B2

DE2900546B2 - Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente, welche in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen Liganden-Referenzstandard und Verwendung der standardisierten markierten Bindungskomponente in spezifischen Bindungstest-Verfahren

Info

Publication number: DE2900546B2
Application number: DE2900546A
Authority: DE
Inventors: Leith G. Hillingdon Middlesex Huggins; Ivan M. London Roitt
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1978-01-26
Filing date: 1979-01-08
Publication date: 1980-09-11
Also published as: GB2013337A; FR2445966A1; US4211762A; AU513556B2; DK32579A; CA1114290A; DE2900546A1; FI790228A; SE7900343L; DE2900546C3; GB2013337B; AU4366879A; NO790252L

Description

Überempfindliche Menschen sind hei den Kontakt mit den Antigenen aus einem Allergen allergisch und reagieren unter Bildung von Antikörpern gegen dieselben. Ein darauffolgender Kontakt mit einem jener Antigene oder einer strukturell ähnlichen Substanz kann bei einem allergisch reagierenden Menschen eine pathologische Reaktion hervorrufen, was auf die Anwesenheit derartiger Antikörper zurückzuführen ist. Wenn diese Menschen das in Frage kommende Antigen einatmen oder es durch die Nahrung aufnehmen, so ergeben sich als auffallende und übliche Manifestationen Heuschnupfen, Asthma oder Ncssclausschlag. Diese Antikörper scnsibilisieren das Gewebe und können als Reagin Ig bezeichnet werden. Es gibt fünf Klassen von Antikörpern: IgE, IgG, IgA, IgM und IgD. IgE bildet die Klasse von Antikörpern, die besonders für atopische Allergien verantwortlich ist.

Inrvjvo-diagnostische Tests auf Atopie, d. h. die Bestimmung der Anwesenheit von IgE, das als Reaktion auf Allergen gebildet wurde, werden im allgemeinen durch Injizierung kleiner Mengen des vermutlichen Allergens in die Haut des empfindlichen Menschen durchgeführt; daraufhin wird die Injektionsstelle untersucht, ob sich auf der Haut derselben ein unregelmäßiges Pustel bzw. Quaddel bildet, welches von einer Erythämiezone umgeben ist. Neben den in-vivo-Versuchen wurden auch in-vitro-diagnostische Tests entwickelt. Eine Art der in-vitro-diagnostischen Verfahren umfaßt analytische Verfahren, die im breiten Sinne als »spezifische Bindungsteste« klassifiziert werden können.

Im Hinblick auf in-vitro-diagnostische Tests auf Atopie umfassen die Verfahren zur Durchführung spezifischer Bindungstest den Nachweis eines Liganden in einer Körperflüssigkeit. Ein typisches Verfahren eines spezifischen Bindungstests besteht in der Bestimmung der IgE-Antikörper (Ligand) im Blutserum eines überempfindlichen Menschen. US-PS 3720760 betrifft einen diagnostischen in-vitro-Tcst, der als »RAST« (radioallergosorbeiii test) bezeichnet wird.

Der Test besteht aus einem ersten Schritt, bei dem ein Test-AIIergcn (Antigen) an ein unlösliches polymeres Substrat unter Bildung eines gebundenden Fcstphascn-Antigens gebunden wird. Der zweite Schritt umfaßt das Inkontaktbringcn des Fcstphasen-Antigcns mit dem Serum eines atopischen Individuums (bei dem IgE-Antikörpcr vorliegen). Das IgE haftet bzw. verbindet sich mit dem IgE-Rczcptorzentrum des Antigens unter Bildung eines Antigcn-Liganden-Komplexcs. Im dritten Schritt wird der Komplex mit einem markierten Bestandteil in Kontakt gebracht, wobei dieser rnarkit,!';¹ Bestandteil ein Konjugat aus einer Markierungssuhstanz und einer Bindungskomponente (die in der Lage ist, eine Bindung mit dem Liganden einzugehen), d. h. radiomarkiertcs Anti-IgE, ist.

Als Markierungssubstanzcn lassen sich verschiedene Stoffe verwenden. Infolge der Gefährlichkeit und Schwierigkeit bei der Handhabung radioaktiver Materialien wurden zahlreiche neue Testsysteme, die als Systeme vom »RAST-Typ« bezeichnet werden können, entworfen, wobei keine radioaktiven Isotopen als Markicrungssubstanz verwendet werden. Beispiele von Markicrungssubstanzen umfassen freie Radikale, fluoreszierende Moleküle (z. B. Fluorcsccin-Isothiocyanat und Rhodium-Farbstoffe), lumineszicrendc Moleküle, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme und Enzyminhibitoren.

Antikörper setzen sich in der Regel aus vier Ketten zusammen, und zwar aus zwei sogenannten leichten und zwei schweren Ketten. In beiden Kettentypen bcsteht ein konstanter Bereich und ein variabler Bereich, d. h. die Aminosäuresequenz des Bereiches ist jeweils verhältnismäßig konstant oder variabel. Die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs richtet sich nach der Identität des Antigens, gegen welches derselbe gerichtet ist; der variable Bereich des Antikörper-Moleküls, der sich mit dem Antigen verbindet, wird vom Antikörpcr-Bindungsfragmcnt (F'ab), welches durch Papain-Abbau ehalten wird, umfaßt. Der konstante

Bereich variiert nicht in Abhängigkeit vom Antigen, gegen welches das Antikörper-Molekül gerichtet ist, sondern ist für eine bestimmte Antikörper-Klasse charakteristisch. Ein Teil des konstanten Bereiches der schweren Kette bildet das andere Fragment (Fc), das beim Papain Abbau freigesetzt wird.

IgE bindet an das Antigen über dem Antikörper-Fragment-C-ffl^-Bereich des Antigen-Moleküls, wobei der Fc-Bereich freibleibt. Das radiomarkiertc Anti-IgE bindet dann an das IgE über den Fc-Bereich von IgE.

Das RAST-Reaktionsprodukt stellt ein Substrat dar, an das drei »Schichten« gebunden sind: (1) Festphasenanzeige: (2) IgE, das sich spezifisch gegen das Antigen richtet, und (3) radiomarkiertes Anti-IgE, das spezifisch mit IgE reagiert. Die vom radiomarkierten Reaktionsprodukt herrührende radioaktive Strahlung ist ein MaB für die Menge des vorhandenen antigenspezifischen IgE im Testserum. Die Verwendung von RAST erlaubt, wie dies oben beschrieben wird, die Bestimung des Vorliegens und - zu einem begrenzten MaBe - die Bestimmung der Menge des im Serum des Patienten vorliegenden IgE₁ welches in der Lage ist, mit dem an das Substrat gebundene Antigen zu reagieren. Dieser Test gibt zusammen mit Hauttests eine Indikation, ob der Patient gegenüber einem Antigen allergisch reagiert oder nicht.

Nach Diagnose einer Atopic wird üblicherweise zur Behandlung der allergischen Störung eine Immunisierung (»Desensibilisierung«) des Individuums mit Hilfe einer Reihe von Injektionen von langsam zunehmenden Mengen an Allergcnextrakten durchgeführt. Infolge der Gefahr des Auslösens eines anaphylaktischen Schocks müssen die verabreichten Mengen an Allcrgcncxtrakt sorgfältig kontrolliert werden.

Da Schwankungen in der Wirksamkeit des verabreichten Allergcncxtraktcs, wie dies bei Messungen der Reaktivität auf der Haut der empfindlichen Menschen induziert wird, auftreten können, ist es wünschenswert, eine Verbesserung des Standardisicrcns von Allergcnextrakten zu erreichen. Es wird angenommen, daß Schwierigkeiten beim Standardisieren von Allergenextrakten dadurch entstehen, daß Allcrgcncxtraktc (z. B. Blütenstaub) im allgemeinen komplexe Gemische darstellen und es ist schwierig zu bestimmen, welche Bestandteile für das Auslösen einer allcrgcnen Reaktion oder eines therapeutischen Effektes während der Therapie verantwortlich sind. Die Verfahren, um die Wirksamkeit derselben auszudrükkcn, sind weitgehend indirekt und basieren entweder auf dem einfachen Verhältnis des rohen Ausgangsmatcrials zum Volumen an Extraktionsflüssigkeit oder sie basieren auf dem Proteinstickstoffgchalt de» Extraktes. Da offensichtlich die meisten Allergene proteinartiger Natur sind, wurde eine Bestimmung der Wirksamkeit durch Proteinstickstoff-Einheiten (PNU), definiert als 0,01 μg Phosphorwolframsäurepräzipitierbarem Stickstoff, weitgehend akzeptiert. Der PNU-Gehalt ist jedoch nicht notwendigerweise mit der biologischen Aktivität vergleichbar, da Allergenextrakte Proteine enthalten können, die nicht als Allergen wirksam sind. Außerdem können spezifische Pmteinallergene während der Extraktion oder während der Lagerung denaturiert werden, wodurch sich ein Verlust ihrer biologischen Aktivität ergibt, wohingegen sie bei der chemischen Bestimmung als Protein vorliegen und mitgerechnet werden.

Eine zweite Anwend jng von Bindungstest-Verfah

ren, wie sie RAST darstellt, besteht in der Bestimmung der Wirksamkeit von AHergenen in dem Versuch, Allergene, die bei diagnostischen Hauttesten und in der in-vivo-Desensibilisierung Verwendung finden, zu standardisieren. Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem die zweiten und dritten Schichten (nämlich IgE und markiertes Anti-IgE) konstant gehalten werden und im ersten Schritt zunehmende Mengen an löslichem Antigen zugegeben werden. Das Prinzip dieser Methode basiert auf einer Kompetition zwischen Antigen der festen und flüssigen Phase an IgE-Rezeptoreentren im ersten Schritt von RAST. Mit der Zunahme der Menge an löslichen Antigen komplexiert eine kleinere Menge IgE mit dem Festphasen-Antigen, was auf eine zunehmende Komplexbildung zwischen dem Antigen der flüssigen Phase und IgE zurückzuführen ist. Dies wiederum läßt die prozentuale Bindung des radiomarkierten Anti-IgE an das Festphasen-Antigen im dritten Schritt von RAST abnehmen. Diese Abnahme in Prozent Bindung von Anti-IgE an Festphasen-Antigen ^r^.hrt zu einer Abnahme der von der Festphase emi'iierten Strahlung.

Ausgehend von 100% Bindung kann durch sorgfältige Titration die Menge an löslichem Antigen bestimmt werden, die erforderlich ist, um 50% Inhibierung der Bindung zu erreichen. Durch Auftragen der Menge an erforderlichem, löslichen Antigen gegen die gebildete Inhibitierung (auf halblogarithmischem Papier) kann eine annähernd lineare Beziehung aufgestellt werden. Insbesondere im Bereich von 30 bis 70% Inhibierung ist der halblogarithmische Kurvenverlauf weitgehend linear. Der Endpunkt dieser Titrationen kann willkürlich bestimmt werden als die Menge an Allergenextrakt, die für 50% Irihibierung erforderlich ist. Theoretisch würde der Vergleich einer Reihe von Allergenextrakten ausreichende Verglcichsdaten bringen, um eine Standardisierung der Extrakte durchzuführen (J. Allergy din. Immunol. 63 [1974], Seiten 158-169). Wie nachfolgend beschrieben wird, zeigt dieses Verfahren eine Reihe von Nachteilen.

Ein Nachteil liegt im Anti-IgE selbst. Das beim RAST schießlich verwendete Reagenz, das radiomarkicrtc Anti-IgE, wird durch Radiomarkierung mit einem radioaktiven Jodsalz hergestellt. Auf diese Weise wird ein radiomarkiertes Anti-IgE mit einer Halbwertszeit gebildet, die kurz genug ist, um die notwendige Empfindlichkeit für eine Messung bei niedrigen Konzentrationen von IgE zu gewährleisten. Diese kurze Halbwertszeit bedeutet jedoch, daß sich das radiomarkierte Anti-IgE schnell verändert, wodurch dessen Verwendung als ein Standardreferenzreagenz über linen längeren Zeitraum hinweg nicht möglich ist. Darüber hinaus entstehen durch harte Jodierungsbedingungen und darauffolgende Strahlungsschäden während dem Radiomarkierungsverfahren Variationen in dem radiomarkierten Anti-IgE. Aufgrund dieser Variationen ist es nicht möglich, zwei Bcstimmungen, die zu verschiedenen Zeiten durchgeführt wurden, direkt zu vergleichen, indem die gleiche Charge des radiomarkierten Anti-IgE verwendet wird oder indem zum gleichen Zeitpunkt verschiedene Chargen von radiomarkiertem Anti-IgE verwendet werden. Durch Standardisierung des radiomarkierten Anti-IgE gemäß de; Erfindung werden diese Nachteile verhindert.

Eine Standardisierung durch RASl-Inhibierung

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ergibt andere Nachteile. RAST seihst stellt keine standardisierte Methode dar. In typischer Weise werden Radioimmunobestimmungen durch Schaffung festgesetzten, gut definierten Referenzreagenzes, entweder eines Antigens oder eines Antikörpers standardisiert. Allergene stellen jedoch komplexe Mischungen dar, die sich nicht gut definieren lassen; außerdem ist ihre Stabilität nicht eindeutig bekannt. Auf diese Weise kann jedoch durch dieses Verfahren RAST nur teilweise standardisiert werden. Es wurde jedoch vorgeschlagen (J. Allergy din. Immunol, 63 [1974], Seiten 158-169), daß Serum von atopischen Individuen als Referenzreagenz für die häufiger auftretenden Allergien verwendet werden könnte. Aber auch dies würde nur eine teilweise Standardisierung von RAST ergeben, da Serum ein komplexes Gemisch mit schlecht definierten Antikörperspezifitäten darstellt. Trotz der inhärenten Schwierigkeiten wurde eine bevorzugte Verwendung aiopischer Seren beim direkten RAST-Verfahren vorgeschlagen (Advances in Diagnosis of Allergy: RAST, Seiten 85-99, Symposium specialists [1975]).

Theoretisch könnte das im dritten Schritt von RAST verwendete radiomarkierte Anti-IgE dadurch standardisiert werden, indem die ersten und zweiten Schichten konstant gehalten werden und man das radiomarkierte Anti-IgE in der dritten Schicht vergleicht. Das standardisierte radiomarkierte Anti-IgE könnte dann dazu verwendet werden, das RAST-Verfahren selbst zu standardisieren. Eine Standardisierung von Anti-IgE-RAST mit standardisiertem radiomarkierten Anti-IgE wäre nützlich, indem ein Standardreagenz verwendet werden könnte, ungeachtet des in der ersten Schicht vorliegenden Allergenextraktes. Da jedoch die Reagentien, die in den ersten zwei RAST-Schritten verwendet werden, komplexe Gemische von schlecht definierter Stabilität darstellen, ist es schwierig, diese Schritte von einem Experiment zum nächsten präzise zu reproduzieren. Da es auch Schwierigkeiten bereitet, die Aktivität von radiomarkierten Anti-IgE-Proben präzise zu definieren, könnte dieses Reagenz nicht ohne weiteres als Referenzstandard verwendet werden.

Wie bereits im vorhergehenden ausgeführt, stellt die Radioimmunobestimmung ein wichtiges Beispiel eines Hindungstestes unter Verwendung einer markierten Verbindung dar, wie z. B. die Radioallergosorbent-(RAST)-Verfahren. Alternative markierte Materialien, die ebenfalls vorgeschlagen wurden, sind freie Radikale, fluoreszierende Moleküle, lumineszierende Moleki«!e, Bakteriophagen, Enzyme, Coenzyme oder Enzyminhibitoren. Es bestehen ähnliche Schwierigkeiten zur Definition der Aktivität eines jeglichen markierten Materials, ungeachtet des Materials, gegen das es gerichtet ist, oder des Typs der verwendeten markierten Verbindung.

Ceska und Lundvkist beschreiben in »Immunochemistry«, 2 (1972), Seiten 1021-1030 einen dreischichtigen Festphasen-Test für nicht-spezifisches IgE. Die erste Schicht besteht aus nichtmarkiertem Anti-IgE; die zweite Schicht ist das untersuchte IgE und die dritte Schicht besteht aus markiertem Anti-IgE. Dieses Verfahren kann nicht dazu verwendet werden, markierte Bestandteile zur Verwendung in einem spezifischen Bindungstest zu standardisieren, da das Fesiphäsen-Anii-IgE der ersien Schichi teilweise sterisch die darauffolgende Bindung des markierten Anti-IgE der dritten Schicht hindert. Eine sterische Hinderung tritt dann ein. wenn das 1-eslphasen-Anti-IgE der ersien Schicht einige Moleküle IgF auf eine solche Weise bindet, daß diese zur Bindung ties markierten Anti-IgE der dritten Schicht nicht verfügbar sind. Kine sterische Hinderung ist bei spezifischen Bindungstest-Verfahren unerwünscht.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente, welche in einem spezifischen Bindungs-Test verfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen Liganden-Refercnzstandard zur Verfugung zu stellen. Verbunden mit dieser Aufgabe ist die Verwendung der standardisierten markierten Bindungskomponente zur Bestimmung der Allergenwirksamkeit und zur Bcstimmungder Menge des in Körperflüssigkeiten vorliegenden Liganden.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 getost.

in cii'M raiciiiaiuipiüi'iicii 2 unu 3 Miiii viiiiciiimiii: Ausgestaltungen des Verfahrens und in den Patentansprüchen 4 und 5 bevorzugte Verwendungen einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren standardisierten markierten Bindungskomponentc beschrieben.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert.

Fig. 1 stellt eine Standardkurve (aufgetragen auf logit gjgen log-Achsen) zur Bestimmung der IgF-Menge, ausgedrückt in World Health Organization-(WHO)-Einheiten;

Fig. 2 ist eine Kalibrierungj-kurve der Bindung von '•'Ί-markiertem Anti-IgE an IgE auf Anti-L-Ketten-Scheiben;

Fig. 3 stellt grafisch eine Titration von atopischen Seren auf Allergen-Scheiben zur Bestimmung der für den Versuch erforderlichen Verdünnung des Serums dar; die Kapazität der Scheibe (Δ) beträgt 170 X 10 ¹U IgE;

Fig. 4 ist eine grafische Darstellung eine Titration von zwei verschiedenen Allergenextrakten durch spezifische Bindungstest-Inhibierung, unter Verwendung eines atopischen Serums; (ΔΕ) = 170 x 10 ' U IgE; und

Fig. 5 stellt eine schematische Darstellung der Bestimmung der Allergenwirksamkeit gemäß der Erfindung dar.

Wie im vorangehenden erläutert, besitzen Antikörper-Moleküle am Ende des Moleküls ein Antigen-Bindungsvermögen, das als Antigen-Bindungsfragment (Fab) bezeichnet wird; diese Eigenschaft ist spezifisch in bezug auf die Bindung spezifische / Antigene. Am anderen Ende des Moleküls, das als Fc bezeichnet wird, werden keine Antigene gebunden.

Bei spezifischen Bindungs-Testverfahren, welche Radioisotope einschließen, binden die IgE-Antikörper an das Antigen über den Fab -Bereich, wobei der Fc-Bereich frei bleibt. Während der zweiten Inkubation mit dem radiomarkierten Anti-IgE bindet das Anti-IgE an den freigebliebenen Fc-Bereich des IgE-Moleküls. Um in diesen Tests eine richtige Funktion zu gewährleisten, muß das markierte Anti-IgE auf eine Weise standardisiert werden, die weitgehend die Aktivität des markierten Anti-IgE im Test simuliert. Dieses »Simulierungsc-Erfordernis bedeutet, daß aufgrund der Tatsache, daß die spezifische Bindungs-Testmethode, z. B. RAST, oder Methoden, die andere Markierungssubstanzen, wie Enzyme, verwenden, sterisch verhältnismäßig ungehindert sind,

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die Verfahren zum Standardisieren von markiertem Anti-lgF steriseh ebenfalls relativ ungehindert sein sollten. Das vorliegende Stnnclardisierungsverfalircn unter Verwendung von Anti-l.(lcicht)-Ketten-Antikörpein. die an ein Fcstphasen-.Substrat gebunden sind, erfüllt dieses Simulienmgserfordernis.

Bei der crfindunsgcmiiUcn Methode können vcrsc!> .-dene markierte Substanzen in spezifischen Bindungs-Testverfahren verwendet werden. Bevorzugte Ausfiihrungsformen umfassen Radioisotope und Enzyme. Der markierte Bestandteil kam, in sämtlichen dreischichtigen, spezifischen Bindungs-Test verfahren verwendet werden. Bevorzugte Ausführungen hinsichtlich lter Verwendung umfassen die Standardisierung von Allergenextrakten und die Bestimmung oder den Nachweis eines Liganden in einer Körperflüssigkeit. Diese Ligmidcn umfassen Antikörper, z. B. Ig. und Proteine. Eine bevorzugte Ausführungsform stellt #!<»»■ Niur'Hu/**ii: .u1pr rtin Hpclimmimo unn InP- in :it*irw_ -··<? c· f-·

schein Serum dar.

Beim Standardisierungsverfahren gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird radiomarkiertes Anti-lgF' gegen IgE standardisiert. IgE wird wiederum gegen einen IgE-Rcferenzstandard standardisiert, wie z. B. ein Standard-lgE-Refercnzserum, welches von der World Health Organization (WHO) erhältlich ist und das als IgE (69/341) bezeichnet wird und 10000 WHO-Einheiten pro ml enthält.

Beispiele

Verfahren zur Standardisierung von
radiomarkiertem Anti-IgE

Wie nachfolgend unter (A) beschrieben, wurde IgE mit Na¹¹¹I radiomarkiert. Die emittierte Strahlung wurde gemessen. Die Beziehung zwischen der von "¹I radiomarkiertem IgE emittierten Strahlung und der Menge an vorliegendem IgE-Protein in dem radiomarkierten IgE wurde, wie nachfolgend beschrieben, durch eine Doppel-Antikörper-Methode nach Gleich et al (J. Lab. Clin. Invest., 77 [1971], Seiten 690-698) beschrieben unter Bezugnahme auf eine aufgestellte Standardkurve unter Verwendung des WHO-IgE-Referenzserums bestimmt, wobei die Konzentration des radiomarkierten IgE-Proteins in WHO-Einheiten ausgedrückt ist.

Die Standardkurve wurde nach der Doppel-Antikörper-Methode aufgestellt, wobei eine kompetitive Flüssigphase-Inhibierung einer Reaktion zwischen ^i:5I-radiomarkiertem IgE und nicht-markiertem Kaninchen-Anti-IgE mit zunehmenden Konzentrationen an WHO-IgE-Referenzserum genutzt wurde. Das ¹'' I-radiomarkierte IgE ersetzte in dem Inhibitionstest das WHO-Referenzserum. Die Fähigkeit von ¹³¹I-radiomarkiertem IgE die Bindung von ¹²⁵I-radiomarkiertem IgE an nicht-markiertes Kaninchen-Anti-IgE zu inhibieren, wurde, unter Bezugnahme auf eine Standardkurve, mit der Inhibitionsfähigkeit des WHO-IgE-Referenzserums in dem gleichen Test verglichen und die Konzentration von IgE in "'I-radiomarkiertem IgE-Präparation aufgestellt.

Jod-125-radiomarkiertes IgE, das im Handel von Pharmacia, London, erhältlich ist, wurde mit nichtmarkiertem Anti-IgE, das im Handel von Behring Werke AG, erhältlich ist, in Gegenwart zunehmender Mengen an WHO-IgE-Referenzserum umgesetzt unter Bildung einer Reihe von ¹²⁵I-radiomarkierten IgE-Anti-IgE-KompIexen. Da es erforderlich ist, diese Komplexe von dem löslichen, nicht-umgesetzten

I-radiomarkierten IgF abzutrennen, wurden sie durch Zugabe von Esel-Anti-Kaninehen-Immunoglobulin Serum, das im Handel von Wellcome Laboratories erhältlich ist, präzipitiert.

Die von 'M-radiomarkiertem IgF-. emittierte Strahlung, welches in der Reihe von Komplexen vorlag, wurdi bestimmt und eine Standardkurve aufgestellt. Die Konzentration des in der '"I-lgE-Prnparation enthaltenen lgF.-Proteins wurde aus der Standardkurve direkt in WHD Einheiten bestimmt, wobei die '"M-Werte um die Impulse korrigiert wurden, die von dem "Ί-lsotop überlappen. Eine Standardkurve (aufgetragen in logit gegen log-Achsen) zur Bestimmung der Menge an IgE in WHO-Einheiten, wird in Fig. I dargestellt. Vor der Zugabe des WHO-IgE-Referenzserums kann die Bindungsreaktion zwischen ^i:M-radiomarkicrtem-IgE-Kaninchen-Anti-IgE als 100% angenommen werden.

Ocniäü Fi". I wären bei 50^r !nhibicrun⁰ der l?indung etwas mehr als 10' WHO-Einheiten IgE pro ml zu den Komplexen zugegeben worden.

Der oben beschriebene Doppel-Antikörper-Test ergab die folgenden Ergebnisse. Es wurde festgestellt, daß eine I-radiomarkierte IgE-Präparation 224 WHO-Einheiten IgE/ml (22,4 μ IgE 0,01 ml '} enthielt. Die von einer ^nlI-IgE-Probe emittierte Strahlung war äquivalent 450000 cpm. Die Strahlung jeder in der radiomarkierten Präparation enthaltenen IgE-Einhcit wurde zu 20000 cpm errechnet.

Es gibt alternative Methoden zur Doppel-Äntikörper-Methode nach Gleich zur Bestimmung der IgE-Menge in WHO-Einheiten, wie z. B. die Methode von Ceska und Lundvkist (Immunochemistry, 2 [1972], Seiten 1021-1300).

Wie nachfolgend unter (B) beschrieben, wurde Anti-IgE mit ^|:T radiomarkiert. Die von dem Anti-IgE emittierte Strahlung unterschied sich von der von '^I-radiomarkiertem IgE emittierten Strahlung. Die Identität der radioaktiven Isotope ist nicht wesentlich, solange die Radioaktivität unterscheidbar ist.

Aktivierte Substrate in Form von Scheiben bzv.. Platten wurden in Kontakt mit Anti-Human-L(leicht)-Ketten-Antikörper, wie unter (D) beschrieben, gebracht. Diese Scheiben wurden dann mit unterschiedlichen Konzentrationen an '"I-radiomarkiertem IgE etwa 3 Stunden lang bei 20° C inkubiert. Die überschüssigen Reagentien wurden entfernt und die Scheiben 4ma! mit 1 %igem Detergenz, z. B. »TWEEN«, im Handel erhältlich von Sigma Chemical, St. Louis, Missouri, in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Scheiben wurden dann 17 Stunden lang mit ^i:sI-radiomarkiertem Anti-IgE inkubiert, wobei ein Substrat gebildet wurde, welches ein dreischichtiges Festphasen-Produkt gebunden hatte.

Nach dem Waschen wurde die Radioaktivität von ¹¹¹I-IgE und ¹²⁵I-Anti-IgE gleichzeitig in einem Gammazähler bestimmt. Die Menge an IgE-Protein in dem ^l31I-radiomarkiertem IgE, direkt ausgedrückt in WHO-IgE-Einheiten, im Verhältnis zur ^13!I-Radioaktivität wurde zuvor bestimmt. Die ¹²⁵I-Anti-IgE-Impulse, korrigiert um ein Überlappen von '³¹I-Impulsen, wurden die IgE-Einheiten, die an den Scheiben gebunden waren, wie aus den ¹³¹I-Impulsen bestimmt, aufgetragen. Dies ergab die in Fig. 2 gezeigte Kalibrierumskurve. durch die das an die aktivierte Scheibe gebundene IgE in Beziehung zur anschließenden Bindung von radiomarkiertem Anti-IgE

gebracht werden kann. Somit ist das Verhältnis /wischen der durch radiomarkiertes Anti-IgE emittierten Strahlungsmengc,der an das radiomarkiertu Anti-IgE gebundene IgE-Proteinmenge und der Menge an IgE-Protein in WHO-Einheiten bekannt. Das radiomarkierte Anti-IgE wird in WHO-Einheiten standardisiert, da clas wirkliche Gewicht eines Liganden (z. B. IgE) aus der Menge des an diesen gebundenen markierten Bestandteils bestimmt werden kann.

Das standardisierte, radiomarkierte AnIi-IgE kann in den verschiedenen Modifikationen von spezifischen Bindungstest-Verfahren, wie sie eingangs beschrieben wurden, verwendet werden, um die Menge a-i IgE, die an ein aktiviertes Substrat gebunden ist, zu bestimmen, ungeachtet der verwendeten markierten Substanz.

Herstellung von Materialien zum Standardisieren von radiomarkiertem Anti-IgE

(A) Rauioiiiaikiciic* igE

Gereinigtes IgE (welches weniger als 0,(S% IgG enthielt) wurde mittels Ionenaustausch- und Gelchromatografie aus IgE-Myloma-Serum hergestellt. Das IgE wurde mit Na¹¹¹I radiomarkiert.

Die Radiomarkierung wurde durchgeführt, indem etwa 0,025 ml 0,5M Phosphatpuffer (pH = 7,5) zu K) μΙ Na¹¹¹I in einem Glasfläschchen zugegeben wurden. Unmittelbar darauf wurden 5 μg IgE in 0,025 ml t),05M Phosphatpuffer und 100 μg frisches Natriump-toluolsulfochloramin, welches als Chloramin T erhältlich ist, in 0,025 ml 0,05 M Phosphatpuffer zugegeben. Nach jeder Zugabe wurde der Inhalt des Glasfläschchens vermischt. Sofort nach Zugabe von Toluolsulfochloramin wurde 0,1 ml Natriummetabisulfit-Lösung (2.4 g/ml) in 0,05 M Phosphatpuffer zugegeben, um eine spätere Jodicrung zu vermeiden. Die nicht-umgesetzten Reagentien wurden durch Leiten über Ionenaustauschharz entfernt. Der markierte IgE-Peak wurde gesammelt und mit 5%igem Humanserumalbumin in Phosphatpufferphys.-Kochsalz-Lösung (PBS) auf 5 ml eingestellt und bei 20° C gelagert (Biochcm. J. S'J [l^l>63], Seiten 114-123).

(B) Radiomarkiertes Anti-IgE
Schaf-Anti-Human-IgE wurde durch Isolierung

des 7S-Peaks über eine G2()0-Chromatografiesäule gereinigt. Das spezifische Anti-IgE wurde mit Glyzerin/HCl-Puffer (pH = 2,6) eluiert.

Ein Anteil von K) με dieser Anti-IgE-Präparation wurde mit 1 mCi Na¹^I radiomarkiert.

Die Markierung erfolgte nach folgender Methode.

Das Markierungsverfahren wurde bei 4° C durchgeführt, wobei in einem Eisbad vorgekühlte Reagentien verwendet wurden. Ein Anteil von 100 μ% gereinigtem Schaf-Anti-IgE in 100 μΙ 0,1 M Phosphatpuffer (pH = 7,0) wurde in Glasfläschchen gegeben und dazu 1 mCi Na¹²⁵I zugegeben, worauf unmittelbar 50 μg Chloramin-T in 50 μΐ 0,1 M Phosphatpuffer (pH = 7,0) zugefügt wurden. Der Inhalt des Glasfläschchens wurde vermischt und die Reaktion 30 Minuten lang bei 4° C fortgesetzt, wobei zwischendurch wieder vermischt wurde. Das Jodierungsgemisch wurde durch Zugabe von 20 μg Natriummetabisulfit in 5 μΙ 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) neutralisiert. Der Inhalt des Glasfläschchens wurde vermischt und das Reaktionsgemisch weitere 5 Minuten bei 4^c C stehen gelassen. 5 μΐ einer 5%igen Rinderserumalbumin (BSA)-Lösung wurde zugegeben und der Inhalt des Glasfläschchens auf eine lonenaustausehharz-Säule aufgetragen, wodurch die nicht-umgesetzten Reagentien abgetrennt wurden. Der radiomarkierte Protein-Peak wurde gesammelt und mit 5%· (BSA) in einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (PBS) auf 5 ml eingestellt und bei - 20" C gelagert.

Vor der jeweiligen Verwendung wurde die AntilgE^:.-Präparation in PBS, das 20% normales Schaf-

Hi serum, 0,2% Rinderserumalbumin und I % Detergenz enthielt, verdünnt, um eine Arbeitslösiing zu erhalten, die K)'' Impulse pro Minute/ml ergab.

(C) Aktiviertes Substrat

Papierscheiben (5 mm Durchmesser) wurden ;ms ι λ Filterpapier ausgestanzt und mit Cyanogenbromid wie folgt aktiviert.

Geeignetes Filterpapier ist z. B. Whatman Nr. 54. Die Substrate, die hier als «Seheiben« bezeichnet

:ii Wasser eingetaucht und eine wäßrige 5%;ige BrCN-Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde in ein Wasserbad mit einer Temperatur von etwa 20° C gegeben und ca. 5 Min. lang gerührt. Während des Rührens wurde der pH im Bereich von 10,5 bis I 1,0 gehalten, indem tropfenweise 2M NaOH zugegeben wurde. Das Gemisch wurde dann in etwa 2 I 0,005M NaHCO,-I.ösungvon 4° C gegossen und weiter vermischt. Der Überstand wurde dekantiert und die Scheiben wiederholt mit 0.005M NaHCO, von 4° C und dann mit

κι 500-ml-Anteilen Aceton (4° C) gewaschen, an der Luft getrocknet und bei — 20° C gelagert.

(D) Anti-Human-L(leicht)-Ketten-Antikörper, die an ein aktiviertes Substrat gekoppelt sind.

Antikörper bestehen aus Peptidketteii, die als

<5 L(lcicht)-Ketten und H(sehwer)-Ketten bezeichnet werden. Die leichten Ketten besitzen ein Molekulargewicht von etwa 20000; die schweren Ketten haben ein Molekulargewicht von etwa 50000. Obwohl die leichteren Ketten von gereinigten Antikörpern weit-

4Ii gehend heterogen sind, sind die leichten Ketten der Myclomaproteine (lymphoider 'Tumor i-n menschlichen Knochenmark) homogen. Patienten, die an Myeloma leiden, scheiden ein einheitliches, homogenes Protein, das als Bence-Jones-Protein bezeichnet wird und welches aus homogenen leichten Ketten besteht, aus.

Anti-Human-L-Ketten-Antikörper werden hergestellt und, wie nachfolgend beschrieben, an die aktivierten Substrate gemäß (C) gekoppelt. Antikörper, die spezifisch auf das Bcnce-Jones-Protein sind, sind als eine Immunoglobulinfraktion von Kaninchen-Antiseren erhältlich. Anti-Human-L-Ketten-Antikörper wurden an die gemäß (C) aktivierten Substrate gekoppelt, indem die Antikörper mit den Substraten

etwa 1 Stunde lang bei etwa 5° C inkubiert wurden. Die nicht-umgesetzten Gruppen wurden mit (1-Äthanolamin-Lösung blockiert, indem etwa 1 ml ß-Äthanolamin-Lösung (0,05M in 0,1 M NaHCO,) zugegeben wurde. Das Gemisch wurde in einem

m> mechanischen Schüttler (100 Upm) 3 Stunden lang geschüttelt. Die Lösung wurde entfernt und die Scheiben nacheinander mit einer 2,5 ml-Portion 0,1 M NaHCO₃, drei 2,5-ml-Port ionen 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,0) und drei 7,5-mI-Portionen PBS gewaschen.

h5 Die Anti-L-Ketten-Scheiben wurden unmittelbar nach ihrer Herstellung verwendet.

(E) WHO-IgE-Referenzserum

Das Serum ist von der World Health Organization

erhältlich. Das hier verwendete Referenzserum wurde als IgE (69/34I) bezeichnet und enthielt W)OOO WHO-Rin'i'citen (U) pro ml.

Spezifisches Bindungstcstverfahren

Herstellung von Materialien:

(F) Aiitigen-(Allergcn)-Extrakte
Allcrgenextrakte aus zwei Chargen Dactylis glo-

merata-Pollcn (Cocksfoot/Orchard) (F/75 und M/7f>) wurden als gefriergetrocknete Präparationen bei - 20° C gelagert.

(G) Substrat-Antigen

Der Blutenstaub- bzw. Pollen-Extrakt M/76 nach

(F) wurde wie folgt in das in (C) aktivierte Substrat gekoppelt.

4 g gefriergetrockneter Blütenstaub-Extrakt wurde in 1 I phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (pH 7,2) eingebracht. Der Allergenextrakt wiinlt* wit¹ fnlut iin (lir nkiiviprttMi Panirrsrhi'ihiMi ot»- hiindcn. Etwi. H)O g aktivierte Papierscheiben (etwa 50000 Sch».!.hen) wurden mit 4 g rekoiistituiertem Pollen-Extrakt unter 20stündigem mechanischen Rühren inkubiert. Die nicht-umgesetzte Pollen-Extrakt-Lösung wurde durch Dekantieren entfernt. Die nicht-umgesetzten Gruppen wurden mit I I (),()5M /i-Äthanolamin innerhalb von 3 Stunden blcKkiert. Nach dem Blockieren wurden die Scheiben sukzessive mit I I 0,IM NaHCO,, drei I-I-Pc.rtionen von 0,IM Acetatpuffer (pH 4,2) und vier I-I-Portionen PBS gewaschen. Die gewaschenen Scheiben wurden in 0,5-g-Anteile aufgeteilt und vor dem Lagern bei — 20° C gefriergetrocknet.

(H) Atopisehe Seren

Es wurde eine Arbeitslösung des verwendeten Serums, das als IgE-Quelle dient, gewählt, welche die gewünschte IgE-Bindungbei der Bestimmung der Allergen-Wirksamkeit gewährleistet. Die Arbeitslösung wurde wie folgt bereitet.

Reihenverdünnungen von atopischen Seren wurden mit einer Reihe von aktivierten Substraten, an die ein Antigen gebunden war [hergestellt wie unter

(G) beschrieben) inkubiert. Nach dem Waschen mit einer l%igen Detergenzlösung in physiologischer Kochsalzlösung wurden die Scheiben mit verdünntem radiomarkierten Anti-IgE, welches wie im Standardisierungsverfahren beschrieben hergestellt wurde, inkubiert. Das gebildete Produkt stellte ein aktiviertes Substrat mit einem Antigen dar; IgE und radiomarkiertes Anti-IgE waren gebunden.

Es wurde eine parallele Inkubation mit Anti-L-Ketten-aktivierten Scheiben angesetzt. Es wurde nach dem beschriebenen früheren Verfahren, auf welches im fügenden eingegangen wird, gearbeitet, um eine Kalibrierungskurve zr. erhalten, in welcher die radioaktiven Impulse des radiomarkierten Anti-IgE gegen die an die Scheiben gebundenen IgE-Einheiten aufgetragen wurden, wie dies aus den radioaktiven Impulsen des radiomarkierten IgE bestimmt worden war. Die Anti-L-Ketten-aktivierten Scheiben, welche radiomarkiertes "¹I-IgE gebunden hatten [wie unter (D) beschrieben hergestellt] wurden mit radiomarkiertem Anti-IgE inkubiert. Nach dem Waschen wurde die von diesen Scheiben emittierte Strahlung in einem Gammazähler gemessen. Wie nachfolgend erläutert, wurde eine Dosis-Impuls-Kurve aufgestellt, um die Arbcitsvcrdiinnung eines jeden Scrams, das die gewünschte IgE-Bindung gewährleistete, zu ermitteln.

Es wurde eine Titration von drei Seren durchgeführt. Ein Serum bestand aus einem Pool von Seren von 30 bestimmten atopischen Patienten, die alle gegenüber Graspollen empfindlich waren. Das zweite

* und dritte Serum wurde von individuellen Patienten erhalten und mit M.D. und C.W., die beide gegen Graspollen empfindlich waren, bezeichnet.

Um in bezug auf die Inhibierung genaue Ergebnisse zu erhalten, muß die Konzentration des Patientcnse-

Hi rums (IgE-Quclle) unterhalb der Konzentration liegen, die eine Sättigung des aktivierten Substrates bewirken würde. Um die Konzentration des zu verwendenden Serums zu bestimmen, wurden verschiedene utopische Seren mit aktivierten Substraten titriert. Es

is wurde eine Kurvcnfumilic für die IgE-Bindung erhalten, wie dies in fig. 3 aufgezeigt wird. Die erforderl·- che Verdünnung wurde dadurch erhalten, daß die Konzentration bestimmt wurde, welche ein willkürlich hi'ttimiTitr« Sliinilnnlnivcaii dt'r loP.-Riiidiino e.roibt.

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:o welche als Kapazität des aktivierten Substrates bezeichnet wird (Λ). Der Wert Λ liegt im allgemeinen in der Größenordnung von 50 bis 70% der maximalen Bindung des Substrates; in der vorliegenden Erfindungwird Λ als 170 x 10 ' U (WHO-Einheiten) IgF.

's definiert, da festgestellt wurde, daß dies das optimale Niveau zur Durchführung der Versuche darstellte.

Verfahren zur Bestimmung der Allergen-Wirksamkeit (Fig. 5)

tu Die Bestimmung der Wirksamkeit des Dactylisglomerata-Allergens wurde, wie nachfolgend beschrieben, durchgeführt. Die Aliergenextrakte von (F) wurden in I ml Inkubationspuffer (I % BSA) \^r>< Detergenz in PBS rekonstituiert und in diesem Puffer

.ι* eine Reihe von Verdünnungen hergestellt. Ein 100 μΙ-Anteil des verdünnten Extraktes v.urde mit 0,1 ml atopischem Serum 2 Stunden lang bei 20° C in flachen Schalen inkubiert. Die atopischen Seren wurden wie im vorangehenden beschriebenen ver-

4(i dünnt, so daß die Serumkonzentration unterhalb der für die Sättigung der aktivierten Scheiben erforderlichen Konzentration lag. Ein Subsüat-Antigen (Scheibe) wie dies in (G) hergestellt worden war, wurde zu dem Serum- Allergen-Reaktionsgem,::;h ge-

■15 geben und mit de. misch weitere 3 Stunden lang

inkubiert. Die flüssig ., Reagentien wurden abgesaugt und das Substrat-Antigen-IgE-Produkt mit vier I-ml-Portionen einer l%igen Detergenz-Salin-Lösung gewaschen. Das standardisierte radiomarkiertt

5ii Anti-IgE wurde dann zu dem Substrat-Antigen-lgE-Produkt unter Bildung eines dreischichtigen Festphasen-Produktes zugegeben. Die von dem radiomarkierten Anti-IgE emittierte Strahlung wurde bestimmt und die entsprechenden Impulse auf das Gewicht der IgE-Bindung an das Anti-IgE unter Bezugnahme auf die Kalibrierungskurve in Fig. 2 umgerechnet.

Aktivierte Substrate wurden mit Anti-L-Ketten-Antikörpern, wie in (D) beschrieben, inkubiert. Die Scheiben wurden dann mit variierenden Konzentra-

wi tionen an radiomarkiertem IgE 3 Stunden lang bei 20° Cinkubiert. Die überschüssigen Reagentien wurden entfernt und die Scheiben 4 Stunden lang mit einer l%igen Detergenzlösung in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die Scheiben wurden dann

fts etwa 17 Stunden lang mit radiomarkiertem Anti-IgE [hergestellt wie in (B) beschrieben], inkubiert.

Wie im vorangehenden beschrieben, wurde aus der Bestimmung des radiomarkierten IgE, in Korrelation

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mit dem WHO-IgE-Referenzserum, eine Standardkurve konstruiert (Fig. 1). Diese Kurve dient dazu, die Konzentration des in dem radiomarkierten IgE vorliegenden IgE zu berechnen. Ausgehend von einer bekannten Konzentration an radiomarkiertem IgE wurde dann die exakte Menge der IgE-Bindung an Anti-L-Ketten-Scheiben aus der emittierten Strahlung berechnet. Da die Menge an gebundenem IgE bekannt ist, können die ^IMI-ImpuLse des radiomarkierten Anti-IgE, welches durch nachfolgende Inkubation mit radiomarkiertem Anti-IgE gebunden wurde, mit der exakten Menge an vorliegendem radiomarkiertem IgE korreliert werden und es kann eine Kalibrierungskurve aufgestellt werden (Fig. 2).

Wie im vorhergehenden zum RAST-Verfahren beschrieben und erläutert, bedeutet in den spezifischen Bindun^test-Inhibierungstest-Verfahren, daß, wenn die Menge an löslichem Antigen, das zu einem Festphasen-aktivierten Substrat-Antigen-IgE-Komplex zugegeben wird, zunimmt, das Gewicht der IgE-Mo- !ekiile, welche an das Festphasen-Antigen gebunden sind, abnimmt, und die prozentuale Bindung von Anti-IgE an Festphasen-Antigen (über das IgE) abnimmt. Allergenextrakte können dann hinsichtlich ihrer relativen Wirksamkeit vsrglichen werden, indem man die Menge des für eine 50%ige Inhibierung erforderlichen Extraktes ermittelt und miteinander vergleicht.

In der beschriebenen Methode wird die Scheiben kapazität für die IgE-Bindung mit A bezeichnet, die gebundenen IgE-MoleküIe werden mit b bezeichnet, bei einer beliebigen gegebenen Allergenkonzentration, das Gewicht des IgE, das keine Bindung eingehen konnte, wird daher mit dem Ausdruck Δ -b angegeben. Bei bestimmten Allergenkonzentrationen ist die IgE-Bindung an die Scheibe in Gegenwart des Allergenextraktes vollständig inhibiert. Fig. 4 zeigt, daß mit lEunehmender Menge an zugegebenem Allergenextrakt die IgE-Menge, die keine Bindung eingeht (A-b) ebenfalls zunimmt.

Fig. 4 zeigt, daß die maximale Antikörper-Menge, die von einer Bindung ausgeschlossen ist, durch zunehmende Mengen an zugegebenem Allergenextrakt, in der Nähe von 170 X 10~³ U IgE liegt. Die Titration eines bestimmten Serums unter Verwendung des standardisierten markierten Anti-IgE erlaubt es daher, die Allergen-Wirksamkeit in Form einer Bindungsinhibierung als IgE-Standardeinheiten, z. B. als U IgE, auszudrücken.

Hierzu S Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente, welche in einem s spezifischen Bindungstest-Verfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen Liganden-Refcrenzstandard, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) Inkubieren von Festphasen-Substraten, an m weiche Anti-L(leicht)-Ketten-Antikörper gebunden sind, mit variierenden Konzentrationen eines markierten Ligander., dessen Markierung von derjenigen der zu standardisierenden markierten Bindungskomponente ι i verschieden ist, wobei die Menge des im markierten Liganden vorliegenden Ligandcnproteins einer bekannten Menge des Liganden-Referenzstandards äquivalent ist;

b) Inkubieren der im Schritt a) gebildeten Fest-Phasen-Produkte mit der markierten Bindungskomponente, wodurch die markierte Bindungskomponente an den markierten Liganden gebunden wird;

c) Messen der im Schritt b) gebildeten Produkte und Bestimmung der Menge des markierten Liganden und der markierten Bindungskomponente.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Markic- _ni rungssubstanzen Radioisotope, freie Radikale, fluoresziet'-nde Moieküle, lumincszicrcndc Moleküle, Bakteriophagen, EriTyme, Coenzyme und/ oder Enzyminhibitoren darstellen.

3. Verfahren nach Ansprachen I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß markiertes Anti-Ig gegen Ig-Referenzserum standardisiert wird.

4. Verwendung einer gemäß Anspruch I standardisierten markierten Bindungskomponente in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren, wcl- jii chesdic Bindung einer markierten Bindungskomponente an einen Liganden umfaßt, welcher seinerseits an ein Festphasen-Substrat gebunden wird.

5. Verwendung einer gemäß Ansprüchen 1 bis 3 standardisierten markierten Bindungskomponente in einem spezifischen Bindungstest-Inhibitions-Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Allergencxtraktcs, welches die Bindung von IgE und einem markierten Bestandteil umfaßt.