DE2953610T1

DE2953610T1 - Double tagged immunoassay

Info

Publication number: DE2953610T1
Application number: DE792953610T
Authority: DE
Inventors: E Maggio; J Chen; D Rehbinder
Original assignee: INTERNAT DIAGNOSTIC TECHNOLOGY
Current assignee: INTERNAT DIAGNOSTIC TECHNOLOGY
Priority date: 1979-03-19
Filing date: 1979-03-19
Publication date: 1981-04-23
Also published as: WO1980002076A1; SE448260B; DE2953610C1; EP0026176B1; CA1137410A; SE8007978L; EP0026176A4; GB2057685B; EP0026176A1; GB2057685A; JPS55126856A

Description

Beschreibunq 2 9 5 3 6 1 Q

Itnmunbestimmunqsmethode mit doppelter Markierung ' Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft Verfahren, mit denen Bestandteile des menschlichen Bluts diagnostiziert v/erden, und bezieht sich innbesondere auf ein Verfahren zum Durchführen von Immunitätsbe-Stimmungen.
Technologischer Hintergrund

Es ist eine große Anzahl von Verfahren bekannt, mit denen Immunbestimmungen mit einer Vielfalt von Kennzeichnungs- oder Markierungsstoffen vorgenommen werden. Immunologisch aktive Stoffe können mit einem radioaktiven Element oder einem fluoreszierenden Bestandteil oder mit einem Bestandteil gekennzeichnet werden, der in eine Enzymreaktion eintritt. Eine Immunbestimmung kann mit einem beliebigen derartig gekennzeichnetes t£mmu£g^^{rten StOff ln einer Reihe} 'unterschiedlicher Verfahren vorgenommen werden. So kann ein Testmaterial, welches einen vermuteten Liganden enthält, analysiert werden, und eine quantitative Feststellung des Liganden erfolgen, wobei ein Komplex aus einem wie oben erwähnt markierten Liganden und einem Rezeptorliganden geschaffen und der markierende Bestandteil im Komplex gemessen wird, um die Menge des vermuteten Liganden abzuleiten. Die ImmukbeStimmung kann auf verschiedene Art und Weise erfolgen, z.B. nach der bekannten Sandwich-Methode sowie gemäß competitiver und indirekter Verfahren.

Mit den Ausdruck "Ligand" soll hier jeglicher Stoff bezeichnet werden, der durch Eiweißwechselwirkung einen Ligand-Rezeptor-Komplex bilden kann. Dabei ist der Ausdruck so weit, daß er Antigene und Antikörper ebenso einschließt wie bindende Proteine, Haptene und Hormonrezeptoren.

Bei den erfindungsgemäßen Immunbestimmungen werden mindestens drei Liganden verwendet. Diese drei Liganden werden wie folgt bezeiclinet: Zunächst gibt es den Bestimmungsliganden, für dessen Feststellung oder Messung das Bestimmungsverfahren ausgelegt iiit. Als zweites wird ein Prüf- oder Testligand benutzt, der in der erwähnten Weise gekennzeichnet oder markiert ist

1 3061 2/001 0

\xnd. in einem Komplex quantitativ bestimmt wird, um die Menge eines vorhandenen Bestimmungeliganden abzuleiten. /Ils dritte s gibt es den Rezeptorliganden, der sich immunologisch an den Bestimmungsliganden und/oder den Testliganden bin Let.

Bei der oben erwähnten Sandwich-Methode bindet sich der Besi Lmmungsligand an einen immobilisierten Rezeptorliganden zur Schaffung eines ersten Komplexes. Dann wird der markierte Testligand an den Bestimmungsliganden im Komplex gebunden, υ^ι die Sandwich-Struktur zu bilden (der Testligand kann mit deir_; Rezeptorliganden identisch sein und ist es häufig auch), und dann wird der markierende Bestandteil in den schichtartig verbundenen Liganden quantitativ festgestellt, um die; Menge des vorhandenen Bestimmungsliganden abzuleiten. Die Feststellung kann durch Messen der Radioaktivität erfolgen, wenn der Testbestandteil radioaktiv ist, oder durch Messen des fluoreszierenden Lichtes, wenn es sich um einen fluoreszierenden Bestandteil am Testliganden handelt, oder durch ein spektrophotometcisches Verfahren, wenn sich die optische Dichte oder Wellenlänge aufgrund einer Enzymreaktion oder durch Fluoreszenzunterdrückung ändert. Für""die genannte Feststellung kann es erforderlich sein, die schichtartig gebundenen Liganden von nichtgebundenen Liganden zu separieren. Dies erfolgt im allgemeinen durch Trennen des auf einer Oberfläche abgestützten Rezeptorliganden von einer Lösung, die nichtgebundene Testliganden enthält.

Die Menge des Bestimmungsliganden wird aus der festgestellten Menge des Testliganden abgeleitet, da bei der genannten Sandwich-Methode die beiden Mengen insgesamt direkt proportional zueinander sind. Für Eichungszwecke werden parallele Tests jeweils gegen einen bekannten Standard durchgeführt.

Bei der erwähnten kompetitiven Methode kann die Menge des Bestimmungsliganden als umgekehrter Proportionalwert festgestellt werden, wenn der Bestimmungsligand entweder gleichzeitig oder nacheinander mit einer bekannten Menge Testligand und einer Begrenzungsmenge des Rezeptors kontaktiert wird. Wenn sich Rezeptorligand und Testligand immunologisch binden, ist die festge-

130612/001 0

stellte Menge des Testliganden in einem binären Komplex mit dem Rezeptor umgekehrt proportional zur vorhandenen Menge des Bestiramungsliganden.

Bei der indirekten Methode bindet sich eine Begrenzungsmenge de& Testliganden immunologisch entweder an den Bestimmungsligandeu oder an den Rezeptorliganden. Die Menge des Testliganden in binären Komplexen aus Test- und Rezeptorliganden wird als umgekehrtes Maß der vorhandenen Menge des Bestimmungsliganden in einem Gleichgewichtsgemisch aus den drei Liganden genommen.

Die oten genannten drei Methoden lassen sich wie folgt darstellen, v/obei mit R der Rezeptorligand, mit A der Bestimmungsligand und mit T der Testligand gekennzeichnet ist.

1 . R + A -* RA

2. RA + T —#■ RAT Sandwich

1.	R +	A +	T	_^	RA + RT	gleichzeitig	.).
1 . 2.	R + RA	A - + T ■	—■? -?	RA RA	.+ RT	nacheinander	' kompetitiv
1. 2.	A. + AT	T - + R -	—?	AT AT	+ RT	nacheinander	' indirekt
1.	A +	T +	R ■	— _?	AT + RT	gleichzeitig	>

Bei den bevorzugten immunbestimmungsverfahren gemäß der Erfindung sind die Testliganden fluoreszierende Stoffe, und der Rezeptorligand ist an eine Oberfläche gebunden, auf der sich infolge der Wechselwirkung der verschiedenen Liganden eine Menge des Testliganden angesammelt hat. Die immunologisch gemeinsam an die Oberfläche gebundenen Rezeptor- und Testliganden werden einer Pluoreszenzmessung unterworfen. Bei diesen bevorzugten Verfahren wird eine Fluoreszenzmessung der Oberfläche vorgenommen, wie sie im einzelnen in folgenden US-PS beschrieben ist:

3 992 031, 3 999 948, 4 020 151, 4 025 310, 4 056 724 und

4 067 ·)59.

1 30612/00 10

Die verschiedenen oben erwähnten Immunbestimmungsr; ethoden leiden unter einer Reihe von Ungenauigkeiten, die am: Ungenauigkeiten der Menge des in einer bestimmten Verfahrensstufe vorhandenen Rezeptorliganden resultieren. Bei den an der Oberfläche eines Applikators vorgenommenen ImmunbeStimmungen mittels Pluoreszenzmessung können z.B. Ungenauigkeiten in den endgültigen Testergebnissen auftreten, wenn die Menge des ursprünglich an die Testoberfläche gebundenen Rezeptorliganden schwankt. Ähnlich können auch dann Ungenauigkeiten auftreten, wenn im Verlauf des Transportes oder während der Immunbestimmung selbst eine gewisse Menge des Rezeptorliganden von der Testoberfläc e verlorengeht.
Offenbarung der Erfindung

Gemäß der Erfindung wird eine hervorragende Verbesserung bei ImmunbeStimmungsmethoden nicht nur in der Güteregelung sondern auch in der Genauigkeit und Bequemlichkeit des Verfahrens erzielt, denn es wird ein markierender Bestandteil an den Rezeptorliganden gebunden, welcher-vom markierenden Bestandteil des Testliganden unabhängig bleibt und bei der Immunbestimmung unabhängig vom markierenden Bestandteil des Testliganden festgestellt werden kann. ,

Durch das direkte Markieren oder Kennzeichnen des Rezeptorliganden auf diese Weise kann der Rezeptorligand unmittelbar festgestellt und gemessen werden, ohne das normale Immunbest:.mmungsverfahren zu stören. Das hat folgende Vorteile:

1. Der markierende Bestandteil am Rezeptorliganden kann als Qualitätskontrolle benutzt werden, um sicherzustellen, daß eine kontrollierte Menge des Liganden bei der ursprünglichen Herstellung von Reaktionsteilnehmern für das Bestimmungsverfahre^n an eine Testoberfläche gebunden wurde.

2. Es können im Labor eines Kunden Tests vorgenommen werden, mit denen der markierende Bestandteil am Rezeptorliganden festgestellt wird, um sicherzustellen, daß während des Transportes keine Reaktionsteilnehmer beschädigt wurden, und um ein Instrument zum Feststellen des Testliganden zu eichen.

1 30612/001 0

3. Schließlich kann, was möglicherweise am wichtigsten ist, der Rezeptorligand während des ImraunbeStimmungsverfahrens unabhängig von der quantitativen Peststellung des Testliganden quantitativ bestimmt werden, so daß die erfindungsgemäßen Immunbestimmungsverfahren selbsteichend gemacht werden können.

Das Poststellen und Messen der Menge des am iiezeptorliganden vorhandenen markierenden Bestandteils kann auf verschiedene bekannte Weise mit bekannten Einrichtungen erfolgen, da schon früher radioaktive und fluoreszierende Markierungsstoffe benutzt worden sind. Beim Auslegen des jeweiligen Tests, wenn der Rezeptorligand vor der Inkubation des Rezeptorliganden mit anderen Liganden festgestellt werden soll, sollte jedoch ein markierender Bestandteil am Rezeptorliganden benutzt werden, der den chemischen Ablauf beim anschließenden Be:3timmungsverfahren nicht stört. Wenn also ein Rezeptorligand aus Gründen der Qualitätskontrolle oder zum Eichen eines Instruments vor der Inkubation benutzt werden soll, kann es sich als unpraktisch erweisen, den Rezeptorliganden mit einem Enzym als Markierungsstoff zu kennzeichnen. ■

Es körnen unterschiedliche Paare markierender Bestandteile am Rezeptorliganden und am Testliganden in einem bestimmten Verfahren verwendet werden, bei dem die beiden markierenden Bestandteile unabhängig voneinander sind und unabhängig voneinander festgestellt werden können. Einer der beiden Liganden kann also z.B. mit einem fluoreszierenden Bestandteil markiert sein, währen! der andere Ligand mit einem Radioisotop oder einem Enzym markiert wird. Einer der Liganden kann auch mit einem Enzym und der andere entweder mit einem Radioisotop oder einem fluoreszierenden Stoff markiert sein, und es kann einer der Liganden mit einem radioaktiven und der andere mit einem fluoreszierenden Stoff oder mit einem Enzym markiert sein. Wenn geeignete Einrichtungen zur Verfügung stehen, können auch andere markierende 3estandteile benutzt werden, die Strahlung von bestimmter Wellenlänge aussenden oder absorbieren.

13061 2/001 0

295361t;

Außerdem können Rezeptor- und Testliganden mit ähnlichen Art in markierender Bestandteile gekennzeichnet sein, die unabhängig voneinander feststellbar sind. Einer der beiden Liganden kam z.B. mit Jod 125 und der andere mit Kobalt 57 markiert sein. Ferner kann einer der Liganden mit einem fluoreszierenden Bestandteil, z.B. Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und der ande ;e Ligand mit einem getrennten fluoreszierenden Bestandteil, v/i ; Tetraäthylrhodaminisothiocyanat (RITC) oder Tetramethylrhoda minisothiocyanat (TRITO) markiert sein, wobei die beiden fluoreszierenden Bestandteile so gewählt sind, daß -ihr3 Fluoreszenz unterschiedliche Wellenlängen hat, so daß sie getrennt feststellbar sind.

Erfindungsgemäß wird bevorzugt, zwei fluoreszierende Bestandteile zu verwenden, nämlich Fluoreszein- und Tetramethylrhodaminisothiocyanat, da der Test unter Verwendung dieser beiden fluoreszierenden Bestandteile in einem auf dem Markt erhältlichen, sehr empfindlichen Fluorometer vorgenommen werden kann, wozu lediglich unterschiedliche Filteranordnungen zum Erregen und Feststellen der unterschiedlichen Wellenlängen der Probe in cas Fluorometerg-erät eingesetzt werden.

Die Benutzung von zweifach markierten Liganden gemäß der Erfindung kann für die vielfältigsten Immunbestimmungsmethoden mil einer Vielfalt unterschiedlicher Rezeptor- und Testliganden vorteilhaft sein, die dazu dienen, die unterschiedlichsten Antigene, Antikörper oder Haptene als Bestimmungsliganden festzustellen.

Gemäß der Erfindung können z.B. Bestimmungen unter Verwendung folgender Rezeptor-, Test- und Bestimmungsliganden vorgenommen werden:

130612/0010

-N-

S 5 3 61 Q

markierender Bestandteil des j	Test-Lignnde»	Bestimmungs-
Receptors	Gcntamicin-FITC	Ä.-ligand *
Anti-gcntamicin- TRITG	Tobramycin-FITC	G o.ntnmycin
Anti-tobramycin- TRITC	Phunobarbital- FITC	Tobramycin
Anti-phcnobarbital- TRITC	Phenobarbital- FA	Phenobarbital
Anti -phenobarbital- TRITC	Theophyllin. -FITC	Phenobarbital
Anti-theophyllin.- TRITC	Diphenyl- hydantoin-FITC ,	Tlieophyllin
Anti-diphenyl- hydantoin-TRITC	Diphenylhydantoin- Unbelliferon ·	Üiphenylhydantoin
Anti -diphenyl- hydantoin-i'ITC	Anti-herpes-FITC	Dii'henylhydantoin
Anti-herpes-TRITC	Anti-CMV-FITC	Herpes Virus
Anti-CMV-TRITC	Anti-Säirephos- phatase-FITC	CMV
An t i~ 3äir e pho s- phat.ise-TRITC -	Säurtephosphatase- FITC	Säure phosphatase
Ant&äüre phos- phatase-TRITC	Anti-Human IgG- FITC	Säure phosphatase
Rötelnr Antigen- TRITCx	Anti-Human IgM- FITC	Human Anti^:röteln.
Röteln- Antigen- TRITC	Anti-digoxin-FITC	Human" Antipöteln-
Digoxin-TRITC	Digoxin-FITC	Digoxin
Anti-digoxiri- TRITC	Anti-human IgG- FITC	Digoxin
HEp-:¹. Cells- TRITC	Digoxin-protein- FITC	Human-Anti-nucleare Antikörper
Anti- digoxin- TRITC	Digoxin-protein- Unbelliferon.:	Digoxin
Anti-digoxin- FITC	125 I Gentamicin	Digoxin
Anti-gentaraycin- FITC	125 I G cntamjfCin	G entarntein
Anti-gentamycin- Co	G entamycin-ß-D- galactosidase	G entamyein
Anti-gentamycin- FITC	Gentamycin-FITC	G entamyein
Anti-gentamycin- Evansblau	Gentnmycin

130612/001

Fortsetzung»

Anti-gentamycin-FITC

29536K-

Gentamicin- Gentamicin

dansyl

Gentamy.cin-couinarin G entaroycin 120

Abkürzungsschlüssel:

PITC - Pluoreszeinisothiocyanat

CMV - Cytomegalovirus

TRITC - Tetramethylrhodaminisothiocyanat

PA - Pluoreszeinamin

Wie schon erwähnt, können erfindungsgemäß gewisse Immunbesti;r>mungsmethoden selbsteichend gestaltet werden.Wenn z.B. eine Pluoreszenzmessung durch Beleuchten einer Oberfläche und, qua.ititative Peststellung des von der Oberfläche abgegebenen f Iu )-reszierenden Lichts erfolgt, kann der optische Gewinn an. der Grenzfläche zwischen der Oberfläche und dem Pluorometer durch eine Anzahl von Paktoren beeinflußt werden. Optische Merkmale der Oberfläche selbst können diesen Gewinn beeinflussen, wenn z.B. unter der Oberfläche eine reflektierende Unte?·- schicht vorgesehen ist. Hat die Oberfläche eine reflektierende Unterschicht, dann kann_/allgemein gesagt^die Pluoreszenzemisoion der Oberfläche größer sein, weil a) das auftreffende Licht, welches durch die Oberfläche hindurchtritt, zurückgeleitet wird, um die Pluoreszenzemission zu verstärken und b). weil die anfangs iⁿ die Oberfläche gerichtete Pluoreszenzemission herausreflektiert werden kann. In ähnlicher Weise kann der Gewinn ■

an der optischen Zwischenfläche durch Merkmale des Pluorometers, beispielsweise die Sauberkeit der Linsen, die elektronische Verstärkung oder das Alter der Komponenten und dgl. beeinflußt werden. Der optische Gewinn im System kaiin auch in Abhängigkeit von einer Anzahl von Verfahrensfaktoren schwanken, z.B. in Abhängigkeit von der Menge des ursprünglich an c.ie Oberfläche gebundenen Reagens, der Lagerungszeit des Produktes oder von Schwingungsbeschädigungen während des Transportes und dgl..

1 3061 2/0010

' 4t*

Da eine so unermeßlich große Anzahl von Faktoren den Gewinn

an der Grenzfläche zwischen dem Fluorometer und der Oberfläche; beeinflussen kann, ist es bei vielen Fluoro-ImmunbestimmungsDiethoden üblich geworden, für ein ausgedehntes Eichungsverfaliren zu sorgen, damit der Pluorometer periodisch mit standardif-.ierten Oberflächen geeicht wird. Beim bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung kann die Auswirkung von Gewinnvariationen an der Zwischenfläche zwischen der Oberfläche und dem Pluorometer durch Ausschalten dieser Variantionen ihrem Auftreten in der Messung der beiden markierenden Bestandteile ausgeglichen werden. Dies ist besonders wirksam, wenn die beider· markierenden Bestandteile nach der Inkubation gemessen werden^, und wenn die Messung mit dem gleichen Instrument vorgenommen wird.

Beste Art zur Ausführung der Erfindung Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird also ein fluoreszierender Markierungsstoff am Rezeptorliganden und ein fluoreszierender Markierungsstoff am Testliganden quantitativ festgestellt, während sie aneinander gebunden sind, wozu vorzugsweise dasse'lbe Pluorometer verwendet wird. Dabei wird die Menge des in einer unbekannten vorhandenen Bestimmungsliganden als funktion des Verhältnisses der quantitativen Messungen der beiden markierenden Bestandteile bestimmt. Soweit ein beliebiger Paktor, der die Verstärkung an der Zwischenfläche zwischen der Oberfläche und dem Pluorometer beeinflußt, bei beiden Messungen derselbe ist, hebt sich die Wirkung dieses Paktors im Verhältnis auf, so daß sich die Notwendigkeit zum Eichen für den Ausgleich dieses Faktors erübrigt.

Bei de.a nachfolgend beschriebenen beiden Beispielen wurde die kompetitive Methode für die Bestimmung angewendet. Es wurden sowohl an den Rezejptorliganden als auch an den Testliganden markierende Bestandteile benutzt, und zwar für den Rezeptorliganden Antikörper,! markiert mit Tetramethylrhodaminisothiocyanat und für den Testliganden Hapten, markiert mit Pluoreszeinisothiocyanat.

1 30612/001 0

2953-61.)

Beispiel 1

Oberflächenqualitätskontrolle und unabhängige Peststellung des Rezeptorliganden im Verlaufe eines Immunbe8timmungsverfahren wurden in einem T4-Assay gezeigt. Tetramethylrhodaminisothiocyanat-Anti-T4 wurde wie folgt zubereitet: Einer lösung aus 250 μΐ Anti-T4-IgG-Fraktion aus einer (NH^)₂ SO^-Ausfällung, 24 mg/ml:und 100 μΐ 0,1M Natriumphosphat, pH-Wert 9,72, wurd;n 5 μΐ TRITG (2,28 mg/ml in 0,1M Natriumphosphat, pK-Wert 9,72, frisch zubereitet) hinzugefügt. Das Gemisch wurde bei 4⁰C üb ;r Nacht gerührt. Das Produkt wurde mit Hilfe einer Sephadex G-5O-15O-Säule (14x1 cm) gereinigt, mit PBS, pH-Wert 7,4, eluiert, und das Eluat in 10 Tropfen-Fraktionen gesammelt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert. D _e Absorption wurde dann bei. 280 und 555 mn gemessen. Die Bestimmung von R/p erfolgte gemäß folgender Gleichung:

R/P =

^OD555 χ 12

^OI)28O χ (1-0,88 χ ^OD555)

R/p = 0,45

Dann wurde eine Verdünnung des erhaltenen TRITG-Anti-T4 mit nichtmarkiertem Anti-T4 vorgenommen bis auf R/p = 0,0084, 9,68 mg Protein/ml (gleichwertig mit einer nichtmarkierten Anti-T4-IgG-Fraktion mit dem Titer 2,5). 40 μΐ (287 μg) wurden auf TO Probennehmer getüpfelt, wie sie von der International Diagnostic Technology, Inc. unter dem Warenzeichen "StiQ' vertrieben werden. Die bei diesen Versuchen verwendeten Probennehmer haben eine Stützfläche innerhalb eines Bereichs vor.

ca. 0,283 cm aus mit Perjodat aktivierter Cellulose. Die StiQ-Probennehmer wurden getrocknet und mit NaCNBH-, reduziert. Fluoreszenzmessungen an den StiQ-Probennehmern wurden mit dem von der International Diagnostic Technology Inc. unter dem Warenzeichen ¹¹FIAX" vertriebenen Fluorometer unter Verwendung eines 540 nm Filters im Erregerkanal und eines 570 nm Filters im Emissionskanal vorgenommen. Das Rhodamin-Signal des Probennehmers wurde sowohl naß als auch trocken nach einem 20 minütigen

1 30612/001 0

' 41

Einweichen in O,O1M Borat abgelesen. Die probennehmer wurden mit 500 ul 0,01M Borat, pH-Wert 9 und FITC-T4 (7 ng T4-Hälfte mittels RIA) eine Stunde lang inkubiert. Die Ergebnisse
gehen aus der folgenden Tabelle hervor.

	156	Borat, 20 Minuten	trocken (Gewinn . 2,5)	32,03 10,6	12	Assay Signal (Gewinn
Rhodamin.- Signal	138	10)	150	144,7	12	152
eingeweicht, in	154		140	144,5	83	163
StiQ naß Nr. (Gewinn	147		155	86	138
1	188 (Gew.		138		132
2	142		189 (Gew. 1,9)		175
3	133	7,9)	150	137
4	116		126	143
5	149		115	115
6	114		147	132
7			100	114
8	unediert ediert^b
9	unediert	29,46 8,38	19,2 11,4
10 ^r	ediert	146,9	140,T"
	22	145,6	142,4
Stan ch ung	21		136 ■:
Mittel	73		156
wert	75		62
11		67
12
13
14

a - all StiQ-Probennehifterwerte eingeschlossen
b - unterstrichener Wert ausgeschlossen

130612/001 Ü

1953610

	CVs StiQ Nr-	1 - 10	t
•	Rhodamin - CV weicht^ in Borat,	's einge- 20 Minuten	Assay-CV's
1-10	naß 20%	trocken 22%	13,8%
5.8.10 fallen gelassen	5,8%	7,4%	8%

Die Aktivität von Anti-T4, welches geringfügig mit TRITC markiert war ist die gleiche wie die von nichtmarkiertem Anti-T4 (StiQ-probennehmer Nummer 11 und 12, Titer 2,5, 287 μ_δ/3^). Wenn die Antlkörper-StiQ Schiff Basisverkettung rieht durch NaCNBH₃ (StiQ-s 13 und H) reduziert wird, verringert sich das aus der Ablösung des Antikörpers von der Oberfläcl e resultierende Assay-Signal. Dies ließ sich ohne weiteres enhand des geschwächten Rhodamin-Signals erkennen.

Die zerstörungsfreie Qualitätskontrolle hat eine deutliche Wirkung auf die.Verbesserung des Variationskoeffizienten für Bestimmungen unter Verwendung von mit Perjodat oxidiertem Papier. Pur die Qualitätskontrolle konnten ohne weiteres drei außen liegende unabhängige Werte fallengelassen werden, und die Variationskoeffizienten der Bestimmung wurden von 13,896 auf 8# herabgesetzt.

Beispiel 2

Bei diesem Beispiel wurden Bestimmungen für Gentam.ycin vorgenommen. Die Konzentrationen von markierenden Bestandteilen beider Liganden wurden nach der Inkubation gemessen und die Verhältnisse der beiden Messungen bestimmt, um sie mit der Konzentration des Gentamycin-Bestimmungsliganden in Beziehung zu setzen. Es wurden Untersuchungen mit zwei Arten von StiQ-probennehmern unterschiedlicher optischer Eigenschaften durchgeführt. Die eine Art von Probennehmer hatte weißen,durchsichtigen Klebstoff zwischen der polymeren Celluloseacetat-Nitrat-Oberfläche und ein blaues Kunststoffsubstrat, während die andere Art einen schwarzen, lichtundurchlässigen Klebstoff aufwies.

130612/0010

•4*1.

Die StiQ-Probennehmer mit dem weißen Klebstoff ergraben höhere Emissionsmessungen. Die Verwendung dieser beiden Arten von StiQ-Probennehmern zeigt, wie die Bestimmung des Verhältnisses von Markierungsmessungen unterschiedlichen Gewinn an der Grenzfläche zwischen dem StiQ-Probennehmer und dem Pluorometer ausgleichen kann.

Diese Untersuchungen wurden in folgender Weise durchgeführt: Eine Gruppe von StiQ-Probennehmern wurde mit TRITC-Anti-Gentamycin betüpfelt, getrocknet und gewaschen und erneut getrocknet, h'in Satz von Probennehmern mit Bestimmungsliganden wurde bei Verwendung folgender bekannter Konzentrationen an Gentamycin zubereitet: 10, 20, 40, 80, 160 und 320 ng Gentamycin pro 500^1 Puffer, der 0,01N NaH₃PO₄ und 0,85/ NaCl mit einem pH-Wert von 7,4 enthielt. Diesen Probennehmern wurden 100 μΐ PITC-Gentamycinlösung hinzugefügt, die 66 ng Gentamycin-Hälfte gemäß RIA Bestimmung enthielt. Eine Gruppe von 10 Probennehmern wurde in jeder Konzentration des Bestimmungsliganden 30 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurde die Oberflächenfluoreszenz der Probennehmer unter Verwendung eines "FIAX"-Fluorometers gemessen, um Werte für die von Rhodamin und Fluoreszein verursachte Fluoreszenz (FSU) zu erhalten. Rhodamin wurde mit einem Filter von 540 nm für die Erregungswellenlänge und einem Filter von 570 nm für die Emissionswellenlänge gemessen. Fluoreszein wurde mit 475 nm Erregungswellenlänge und einem Filter von 540 nm für die Emissionswellenlänge gemessen. Es wurde keine Pluoreszenzunterdrückung festgestellt. Für jede der verschiedenen Konzentrationen des Bestimmungsliganden wurden folgende Bestimmungen vorgenommen: Standardabweichung, Mittelwert und Variationskoeffizient (CV), und zwar getrennt für Fluoreszein, Rhodamin und das Verhältnis von Fluoreszein zu Rhodamin auf den StiQ-Probennehmern mit dem klaren und mit dem schwarzen Klebstoff. In einer Kurve der erhaltenen Daten ist das gute gegenseitige Verhältnis und der Ausgleich für Unterschiede an der optischen Grenzfläche zwischen den StiQ-Probennehmern und dem Fluorometer erkennbar, obwohl es nötig war, beim Ablesen der StiQ-Probennehmer mit dem schwarzen Klebstoff die Verstärkung um einen Faktor von ca. 3,25 sowohl für die Fluoreszein- als auch für die Rhodamin-Slgnale zu erhöhen.

130612/0010

Γ^Ν

-yC-

Probennehmer, mit klarem Klebstoff

Proben nehmer Nr.	Genta- mycin- Konzen tration	Fluo- . reszein , Rhodamin. , Verhältnis	Stan- dard- äbwei- chung;	Durch schnitt	CV%
1-10	1 μg/ml	F	7,30	177	4,1
		R	4,29	179,86	2,4
		F/R	0,04	0,98	4,1
11-20	2 μg/ml	F	5,8	168	3,5
		R	5,25	182	2,9
		F/R .	0,033	0,92	3,6
21-30	4 μ g/ml	F	5,2-	149	3,5
		R	2,875	183	Ii 6
		F/R	0,02	0,81-	2,4
31-40	8 μ g/ml	F	5,35	134,4	3,9
		R-	4,6	189	2,4 .
		F/R	0,026	0,707	3,6
41-50	16 μg/ml	■' ■ F	2,32	121,06	i,⁹
		. ■ R ..;....	2,15	193-, 7	1,1
■■Λ · .—,.		. F/R	0,009	. 0,6T	1,4
51-60	32 μ g/ml'	F	2,72	■■" 9 8,6	2,8
		R	3,14	192,4	1,6
		F/R	0,009	9,509	1_T85
a in der.	Probe
b Ver~ star-	1,2

c kung- - 2 2

130612/0010

Erobennehmer mit schwarzem Klebstoff

Proben nehmer Nr. .	Genta- roycin- Konzen- tration	Fluo- . reszein , Rhodamin , Verhältnis	Stan- dard- abwei- c hung	Durch schnitt	CV %
1-10	1 μg/ml	F	3,29	183,4	1,8
		R	5,37	177,9	3,0
		F/R	0,02	l_;03	2,2
11-20	2 μg/ml	F	5,96	164,7	3,6
		R	6j59	170,6	3,ü
		F/R	0,032	0,96	3,3
21-30	4 pg/ml	F	11,18	146,4	7,6
		R	7_r05	166,41	4,2
		F/R	0,037	0,88	4,2
31-40	8 pg/ml	F	7,62	127,31	5,9
		R	7,57	169,4	4,4
		¹ F/R	0,02	0,75	2,8
41-50	16 μg/ml	F	3,78	121,81.	3,1
		. R	5,38	177., 08	3,0
		F/R	0,03	.0,6 OT	4,2
51-60	32 μg/ml	F	6,94	r 100,78	6,8
		R	14,28	169,3	8,4
		F/R	0,02	0,596	3,2
in der	Probe
b Ver- = c star-_ kung	A 7,1

13 0.612/001 0

Claims

Ansprüche

1.) Verfahren zum Durchführen einer Immunbestimmung, us darin besteht, daß ein erster Ligand,

der einen ersten markierenden Bestandteil enthält, mit einem zweiten Liganden, der einen zweiten markierenden Bestandteil enthält, unter Bedingungen kontaktiert wird, bei denen der erste und zweite Ligand mindestens durch eine immunologische Bindung aneinander gebunden sein können, der erste und zweite markierende Bestandteil unabhängig voneinander feststellbar ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1,
bei dem der erste und zweite

Ligand' unmittelbar miteinander immunologisch verbunden sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1,
bei dem der erste und zweite

13 0 612/0010

- yi -

Ligand immunologisch dadurch aneinander gebunden sind, daß der erste und zweite Ligand durch zwei immunologische Bindungen an einen dritten Liganden gebunden sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1,

ferner gekennzeichnet durch Einschluß der Schritte, daß der erste markierende Bestandteil quantitativ festgestellt wird, und daß der zweite markierende Bestandteil quantitativ festgestellt wird, bei dem mindestens einer dieser Bestimmungsschritte nach dem Kontaktieren des ersten und zweiten Liganden durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4,

bei dem die Immunbestimmung so durchgeführt wird, daß der erste Ligand auf einer Oberfläche abgestützt wird, daß die quantitative Bestimmung des ersten Markierungsmaterials an der Oberfläche vorgenommen wird, daß das Kontaktieren des ersten und zweiten Liganden dadurch bewirkt wird, daß die Oberfläche mit einem Volumen einer Flüssigkeit in Berührung gebracht wird, in der der zweite Ligand dispergiert ist, daß der Flüssigkeitskörper und die Oberfläche voneinander getrennt werden, und daß die quantitative Bestimmung des zweiten markierenden Materials an der Oberfläche durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1,

bei dem die Immunbestimmung mit zwei markierenden Bestandteilen durchgeführt wird, die aus fluoreszierenden Stoffen bestehen, deren Fluoreszenz unterschiedliche Wellenlängen hat.

7. Verfahren nach Anspruch 5,

bei dem die Imraunbestiraraung mit zwei markierenden Bestandteilen durchgeführt wird, die aus fluoreszierenden Stoffen bestehen, deren Fluoreszenz unterschiedliche Wellenlängen hat.

8. In einem Verfahren zum Durchführen einer Immunbestimmung, bei dem ein Rezeptorligand mit einem Testliganden kontaktiert wird.

130S12/0010

,- ;■' 9 5 3 6 1Ό

der sich immunologisch an den Rezeptorliganden bir.det, und tei dem der Rezeptor- und/oder Testligand mit einem B'. stimmungsliganden kontaktiert wird, der geeignet ist, sich iüimunologisch an den Rezeptor- und/oder Testliganden zu binden, die Verbesserung, die darin besteht, daß ein Rezeptorligand benutzt wird, der einen markierenden Bestandteil enthält, welcher vom markierenden Bestandteil am Testliganden unabhängig ist.

9.In einem Verfahren zum Durchführen einer ImmunbeStimmung ,bei der ein Rezeptorligand mit einem Testliganden kontaktiert v.drd, der sich immunologisch an den Rezeptorliganden bindet, und bei dem der Rezeptor- und/oder Testligand mit einem Bc-StimmungsIiganden kontaktiert wird, der geeignet ist, sich immunologisch an den Rezeptor- und/oder Testliganden zu binden, die Verbesserung, die darin besteht, daß ein Rezeptorligand benutzt wird, der einen· markierenden Bestandteil enthält, welcher vom markierenden Bestandteil des Testliganden unabhängig ist, und daß die Menge des Bestimmungsliganden durch Messen der Mengen markierender Bestandteile sowohl am Rezeptorliganden als auch am Testliganden gemessen wird, während der Rezeptor- und Testligand immunologisch aneinander gebunden sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9,

dadurch gekennze ichne t, daß die Messung so durchgeführt wird, daß Fluoreszenz - Licht sowohl vom Rezeptorais auch vom Testliganden mit demselben Fluorometer festgestellt wird.

130612/0010