-
Hintergrund
der Erfindung
-
Immunochromatografische
Streifen-Formate sind zunehmend populär für qualitative und halb-quantitative
Assayverfahren geworden, in denen Sicht-Nachweisschemata zur Anwendung gelangen.
Dieser Typ eines Immunoassay beinhaltet die Aufbringung einer flüssigen Testprobe,
die vermutlich einen nachzuweisenden Analyt enthält, auf die Aufbringzone eines
immunochromatografischen Teststreifens. Der Streifen ist aus einem
Matrixmaterial zusammengesetzt, durch welches das Testfluid und
der Analyt, die darin suspendiert oder aufgelöst werden, durch Kapillarwirkung
aus der Aufbringzone zu einer Einfangzone zu fließen vermögen, wo
ein nachweisbares Signal oder dessen Abwesenheit das Vorhandensein
des Analyt enthüllen
oder nicht. In typischer Weise schließt der Streifen Mittel zur
immunospezifischen Bindung des nachzuweisenden Analyt mit seinem
spezifischen Bindungspartner ein, welcher die nachweisbare Markierung
aufweist. In einem solchen Schema enthält, wie offenbart in
US 4 446 232 , der Streifen
ein markiertes Enzym, das den mobilen Bindungspartner für den Analyt
darstellt und in einer Zone stromabwärts von der Proben-Aufbringzone
vorliegt. Ist Analyt in der Testprobe vorhanden, wird er mit seinem
markierten Bindungspartner kombiniert, um einen Komplex zu bilden,
der entlang dem Streifen zu einer Nachweiszone fließt, der
ein Substrat für
die Enzym-Markierung enthält,
welches dazu befähigt
ist, eine gefärbte
Reaktion in der Gegenwart der Enzym-Markierung zu ergeben. Der Streifen
kann eine Zone enthalten, in welcher Analyt immobilisiert ist, so
dass markierter Bindungspartner, der wegen der Abwesenheit von Analyt
in der Probe dann nicht mit Analyt kombiniert wird, eingefangen
und dadurch inhibiert wird, die Nachweiszone zu erreichen. Es sind
verschiedene Modifikationen dieser technischen Verfahrensweise veröffentlicht
worden, die alle ein kompetitives spezifisches Bindungssystem beinhalten,
in welchem die An- oder Abwesenheit von Analyt in der Testprobe
durch den Nachweis oder das Fehlen von dessen markiertem Bindungspartner
in der Einfangzone bestimmt bzw. ermittelt werden.
-
Eine
Alternative zum oben beschriebenen immunometrischen Assay, welcher
den freien markierten Antikörper
nachweist, stellt das sogenannte Sandwich-Format dar, worin die
Einfangzone immobilisierte Antikörper
gegen eine Epitop des Analyt enthält, das sich von demjenigen
Epitop unterschei det, zu welchem der markierte Antikörper spezifisch
ist. In diesem Format wird ein Sandwich des Analyt zwischen den
immobilisierten und markierten Antikörpern gebildet, und dies stellt
daher einen immunometrischen Assay dar, welcher die gebundene markierte
Antikörperspezies
nachweist.
-
Nicht
alle der Schemata zur Immunochromatografie beruhen auf einem Enzym-markierten
Bindungspartner/Enzym-Substrat zur Herstellung des Signals zum Nachweis
des Analyt. In
US 4 806 311 ist
eine Multizonen-Testvorrichtung für die spezifische Bindungsassay-Bestimmung
eines Analyt und eines immobilisierten Bindungspartners dafür zusammen
mit einer Einfangzone zur Aufnahme von markiertem Reagens offenbart,
welches dorthin aus der Reagenszone wandert. Die Einfangzone enthält eine
immobilisierte Form einer Bindungssubstanz für das markierte Reagens. Das
markierte Reagens weist eine chemische Gruppe mit einer nachweisbaren
physikalischen Eigenschaft auf, welches auf der Basis seiner eigenen
physikalischen Eigenschaften nachweisbar ist, so dass dieses keiner
chemischen Reaktion mit einer weiteren Substanz bedarf. Beispiele
solcher Gruppen sind gefärbte
Spezies von Fluoreszierern, phosphoreszenten Molekülen, Radioisotopen
und elektroaktiven Resten.
-
US 4 703 017 beschreibt
die Verwendung sichtbarer teilchenförmiger Markierungen für den Rezeptor. Verschiedene
teilchenförmige
Markierungen wie Gold-Sol-Partikel und einen sichtbaren Farbstoff
enthaltende Liposome werden genannt.
-
In
WO 96/34271 ist eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Ziel-Analyt
und von Kreatinin in einer fluiden Testprobe offenbart, wobei die
Vorrichtung einen Assay-Streifen zum Nachweis von Kreatinin und
einen zweiten Assay-Streifen zum Nachweis des Ziel-Analyt aufweist.
Die Kreatinin-Konzentration
kann kolorimetrisch oder durch den spezifischen Einfang markierter
Kreatinin-Bindungspartner bestimmt werden. Die Konzentration des
Ziel-Analyt wird, bezogen auf die Kreatinin-Konzentration der Probe,
korrigiert, wobei die Korrektur entweder von Hand oder mittels eines
sauber programmierten Reflexionsanalysiergeräts durchgeführt werden kann.
-
EP 0 462 376 A2 offenbart
eine immunochromatografische Verfahrensweise, in welcher Signale
an der Einfangstelle und an der Konjugat-Gewinnungsstelle des Streifens
nachgewiesen und die Analyt-Konzentration durch die Intensität des Signals
an der Einfangstelle relativ zum Signal an der Konjugat-Gewinnungsstelle bestimmt
werden. Ebenfalls von Interesse in dieser Hinsicht ist
US 5 569 608 .
-
Immunochromatografische
Streifen-Formate ergeben ein zuverlässiges System zum Nachweis
verschiedener Analyte (seien diese Antigene oder Antikörper), sie
leiden aber an der Einschränkung,
dass sie Ergebnisse liefern, die bestenfalls nur halb-quantitativ
sind, wenn, für
einige Analyte, genauere quantitative Ergebnisse benötigt werden.
Demzufolge steht zu wünschen,
und ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zur
Quantifizierung der Ergebnisse von Analysen anzugeben und bereitzustellen,
die durch die Anwendung immunochromatografischer Streifen-Formate
durchgeführt
werden.
-
Zusammenfassung
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Bestimmung eines
Analyt in einer Probe einer Körperflüssigkeit,
wobei das Verfahren die Stufen umfasst:
- a)
Bereitstellung eines Teststreifens, der eine Matrix umfasst, durch
welche die fluide Probe durch Kapillarwirkung zu fließen vermag,
wobei der genannte Streifen einen ersten Bereich, der einen mobilen
spezifischen Bindungspartner für
den Analyt enthält,
wobei der Bindungspartner eine nachweisbare Markierung aufweist
und mit dem Analyt zur Bildung eines Komplexes aus dem Analyt/markierten
Bindungspartner zu reagieren vermag, und wobei der Streifen mindestens
einen zweiten Bereich, der immobilisierten Analyt oder einen immobilisierten
Bindungspartner enthält,
welcher für
ein Epitop des Analyt spezifisch ist, das sich von demjenigen unterscheidet,
zu welchem der markierte Bindungspartner spezifisch ist, und wobei der
Streifen mindestens einen dritten Bereich, der Mittel zum Einfangen
des Komplexes aus dem Analyt/markierten spezifischen Bindungspartner
enthält,
welcher nicht im zweiten Bereich gebunden wird, und einen vierten
Bereich aufweist, der Mittel zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals
enthält,
dessen Intensität
dem Spiegel eines zweiten Analyt entspricht, dessen Konzentration
in klinischem Bezug zu derjenigen des Analyt steht, dessen Konzentration
in der Körperflüssigkeit
bestimmt wird;
- b) Entwicklung der Matrix, wobei die Probe der Körperflüssigkeit,
die den vermuteten ersten Analyt und den zweiten Analyt dafür enthält, aufgebracht
wird, um dadurch die Probe in Kontakt mit dem markierten spezifischen
Bindungspartner so gelangen zu lassen, dass der in der fluiden Probe
vorhandene Analyt an den markierten spezifischen Bindungspartner
gebunden wird, um einen Komplex zu bilden, während überschüssiger, unreagierter markierter
Bindungspartner frei zur Weiterreaktion zurückbleibt, wobei die fluide Probe
den Komplex aus dem Analyt/markierten Partner und den unrea gierten
markierten Bindungspartner entlang der Matrix durch Kapillarwirkung
zum zweiten Bereich trägt,
der den immobilisierten Analyt enthält, in welchem Bereich der
unreagierte markierte Bindungspartner an den immobilisierten Analyt
in umgekehrter Beziehung zur Konzentration des ersten Analyt in
der fluiden Testprobe oder an den immobilisierten spezifischen Bindungspartner
in direkter Beziehung zur Analyt-Konzentration in der fluiden Testprobe
gebunden wird, und wobei der markierte spezifische Bindungspartner,
der nicht an den zweiten Bereich gebunden wird, durch Kapillarwirkung
zum dritten Bereich getragen wird, wo er durch die Einfangmittel
eingefangen wird;
- c) Ablesung der zweiten Zone der entwickelten Matrix an einem
Gerät,
das einen Detektor mit der Befähigung
zur Messung des Signals aus der nachweisbaren Markierung zur Bestimmung
der Konzentration des markierten Bindungspartners in der zweiten
Zone aufweist, und Ablesung der dritten Zone des entwickelten Streifens
in ähnlicher
Weise zur Bestimmung des Signals aus dem markierten Bindungspartner
in der dritten Zone der Matrix;
- d) Bestimmung des endgültigen
Reaktionssignals durch Bildung der Verhältnisse der Signale aus dem
markierten Bindungspartner, der im zweiten Bereich immobilisiert
wurde, und aus dem markierten Bindungspartner, der im dritten Bereich
eingefangen wurde;
- e) Bestimmung der Konzentration des ersten Analyt in der fluiden
Probe durch Vergleich des in Stufe d) bestimmten endgültigen Reaktionssignals
mit endgültigen
Reaktionssignalen, die in ähnlicher
Weise für
fluide Proben ermittelt werden, die bekannte Konzentrationen des
ersten Analyt enthalten; und
- f) Korrektur der Konzentration des in Stufe e) bestimmten ersten
Analyt durch Bestimmung der Konzentration des zweiten Analyt in
der fluiden Testprobe durch Messung der Intensität des Signals im vierten Bereich der
Matrix und durch deren Umrechnung in den Konzentrationswert des
zweiten Analyt und dann durch Bestimmung des Verhältnisses
des zweiten Analyt zum ersten Analyt, dessen quantitative Konzentration
gesucht wird.
-
Beschreibung der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung wird zuerst durch Bereitstellung der Testmatrix
durchgeführt,
durch welche die fluide Testprobe durch Kapillarwirkung zu fließen vermag.
In typischer Weise liegt die Matrix in der Form eines Streifens
vor, durch welchen das Testfluid horizontal fließt. Während die Matrix auch in einem
geschichteten Format zusammengebaut sein könnte, durch welches das Testfluid
vertikal von oben nach unten oder umgekehrt fließen könnte, ist die folgende Diskussion
gezielt auf das bevorzugte Streifen-Format gerichtet.
-
Der
Streifen kann aus einem Matrixmaterial hergestellt sein, durch welches
das Testfluid und ein darin enthaltener Analyt durch Kapillarwirkung
zu fließen
vermögen,
und er kann aus einem Material gefertigt sein, das die Befähigung aufweist,
einen nicht-saugfähigen
seitlichen Fluss zu unterstützen.
Dieser Typ eines Fließens
ist in
US 4 943 522 als
Flüssigkeitsfluss
beschrieben, in welchem alle der gelösten oder dispergierten Komponenten
der Flüssigkeit
durch die Matrix im wesentlichen mit gleichen Geschwindigkeiten
und mit relativ unbeeinträchtigtem
Fluss getragen werden, im Gegensatz zu einem vorrangigen Zurückhalten
einer oder mehrerer Komponenten, wie dies der Fall sein würde, falls
das Matrixmaterial befähigt
wäre, eine
oder mehrere der Komponenten zu absorbieren oder aufzusaugen. Ein
Beispiel eines solchen Matrixmaterials ist das Blattmaterial aus
Polyethylen hoher Dichte oder mit ultrahohem Molekulargewicht von
Porex Technologies. Gleichermaßen
geeignet zur Verwendung als Matrix, aus welcher die chromatografischen
Streifen gefertigt werden können,
sind saugfähige
Materialien, wie Papier, Nitrocellulose und Nylon.
-
Verschiedene
immunochromatografische Streifen-Formate eignen sich zur Verwendung
im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Ein besonders geeignetes
Format ist das, welches in
US
4 446 232 offenbart ist, worin eine Vorrichtung zur Bestimmung
des Vorliegens von Antigenen beschrieben ist, welche einen Streifen
aus Matrixmaterial mit einer ersten Zone umfasst, worin immobilisierter
Analyt und Enzym-gebundene Antikörper
bereitgestellt sind, die spezifisch zum zu bestimmenden Analyt sind.
Die markierten Antikörper
können
zu einer zweiten Zone fließen,
wenn sie mit Analyt reagiert haben, der in die erste Zone durch die
Testprobe eingebracht wurde, sie tun dies aber nicht in Abwesenheit
von Analyt im Testfluid, weil sie im ersten Bereich durch Wechselwirkung
mit dem immobilisierten Analyt gebunden werden. Der Analyt ist in
typischer Weise ein Antigen, obwohl das Format auch entworfen werden
kann, um das Vorliegen und Vorhandensein von Antikörpern als
Analyt nachzuweisen. Modifikationen zu diesem Format sind in
US 4 868 108 offenbart.
In einer weiteren Modifikation wird das Enzym-Substrat in der Bereichsregion eines
zweiten, immobilisierten Antikörpers
bereitgestellt und angeordnet, um dadurch den Komplex einzufangen,
der zwischen den mit Enzym markierten Bindungspartner und dem Analyt
gebildet wird. Diese Sorte eines Formats wird in besonders geeigneter
Weise auf die vorliegende Erfindung angewandt, obwohl jeglicher
physikalisch nachweisba rer Signal-Erzeuger als die Markierung verwendet
werden kann, da die vorliegende Erfindung nicht auf die Wechselwirkung
eines Enzyms mit seinem Substrat zur Erstellung des nachweisbaren
Signals eingeschränkt zu
werden braucht. Somit werden, durch Immobilisierung des Konjugats
in einer diskreten Nachweiszone, die stromabwärts auf dem Streifen von der
Zone angeordnet wird, worin der markierte Bindungspartner für den Analyt
eingefangen wird, zwei Bereichregionen bereitgestellt, aus denen
die physikalisch nachweisbare Eigenschaft der Markierung zur Bestimmung
ihrer Konzentration gemessen werden kann. Durch Messung des Signals
aus der nachweisbaren Markierung im zweiten Bereich der Matrix (welcher
manchmal als Einfangzone bezeichnet wird) und des Signals aus der
physikalisch nachweisbaren Eigenschaften der Markierung im dritten Bereich
(welcher manchmal als die Nachweiszone bezeichnet wird), in welchem
ein immobilisierter Antikörper gegen
den markierten Bindungspartner (z. B. Anti-Maus-IgG, wenn der markierte
Bindungspartner ein Antikörper
ist) das Einfangmittel ist, und durch Bestimmung des Verhältnisses
dieser Signale kann die Genauigkeit des Tests für die Analyt-Konzentration gesteigert
werden. Die Genauigkeit wird gesteigert, weil diese Verfahrenstechnik
Ungenauigkeiten, die durch die Ablagerung von markiertem Konjugat
und/oder durch einen nicht-einheitlichen Fluss durch die Matrix
verursacht werden, korrigiert. Da die vorgenannten Ungenauigkeiten durch
Ablagerung von markiertem Konjugat und durch nicht-einheitlichen
Fluidfluss gewöhnlich
von nur kleiner, aber signifikanter Größe sind, stören sie, in ganz besonderer
Weise, das Bindungsgleichgewicht im wesentlichen nicht. Daher stellt
das Verhältnis
der Signale in den zwei Bindungsbereichen ein genauereres Maß der Analyt-Konzentration
als das Signal aus einem der beiden Bereiche selbst dar. Dieses
Prinzip gilt mit gleicher Aussagekraft, wenn das vorher beschriebene
Sandwich-Format angewandt wird.
-
Die
zweiten und dritten Zonen der Matrix, die in der vorliegenden Erfindung
zur Anwendung gelangen, können
jeweils in zwei oder mehr Banden aufgeteilt sein, wobei die zweite
Bereichsregion vorzugsweise 1 bis 3 diskrete Banden und die dritte
Bereichsregion 1 bis 2 Banden aufweisen. Durch Aufteilung dieser
Bereichsregionen in Banden wird es ermöglicht, den dynamischen Bereich
und/oder die Präzision
des Assay aufgrund der Nicht-Linearität der Reflexion
zur Anzahl nachgewiesener markierter Bindungspartner zu erhöhen. Die
Aufteilung der Bereichsregionen in diskrete Banden kann wünschenswert
sein, weil die Messung kleiner Änderungen
in nachgewiesenen markierten Bindungspartnern robuster bei höheren Reflexionswerten
als bei niedrigen Werten ist. Die Anzahl der Einfang- und/oder Sammelbanden,
die wünschbar
sind, hängt
vom besonderen Assay ab, für
welchen der Streifen entworfen wird, da die Aufteilung der Einfang-
und Sammelzonen in zwei oder mehr diskrete Banden den dynamischen
Bereich zwar bestimmter Assay-Verfahren,
aber nicht den von weiteren erhöht.
Der dynamische Bereich betrifft die Tatsache, dass das Gesamtsignal
gesteigert werden kann, falls man sich gezielt auf mehr als eine
einzelne Einfang- oder Nachweisbande innerhalb einer Zone richtet.
Somit kann es, wenn die nachweisbare Markierung eine ist, die durch
ein Reflexionsmessgerät
nachweisbar ist, zu einer großen
Nicht-Linearität
der Reflexion und zu dem mit dem eingesetzten Reflexionsmessgerät zusammenhängenden
Fehler kommen. Beispielsweise stellt die Differenz zwischen 70%
R und 75% R einen ziemlich kleinen Betrag an nachweisbarer Markierung
dar, wogegen die Differenz zwischen 30% R und 35% R einen hohen
Prozentsatz der nachweisbaren Markierung darstellt. Bei Anwendung
bestimmter Reflexionsmessgeräte
bleibt der Fehler bei der Reflexionsablesung konstant oder erhöht sich,
wenn der Reflexionswert abnimmt. Somit kann es von Vorteil sein,
eine oder mehrere zusätzliche
Einfang- oder Nachweisbanden einzusetzen und anzuwenden, falls dies
die Reflexionsablesung bei einem höheren Wert anordnet, wo sie
empfindlicher gegen Partikel-Konzentrationen
ist. In jenen Assayverfahren, in denen ein breiter dynamischer Bereich
nicht notwendig ist, vermögen
eine einfache Ablesung und Einteilung einer einzelnen Einfang- und
einer einzelnen Nachweisbereichsregion gute quantitative Ergebnisse
zu liefern bzw. zu erstellen. Dies wird durch das folgende Beispiel
1 veranschaulicht, in welchem Deoxypryridinolin der erste Analyt
ist und die Einfangzone in drei Banden (P1,
P2 und P3) aufgeteilt
ist, während
die Nachweiszone eine Einzelbande (P4) und
der Decode-Algorithmus für den DPB-Assay
T/Pn sind, worin T die Summierung des Signals
aus allen vier Banden ist. Algorithmen, die diese Reagensbanden-Reflexionswerte verwenden,
werden in einer solchen Weise konstruiert, dass das Signal-zu-Rausch-Verhältnis maximiert
und dadurch die Quantifizierung des Assay durch Reduzierung von
Variationskoeffizienten (CV) gesteigert werden. Der besondere Algorithmus,
der gewählt
wird, hängt
von der Anzahl der Reagensbanden auf dem besonderen Teststreifen,
der eingesetzt wird, und der Empfindlichkeit und/oder Präzision des
Assay ab. Sobald der entsprechend geeignete Algorithmus gewählt ist,
wird die Beziehung zwischen dem Algorithmuswert und der Analyt-Konzentration
ermittelt und an eine nicht-lineare
Regressionsfunktion angepasst. Der Zweck einer derartigen Anpassung
ist es, den Fehler zu minimieren, der den gewählten Algorithmuswert in Beziehung
zum Wert der Analyt-Konzentration setzt. Die Regressionsfunktion wird angewandt,
um eine Eichkurve zu erstellen, die angewandt wird, um den ermittelten
Algorithmuswert zum Wert der Analyt-Konzentration in Beziehung zu
setzen. Sobald diese Beziehung erstellt worden ist, wird die Eichkurve,
die als eine Gleichung im Reflexionsgerät gespeichert werden kann,
zur Berechnung der Analyt-Konzentration herangezogen.
-
Da
sich die Reflexion der Einfang- und Nachweiszonen umgekehrt zueinander
verändert,
d. h., je größer das
Signal aus der Einfangzone ist, um so niedriger ist das Signal aus
der Nachweiszone, wird der Einsatz mehrfacher Einfang- und/oder
Nachweisbanden geplant, um diesen Bereich der Reflexionswerte zu ändern. Der
Mechanismus, durch welchen die Analyt-Konzentration die Banden-Reflexion
verändert,
ist eine Funktion des Chemismus des besonderen Assay. Für Sandwich-Assayverfahren
steigt, bei ansteigender Analyt-Konzentration,
die Einfangbandenreflexion an, und die Nachweisbanden-Reflexionsbandenreflexion
sinkt ab. Für kompetitive
Assayverfahren sinkt die Einfangbandenreflexion ab, und die Nachweisbandenreflexion
steigt mit ansteigenden Mengen des Analyt in der fluiden Testprobe
an.
-
Die
notwendige Zufügung
weiterer Einfang- und/oder Nachweisbanden hängt davon ab, ob Änderungen
in einer zusätzlichen
Bande signifikant größer in einer
gegebenen Analyt-Vergleichsregion als in einer der weiteren Banden
sind. Abhängig
von der Markierungs-(z. B. der Gold-Sol)-Konzentration, setzen zusätzliche Einfangbanden
auch die Signaländerungen
an der Nachweiszone herab. In bestimmten Assayverfahren spiegelt
eine zweite Einfangbande ganz einfach die erste Einfangbande, aber
mit reduzierten Signalveränderungen,
und es kann in solchen Fällen
deren Notwendigkeit in Frage gestellt werden. Allerdings kann in
jenen Assayverfahren, in denen die Nachweiszone zu dunkel wegen
niedriger Reflexion ist, die Zufügung
von Einfangbanden das Signal in dieser Zone verringern.
-
Ganz
allgemein, ist es in der vorliegenden Erfindung entscheidend, einen
besonderen Algorithmus und zusätzliche
Einfang- und/oder Nachweisbanden so zu wählen, dass das Signal in solch
einer Weise geändert
und angepasst wird, dass es mit größerer Präzision durch ein Reflexionsmessgerät abgelesen
wird.
-
Es
gibt zwei Stufen, die bei der Entwicklung eines entsprechend geeigneten
Algorithmus eine Rolle spielen. Die erste beruht darauf, das Signal-zu-Rausch-Verhältnis auf
ein so hoch wie mögliches
Niveau anzuheben. Die zweite Stufe beruht darauf, einen Algorithmus
zu definieren, der ganz leicht auf eine Gleichung passt, so dass
genaue Werte für
jede Analyt-Konzentration
erhältlich
sind. Dies wird durch die folgende Untersuchung an einem Streifen
belegt, der drei Banden (zwei Einfangbanden und eine Nachweisbande)
enthält. Die
zwei Einfangbanden wiesen unterschiedliche Einfangreagens-Konzentrationen
auf, wobei die erste Einfangbande eine 10-fach niedrigere Einfangreagens-Konzentration
als die zweite aufwies. Dieses Format belegt, dass unterschiedliche
Kombinationen und Konzentrationen von Einfang- und Sammelbanden
angewandt werden können,
und zwar in Abhängigkeit
von den einzigartigen Eigenschaften eines jeden Assay. Messdaten wurden
ermittelt (darstellend N = 18 für
jeden Analyt-Spiegel) mit drei unterschiedlichen CLINITEK®-Reflexionsmessgeräten über eine
Dauer von 2 Tagen. In Tabelle 1 sind die Vorteil-(Figure of Merit
= FOM)-Differenzen zwischen DPD-Spiegeln
der verschiedenen Bandenreflexionsveränderungen unter Anwendung verschiedener Reflexionsveränderungen
unter Anwendung verschiedener Algorithmen angegeben. Der FOM ist
berechnet als (Avg1 – Avg2)/(SD1
+ SD2), worin Avg1 und Avg2 die Durchschnittsmesswerte für Analyt-Spiegel
1 und Analyt-Spiegel
2 und SD1 und SD2 die Standardabweichungen der Durchschnittswerte
für Analyt-Spiegel
1 und Analyt-Spiegel 2 sind.
-
-
In
Tabelle 1 ist Einfang 1 der IR-korrigierte Reflexionsmesswert für die Einfang
1-Bande, die Nachweisbande 1 ist der IR-korrigierte Reflexionsmesswert
für die
Einfangbande 2, Einf1/Nachw1 ist der K/S-transformierte Messwert
von Einfang 1, dividiert durch Nachweis 1, und Algor 1 ist: C/{Einfangbande 2/Σ(Einfangbanden) × ABS(2 – C)},worin
C = 100 × (1
+ Σ(Nachweisbanden/Σ(Reagensbanden)),
und
für Gesamt/Einf1
gilt: Σ(Aller
Banden)/Einfang 1,worin ABS den Absolutwert der Anzahl darstellt.
In dieser veranschaulichenden Darstellung sinkt das Leistungsvermögen der
Nachweisbande mit dem Anstieg der DPD-Konzentration ab, wogegen
größere Signalveränderungen
für die
Einfangbande festgestellt werden. Für jedweden Algorithmus ist
es das Ziel, die Reflexionswerte in solch einer Weise zu gewichten,
dass das Signal-zu-Rausch-Verhältnis in
der Bereichsregion, welche am kritischsten für den Assay ist, maximiert
wird. Dies kann durch Anwendung der FOM-Analyse bewerkstelligt werden,
und Algor 1 ist entworfen, um die Differenzen der zwei Einfangbanden
bei niedrigen Analyt-Konzentrationen höher zu gewichten, wo diese
Differenz mit jener Gewichtung der Sammelbande über die Gesamtheit bei höheren Analyt-Konzentrationen
am größten ist.
Das andere Ziel von Algor 1 ist es, diese Gewichtung in einer Weise
einzusetzen, die die Anpassung an eine allgemein gültige Vier-Parameter-Anpassung erlaubt,
die in vielen Immunoassayverfahren zur Anwendung gelangt.
-
Die
zweite Stufe der Algorithmus-Entwicklung beruht darauf, eine Gleichung
anzuwenden, die leicht angepasst werden kann und genaue Analyt-Konzentrationen für Zwischenwerte
zu ergeben vermag. Während FOM
eine gute Verfahrensweise zur Unterscheidung zwischen zwei diskreten
Analyt-Spiegeln ist, liefert dieser keine Information über die
Form der Kurve. Der beste Näherungsansatz
ist oft einer, der den Chemismus des besonderen Assay nachahmt.
Für Immunoassayverfahren
ist dieser oft eine Vier-Parameter-Anpassungsgleichung. Der Test für jede angepasste
Gleichung und den entsprechenden Algorithmus ist die Verwendung
von Zufallsproben mit verschiedenen Analyt-Konzentrationen und die
Fehlerberechnung (% CV) und Abweichung. Das Ziel ist es, den niedrigsten
Prozent-CV bei Minimalabweichung über den erwarteten Bereich
des Assay hinweg zu suchen. Ein Vergleich der DPD-Ergebnisse von
0 bis 250 nM/mM in Urin für
2 Typen von Analysen ist in den Tabellen 2 und 3 für die Drei-Banden-Immunostreifen
angegeben und dargestellt, die in dieser veranschaulichenden Darstellung
verwendet sind.
-
Tabelle
2
Algor1-Ergebnisse
-
Tabelle
3
Gesamt/P1-Ergebnisse
-
Aus
den Daten der Tabellen 2 und 3 ist ermittelbar, dass für diese
besondere Analyse der erste Algorithmus einen geringeren Fehler,
gemäß Messung
mit dem % CV, bei allen DPD-Werten aufweist. Dieses Beispiel verdeutlicht
die etwas empirische Verfahrensweise zur Findung eines korrekten
Algorithmus. Der gewählte
Algorithmus wird einer sein, welcher den geringsten Fehler in seinem
Zusammenhang für
bzw. mit einer gegebenen Streifen-Formulierung und dem entsprechenden
Format und einen gegebenen klinischen Bereich für den Analyt aufweist und ergibt.
-
Nach
Erhalt des Wertes für
den Ziel-Analyt setzt das Gerät
den Reflexionswert bei einer oder mehreren Wellenlängen der
Reagens-Unterlage für
den zweiten Analyt zur Bestimmung der Konzentration dieses Analyt
in der fluiden Testprobe ein. Im Fall, in welchem DPD der Ziel-Analyt
und Kreatinin der zweite Analyt sind, sind die Präzision (oder
die Verringerung von Signal zu Rauschen) kritisch für den Assay
für beide
Analyte. Ohne ein hohes Genauigkeitsniveau erzeugt der sich ergebende
Fehler einen Test, dem eine nur geringe medizinische Bedeutung zukommt,
da ein nur so niedriger wie ein zweifacher Anstieg beim DPD/Kreatinin-Verhältnis zwischen
den normalen und Osteoporose-Zuständen auftritt. Der zweite Analyt
wird aus denjenigen Materialien der Körperflüssigkeit ausgewählt, die
klinisch in Bezug zum ersten Analyt stehen. Das am meisten feststellbare
Beispiel eines zweiten Analyt ist Kreatinin, d. h. der End-Metabolit,
wenn Kreatin zu Kreatinphosphat wird, das als Energiequelle zur
Muskelkontraktion verwendet wird. Das produzierte Kreatinin wird
durch die Nieren-Glomeruli gefiltert und dann im Urin ohne Reabsorption
ausgeschieden. Zur Steigerung der Empfindlichkeit urinärer Assayverfahren
und zur Minimierung des Problems hoher Urin-Durchflussraten, die
zu einer Verdünnung
des Urins führen,
werden Analyt/Kreatinin-Verhältnisse
in Urinprotein-Assayverfahren eingesetzt, um die Urin-Konzentration
zu normalisieren. Allgemeine Kreatinin-Assayverfahren schließen die
alkalischen Jaffe- und Benedict-Behre-Verfahren ein, die bei einem
hohen pH-Wert, in typischer Weise im Bereich von 11,5 bis 12,5,
durchgeführt
werden. In jüngerer
Zeit ist ein Kreatinin-Assay entwickelt worden, in welchem die Urinprobe
in Kontakt mit Kupferionen in der Gegenwart von Zitrat, einem Hydroperoxid
und einem oxidierbaren Farbstoff gebracht werden, der eine gefärbte Reaktion
in der Gegenwart Sauerstofffreier Radikale und eines Pseudoperoxids
ergibt. Dieses Verfahren ist vollständiger in
US 5 374 561 beschrieben. Eine Kreatinin-Quantifizierung
kann auch immunologisch bewerkstelligt werden, wie beschrieben in
WO 96/34271. Diese Zweit-Analyte, deren Konzentration in der Körperflüssigkeitsprobe
klinisch in Bezug zur Konzentration des Ziel-Analyt steht, sind
weder auf Kreatinin in Urin eingeschränkt, noch ist Urin die einzige
Körperflüssigkeit,
die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung mit einem Assayverfahren
analysiert werden kann. So kann die getestete Körperflüssigkeit beispielsweise Vollblut,
der erste (Ziel-)Analyt kann HbA
1c und der
zweite Analyt kann Gesamt-Hämoglobin
sein, da die auftretende HbA
1c-Konzentration
auf die Gesamt-Hämoglobin-Konzentration
des Vollbluts eingestellt werden kann, um Abweichungen im HbA
1c-Assay auszugleichen. Inulin, das intravenös verabreicht
wird, ist, wie Kreatinin, ein Indikator des Nierenflusses. In Serologie-basierten
Assayverfahren kann der erste Analyt gesamtes Prostata-spezifisches Antigen
und der zweite Analyt kann freies Prostata-spezifisches Antigen
sein. Ein weiteres Paar von Analyten, deren Konzentrationen klinisch
in Bezug zueinander stehen, sind Alanin-Aminotransferase (ALT) und
Aspartat-Aminotransferase (AST), die in menschlichen Geweben breit
verteilt sind. Sowohl AST als auch ALT sind im Normalfall im Plasma,
der Galle und dem Speichel des Menschen vorhanden. Bei viraler Hepatitis
und weiteren Formen von Leberkrankheiten sind die Spiegel von AST
und ALT erhöht,
sogar bevor klinische Anzeigen für
die Krankheit, wie Gelbsucht, auftreten. Bei toxischer oder viraler
Hepatitis ist ALT in charakteristischer Weise so hoch wie oder höher als
AST, und das ALT/AST-Verhältnis,
das im Normalfall < 1
ist, nähert
sich der Einheit oder wird größer als
diese. Ferner steigen die AST-Konzentrationen nach einem Herzinfarkt
an, um dadurch das Verhältnis
dieser beiden Enzyme und deren Aktivität zu verändern. Somit sind klinisch
signifikante Ergebnisse durch Bestimmung des Verhältnisses aus
diesen beiden Analyten in Serum erhältlich.
-
Viele
klinisch signifikanten Ziel-Analyte sind in Urin vorhanden und mit
der vorliegenden Erfindung bestimmbar. Unter diesen Analyten finden sich
Deoxypyridinolin (DPD), menschliches Serumalbumin, Missbrauchsdrogen,
wie Amphetamine/Barbiturate/Kokain, klinisch wichtige Protein-Marker
wie Prostata-spezifisches Antigen, Nierenkrankheit-Proteine wie
Lactat-Dehydrogenase,
N-Acetyl-β-D-glucosaminidase,
mit Schwangerschaft oder Fruchtbarkeit zusammenhängende Hormone, wie menschliches
chorionisches Gonadotropin, Follikel-stimulierendes Hormon und lutenisierendes
Hormon, Marker von Harntraktinfektionen, wie Tamm-Horsfall-Protein
oder Lipopolysaccharid, β-2-Mikroglobulin,
Amylase und chlamydiales LPS. Die Bestimmung des IgA/IgG-Verhältnisses
zur Bewertung einer Infektion kann mit der vorliegenden Erfindung
durchgeführt
werden. Die Korrektur von deren Absolutkonzentrationen für Variationen
im Nierenfluss durch Verhältnisbildung
dieser Konzentrationen zu beobachteten Kreatinin-Konzentrationen
steigert die Präzision
und Genauigkeit der Messungen.
-
Während die
Mittel zum Nachweis des Signals aus dem entwickelten Streifen von
der am markierten Bindungspartner befestigten nachweisbaren Markierung
abhängen,
ist die Anwendung eines Reflexionsmessgerätes typisch, wenn die nachweisbare
physikalische Eigenschaft der Markierung die Reflexion von Licht
bei einer vorbestimmten Wellenlänge
im sichtbaren oder IR-Bereich
des Spektrums ist. In einer bevorzugten Ausgestaltung wird ein Reflexionsmessgerät mit Mitteln
zur Bewegung des Streifens oder des Detektorelements des Messgeräts relativ
zueinander wie durch den Einsatz eines Specimen-Tisches für den Streifen
bereitgestellt, welcher seitlich unter dem Lesekopf des Detektors
bewegt werden kann. Diese technische Verfahrensweise trägt dazu
bei, eine genaue Quantifizierung für Bereichsregionen des Streifens
zu ergeben, die gegebenenfalls nicht präzise genug bezüglich der
Nachweismittel des Reflexionsmessgeräts angeordnet worden sein könnten. In
noch spezifischerer Weise kann die Anordnung des Streifens relativ
zum Detektor unter Mikroprozessorsteuerung erfolgen, so dass die
Reflexionswerte aus den zweiten, dritten oder vierten Bereichsregionen des
Streifens und individuelle Banden innerhalb dieser Bereichsregionen
individuell bestimmt werden können.
-
Das
Verfahren zur Durchführung
der vorliegenden Erfindung wird nun noch vollständiger durch die folgenden
Beispiele verdeutlicht und veranschlaulicht:
-
Beispiel 1
-
Ein
Teststreifen zur Bestimmung von Kreatinin und Deoxypyridinolin (DPD),
enthaltend 6 unterschiedene Flächen,
die zusammen auf einer Stützunterlage
aus Polystyrol von 101,6 mm (4 inches) Länge und 5,0 mm (0,2 inch) Breite
angeordnet sind, ist in 1 dargestellt. Bezüglich 1,
ist die Fläche 1 die
Kreatinin-Unterlage (der 4. Bereich, enthaltend Mittel zur Erzeugung
eines nachweisbaren Signals der Intensität, die dem Spiegel des Zweit-Analyt
entspricht, dessen Konzentration klinisch in Bezug zu derjenigen
des Erst-Analyt steht, dessen Konzentration bestimmt wird) mit einer
Größe von 5
mm × 5
mm (0,2 × 0,2
inch). Die Kreatinin-Unterlage wurde wie folgt hergestellt, um sie
zur kolorimetrischen Bestimmung von Kreatinin geeignet zu machen:
Whatman 3 mm-Filterpapier wurde zuerst durch Eintauchen auf eine
Tiefe von 5 mm (0,2 inch) in eine Lösung behandelt, enthaltend
30 mM Kupfersulfat, 50 mM Zitrat, 750 mM Glyceryl-2-phosphat, 0,2%
Hexansulfonsäure,
50 mM Phytinsäure
und 0,2% Natriumdodecylsulfonat (SDS) bei pH = 6,94. Nach Trocknung
des Streifens wurde der Streifen in eine Lösung getaucht, enthaltend 33
mM 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin,
73 mM Diisopropylbenzoldihydroperoxid, 63 mM Triisopropanolaminborat,
0,5% Plasonde und 0,032% Ethyl-Orange. Die erzeugte Intensität der gefärbten Reaktion
ist, wenn der Streifen in Kontakt mit einem wässrigen Medium gebracht wird,
das Kreatinin enthält,
proportional zur Kreatinin-Konzentration. Die Fläche 2 ist die Puffer-Unterlage,
hergestellt durch Imprägnieren
von Whatman-F07507-Glasfaser mit 0,5 bis 1 M Glycin und 175 bis
350 mM Harnstoff, mit einer Größe von 5
mm × 12,7
mm (0,2 × 0,5
inch). Die Puffer-Unterlage dient dem Zweck, den pH-Wert der Urinprobe
auf den gewünschten
Wert zu puffern. Beispielsweise kann der pH-Wert von Urin im Bereich
von 4,5 bis 8 liegen, und es kann eine Puffer-Unterlage eingesetzt
werden, um die Proben bei pH > 7
zu halten, um die Antigen/Antikörper-Bindungsreaktion
zu begünstigen.
Es gibt eine Lücke
von 2,5 mm (0,1 inch) zwischen der Kreatinin-Unterlage 1 und
der Puffer-Unterlage 2 zum Zweck, das Kreatinin-Reagens
isoliert vom Puffer-Unterlagen-Reagens
zu halten. Die Fläche 3 ist
eine Gold-Sol-DPD-Antikörper-Unterlage
(der erste Bereich, enthaltend einen markierten Bindungspartner,
der für
den Analyt spezifisch ist). Die Flächen 4 und 5 sind
die Immunochromatografie-Entwicklungsflächen, wo die Einfang- und Nachweisreagenzien
auf einem Stück
aus Nitrocellulose mit einer Größe von 5
mm × 31,75
mm (0,2 × 1,25
inch) abgeschieden werden. Die Fläche 4 enthält drei
Einfangbanden (den zweiten Bereich, enthaltend immobilisierten Analyt)
mit DPD, immobilisiert an Carboxyl-terminiertes Polyethylenglykol,
mit einer Bandenbreite von ca. 1,5 mm (0,059 inch) pro Bande und
einem Zwischenraum von 5 mm (0,2 inch) zwischen den Banden (von
Zentrum zu Zentrum). Bei 5 mm (0,2 inch) vom Zentrum der dritten
Einfangbande befindet sich die Fläche 5, bestehend aus
1 anti-IgG-Sammelbande (dem dritten Bereich zur Immobilisie rung
des Komplexes aus dem Analyt/markierten Bindungspartner) mit einer
Bandenbreite von ca. 1,5 mm (0,059 inch). Bei 5 mm (0,2 inch) oberhalb
der Sammelbande befindet sich die absorbierende Unterlage 6,
die dazu dient, die Flüssigkeit
zu absorbieren, die aus der Nitrocellulose-Fläche des Streifens wandert,
und welche eine Größe von 5
mm × 12,7
mm (0,2 inch × 0,5
inch) aufweist.
-
Zur
Durchführung
des Assay wurde der Streifen in die Test-Lösung, d. h. eine Urinprobe,
enthaltend den DPD-Analyt, der bestimmt wird, 3 s lang so tief eingetaucht,
dass nur die Kreatinin-Zone und die Puffer-Unterlage unter die Oberfläche der
Test-Lösung
gelangten, was es ermöglichte,
dass die Test-Lösung
nach oben im Streifen durch Kapillarwirkung durch die Einfangbanden
des Einfangbereichs, die Einzelbande des Nachweisbereichs und zur
absorbierenden Unterlage floss. Am Ende des 3 s langen Eintauchvorgangs
wurde der Streifen auf den Ablese-Tisch eines CLINITEK
® 50-Reflexionsspektrometers
gelegt, und es wurde der Startknopf des Gerätes gedrückt. Der Kreatinin-Unterlage-Reflexionswert
wurde bei 3 min aufgenommen, und der Reflexionswert des Immuno-DPD-Streifens
(aller vier Banden) wurde bei 3 min gemessen und aufgenommen. Die
Reflexionssignale für
den DPD-Assay wurden mit IR- und Grün-Filtern gemessen, wogegen
die Reflexion für
den Kreatinin-Assay mit Rot- und Grün-Filtern gemessen wurde. Das
Gerät ergibt
eine Reaktion in Decode-Werten, die durch die Gleichungen 1 bis
5 abgeleitet werden: Gleichung
1
worin [R]
grün der mit dem Grün-Filter
gemessene Reflexionswert und [R]
rot der
mit dem Rot-Filter gemessene Reflexionswert sind.
-
Für den DPD-Assay
wurden die Banden-Reaktionssignale, wie dies in Tabelle 4 angegeben
ist, bezeichnet:
-
Tabelle
4
Banden-Signalbezeichnung für DPD-Assay
-
Der
Reflexionswert mit dem Grün-Filter
wird ins Verhältnis
zum Reflexionswert mit dem IR-Filter gesetzt, um den Fehler aus
den Schwankungen zwischen den Streifen, wie den Höhen- und
Oberflächenschwankungen,
zu verringern. Der Reflexionswert an der IR-Wellenlänge bleibt
ziemlich konstant, und zwar unabhängig von der Gold-Sol-Intensitätsbande.
Der korrigierte Reflexionswert [Rn] wird gemäß Gleichung 2 berechnet: Gleichung
2
worin n die Bandenzahl 1, 2, 3 oder 4, [Rn]
grün der
Reflexionswert der Bande n mit dem Grün-Filter und [Rn]
IR der
Reflexionswert der Bande n mit dem IR-Filter sind. Die Zahl 65 wird
dem korrigierten Reflexionswert zugeordnet, da die %-Reflexion mit
dem IR-Filter ca. 65% beträgt.
-
Der
IR-korrigierte Reflexionswert [Rn] wird dann auf K/S gemäß Gleichung
3 umgerechnet, um das Bandenreaktionssignal für jede Bande zu ergeben: Gleichung
3
worin das Bandensignal Pn der K/S-Transformationsreflexionswert
[Rn] ist.
-
Der
Reaktion-Decode jeder Bande wird schließlich gemäß Gleichung 4 berechnet: Gleichung
4
worin T die Summierung des Bandessignals für alle Banden
(Gleichung 5) ist:
-
Gleichung 5
-
- T = Σ n = 1 bis NPn,worin N die Gesamtzahl der
Einfangbanden, welche im vorliegenden Beispiel 4 beträgt, Pn das
Bandensignal n und n 1, 2, 3 oder 4 sind.
-
Standardkurven
für DPD
und Kreatinin wurden mit Eichmitteln, enthaltend 6 Niveaus von Analyt-Konzentrationen,
erstellt. Beispiele von Standardkurven sind in 2 für den DPD-Assay
und in 3 für
den Kreatinin-Assay dargestellt. Die DPD- und Kreatinin-Konzentrationen
für die
Urin-Testprobe wurden
aus den DPD- bzw. den Kreatinin-Standardkurven berechnet. Das DPD-Kreatinin-Verhältnis in
nM/mM wurde dann für
Urinprobe A gemäß der folgenden
Berechnung ermittelt:
DPD-Konzentration, berechnet aus der
DPD-Standardkurve = 123 nM,
Kreatinin-Konzentration, berechnet
aus der Kreatinin-Standardkurve = 10,2 mM, und
das DPD/Kreatinin-Verhältnis =
123 nM/10,2 mM = 12,1 nM/mM.
-
Der
Abschnitt-Wert zur Bestimmung eines Zustandes hoher Knochenresorption
wird durch ein DPD/Kreatinin-Verhältnis von 7,4 nM/mM dargestellt.
Weniger als 7,4 ist normal, und größer als 7,4 liegt bei einem
Zustand hoher Knochenresorption vor. Daher zeigt in diesem Beispiel
das Ergebnis einen Zustand hoher Knochenresorption an. Eine zweite
Urinprobe wurde in ähnlicher
Weise analysiert und ergab das folgende Ergebnis:
DPD-Konzentration
= 123 nM,
Kreatinin-Konzentration = 20,5 mM, und
DPD/Kreatinin-Verhältnis =
6,0 nM/mM.
-
Obwohl
die DPD-Konzentration dieselbe ist, zeigt das Verhältnis von
DPD zu Kreatinin einen Zustand niedriger Knochenresorption an.
-
Fünf Durchgänge wurden
unter Anwendung der obigen Verfahrensweise mit Urinproben durchgeführt, die
variierende Mengen von DPD und Kreatinin enthielten. Die erwarteten
und beobachteten Verhältnisse
sowie die Standardabweichungen, die %-Koeffizientvarianz und die
Positiv/Negativ-Abweichungen sind in Tabelle 5 aufgeführt. Aus
Tabelle 5 ist ermittelbar, dass eine Präzision von weniger als 12%
CV bei den 3 Spiegeln 4,52, 7,54 und 12,07 nM/mM von DPD zu Kreatinin
erhalten wurde: Tabelle
5
DPD/Kreatinin-Assay-Leistungsvermögen
- % CV-Durchschnitt
- 11,9%
-
Während die
mit Gold-Sol markierten Antikörper
visuell in den Einfang- und Sammelzonen des Streifens beobachtbar
sind, sind klinisch bedeutungsvolle Ergebnisse nur durch die Anwendung
eines Reflexionsmessgeräts
erhältlich.
Dies ist wegen der Anwendung von Mehrfachbanden über die gesamte Länge des
Streifens hinweg der Fall. Außerdem
machen die Bandensignale Reflexionsmessungen bei unterschiedlichen
Wellenlängen
(IR, grün
und rot) mit einem Gerät
erforderlich, das die Befähigung
aufweist, die Reflexion bei diesen Wellenlängen zu messen und aufzunehmen.
Die Reflexionsmessungen werden, bezogen auf einen vorbestimmten
Algorithmus, unter Anwendung der Software des Geräts ins Verhältnis zu
einander gesetzt. Ferner werden die Analyt-Konzentrationen mit Standardkurven
ermittelt, die im Gerät
gespeichert sind, und das DPD/Kreatinin-Verhältnis wird mit der im Gerät aufgestellten
Software berechnet.
-
Im
obigen Beispiel wurde das endgültige
Reaktionssignal (Decode) für
den DPD-Assay mit den Algorithmus-Decode = [T/Pn] ermittelt, worin
T die Summierung des Signals aus allen 4 Banden und Pn das Bandensignal
von Bande 1 sind. Die Anwendung dieses Algorithmus steigert die
Genauigkeit des Assay, weil die Verhältnisbildung des Bandensignals
den systematischen Fehler, wie den Fehler, der durch die Schwankungen
von Gerät
zu Gerät
eingeführt
wird, minimiert. Weitere Algorithmen können angewandt werden, um das endgültige Reaktionssignal
zu ermitteln und zu bestimmen. Das Reaktionssignal in diesem Beispiel
wurde wie folgt bestimmt: Reaktionssignal = [T/Einfangbande
1]
oder [T/P1],worin alle Bandensignale
K/S-Transformationsreflexionswerte und T die Summierung der Einfang-
und Nachweisbande sind.
-
Die
Vorteile der Anwendung einer Banden-Verhältnisbildung werden durch die
Daten der Tabellen 6 und 7 belegt, aus denen ermittelbar ist, dass
die Präzision,
mit welcher der Streifen die DPD-Konzentration zu bestimmen vermag,
viel größer als
diejenige ist, die erhältlich
ist, wenn nur das Signal aus der Einfangzone angewandt wird.
-
Tabelle
6
Reaktionssignal = Banden-Verhältnisbildungsalgorithmus [T/P
1]
-
Tabelle
7
Reaktionssignal = Einfangzone [P
1]
(keine Banden-Verhältnisbildung)
-
Alternativ
dazu, kann das endgültige
Reaktionssignal wie folgt berechnet werden: Reaktionssignal
= [Nachweisbande/Einfangbande],worin alle Bandensignale K/S-Transformationsreflexionswerte
sind. Alternativ dazu, kann, wenn der Streifen mehrfache Einfang-
und Nachweisbanden enthält,
das endgültige
Reaktionssignal wie folgt berechnet werden: [Einfangbande
1/Nachweisbande 1],worin alle Signale K/S-Transformationsreflexionswerte
sind. Ein weiteres Verfahren zur Berechnung des Reaktionssignals
beinhaltet die Anwendung des Algorithmus: Reaktionssignal
=
[WEinf × Einfangbande 1/WNachw × Nachweisbande],worin
alle Bandensignale Reflexionswerte und die WEinf und
WNachw Gewichtungsfunktionen sind, die die
Einfang- und Nachweisbanden unterschiedlich gewichten. Somit kann
eine große
Anzahl von Algorithmen angewandt werden, um das endgültige Reaktionssignal
zu ermitteln und zu bestimmen.
-
Die
Berechnung des Reaktionssignals durch Verhältnisbildung der Signale aus
dem im zweiten (Einfang-)Bereich des Streifens immobilisierten markierten
Bindungspartner und dem im dritten (Nachweis-)Bereich immobilisierten
markierten Bindungspartner ist kritisch gegenüber der Präzisionssteigerung des Assay durch
Verringerung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses. Diese erhöhte Präzision ist
notwendig für
den Test, um klinische Signifikanz aufzuweisen, da lediglich ein
Anstieg um das 2-Fache beim DPD/Kreatinin-Verhältnis zwischen den normalen
und eine Krankheit anzeigenden Osteoporose-Zuständen auftritt.
-
Ein
weiterer Beleg für
die Verbesserungen bei den analytischen Ergebnissen, die mit der
vorliegenden Erfindung erzielt werden, ist in den Tabellen 8 bis
10 angegeben. Diese Tabellen wurden unter Anwendung der gleichen
festgelegten Daten erstellt, es werden aber 3 unterschiedliche Algorithmen
([T/P1] mit Banden-Verhältnisbildung, mit %-Reflexion
der ersten Einfangbande mit keiner IR-Korrektur und keiner Banden-Verhältnisbildung
und mit %-Reflexion der ersten Einfangbande mit keiner Banden-Verhältnisbildung,
aber mit IR-Korrektur) vergleichen:
-
Tabelle
8
Leistungsvermögen
mit [T/P
1]-Banden-Verhältnisbildungsalgorithmus
-
Anmerkung:
Der erste Spiegel wurde in der Berechnung des Mittelwertes ausgeschlossen.
-
Tabelle
9
Leistungsvermögen
mit % R der Einfangbande 1 bei keiner Banden-Verhältnisbildung
und keiner IR-Korrektur
-
Anmerkung:
Der erste Spiegel wurde in der Berechnung des Mittelwertes ausgeschlossen.
-
Tabelle
10
Leistungsvermögen
mit % R der Einfangbande mit keiner Banden-Verhältnisbildung,
aber mit IR-Korrektur
