DE69522831T2

DE69522831T2 - Assays und vorrichtungen zum nachweis von extrahepatischer biliäreratresie

Info

Publication number: DE69522831T2
Application number: DE69522831T
Authority: DE
Inventors: Laszlo Takacs
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1994-07-14
Filing date: 1995-07-13
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2015-07-14
Also published as: ATE205884T1; CA2187783A1; PT820522E; WO1996002667A1; CA2187783C; US5601986A; ES2160714T3; AU3538195A; DK0820522T3; EP0820522B1; EP0820522A1; DE69522831D1

Description

1. Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Diagnose von extrahepatischer Gallenatresie. Insbesondere beinhaltet die Erfindung den Nachweis von Dipeptidyl-Peptidase IV als eine Indikation des Auftretens von extrahepatischer Gallenatresie.

2. Hintergrund

Gallenatresie stellt eine totale oder teilweise Agenisie des Gallenbaums dar und betrifft normalerweise mehr extrahepatische als intrahepatische Gallengänge. Extrahepatische Gallenatresie (EHGA) ist eine heterogene seltene Krankheit die fatal ist, wenn sie unbehandelt bleibt. Das Auftreten von EHGA variiert in verschiedenen geographischen Bereichen beträchtlich, es wird jedoch geschätzt, daß sie eine in 18.000 Lebendgeburten jedes Jahr allein in den Vereinigten Staaten betrifft. EHGA folgt von der diskontinuierlichen oder falschen Entwicklung von Gallengängen in Richtung des Darmtrakts. Ohne die Gänge beginnen die Gallendetergenzien, die Gallenhaargrenze des Gallen-Kapillarepitheliums abzubauen, und diese Materialien treten in die venösen Sinusoide der Leber aus, wobei sie letztendlich mit der systemischen Zirkulation verbunden werden. In den meisten Fällen entwickelt sich die Gallenatresie einige Wochen nach der Geburt, möglicherweise im Anschluß an Entzündung und Vernarbung der Gallengänge. Sie wird selten in Todgeburten oder in der unmittelbaren neonatalen Periode gefunden. Die Etiologie der Entzündungsantwort ist oft unbekannt.
Betroffene Kinder können bei der Geburt normal aussehen und werden aufgrund der progressiven obstruktiven Gelbsucht in einem Alter von drei bis sechs Wochen erkannt. Dieser Verlauf spiegelt die pathologischen Veränderungen innerhalb der Gallengänge bei Gallenatresie wieder, nämlich eine dynamische Entwicklung von einem offenen Gallengang bei der Geburt zu progressiver Verstopfung und Gallenzirrhose.
Geeignete Untersuchungen können normalerweise andere spezifische Ursachen von neonataler obstruktiver Gelbsucht, wie zum Beispiel spezifische Infektionen, Galactosämie und zystische Fibrose ausschließen, jedoch kann die Unterscheidung zwischen neonataler Hepatitis und EHGA aufgrund der histologischen Ähnlichkeiten zwischen ihren sich ergebenden pathologischen Veränderungen schwierig sein. Eine frühe Diagnose ist wichtig, da eine erfolgreiche Gallendekompression mit Zunahme des Patientenalters fortschreitend unwahrscheinlich wird. Ohne chirurgische Evaluierung und Rekonstruktion verursacht eine verlängerte Gallenhypertension einen permanenten und progressiven Leberschaden, der zu metabolischen Komplikationen, Infektion, sklerotisierender Cholangitis und Zirrhose, führen kann und in terminaler Leberinsuffizienz enden kann. Daher muß bei Fehlen von Ergebnissen, die eine alternative Diagnose positiv feststellen, Gallenatresie ausgeschlossen werden können.
Direkte und gesamte Bilirubinwerte, Leberenzyme, alkalische Phosphatase und Serumspiegel von Gallensäuren schließen normalerweise Infektionen und Stoffwechselstörungen aus, werden jedoch nicht EHGA klar von neonataler Hepatitis unterscheiden. Bildgebende Untersuchungen, einschließlich radiographischer Untersuchung oder Ultraschalluntersuchung der Gallenblase und den extrahepatischen Gallengängen können hilfreich sein sind aber nicht spezifisch. Die Anbringung eines nasoduodenalen Tubus und Sammeln von einer 24 Stunden Probe von duodenaler Flüssigkeit durch Schwerkraftdrainage kann die Anwesenheit von Galle (Bilirubin kann nicht gemessen werden) ergeben; die Gallenexkretion ist ein starker Hinweis gegen eine Diagnose vollständiger Gallenatresie. Solch ein Verfahren ist jedoch invasiv. Ein anderes invasives Verfahren ist eine perkutane Leberbiopsie, die eine Auswertung durch einen erfahrenen behandelnden Arzt erfordert.
Wenn die Diagnose zum Ausschluß von EHGA immer noch unsicher ist, muß eine Laparotomie vor einem Alter von zwei Monaten durchgeführt werden, weil Kinder mit EHGA irreversible Gallenzirrhose entwickeln, wenn von der Operation abgesehen wird. Atretische Gallengänge können bei 5 bis 10% der Kinder erfolgreich reanastomosiert werden. EHGA ist eine fortschreitenden Krankheit und wenn die korrektive Chirurgie nicht vor einem Alter von ungefähr acht Wochen durchgeführt wird, besteht nur eine ungefähr 25%ige Überlebenschance. Wenn das korrektive Verfahren nicht durchgeführt wird oder fehlschlägt, wird ein Lebertransplantation erforderlich. Es ist daher wichtig, EHGA in einem Alter von zwischen 2-8 Wochen nachzuweisen.
Bei Diagnose wird EHGA chirurgisch behandelt. Ein paar Patienten (±15%) mit EHGA weisen anatomische Läsionen auf, bei denen ein anastomotisches Verfahren anwendbar ist, das ein direktes Annähen der Darmschleimhaut zu der eines in der Nähe liegenden offenen extrahepatischen Gallenbaums zur Verfügung stellt. Die meisten Patienten (±85%) sind keine Kandidaten für direkte Anastomosierung. Diese Patienten wiesen eine hoffnungslose Prognose und kurze Lebensspanne vor dem chirurgischen Ansatz durch Kasai der Hepatoportoenterostomie, die die direkte chirurgische Schleimhaut-zu-Schleimhaut-Anastomosie der Porta Hepatis an den Darm einschließt. (Karrer et al., Surg., Clin. North Am. 70: 1403-18 (1990) und Tagge et al., Ann. Surg. 214: 590-8 (1991)). In Fällen, wo ein permanenter Leberschaden vorliegt, ist die Behandlung der Wahl eine Lebertransplantation (Ryckman et al., Semin. Liver Dis. 7: 134-54 (1987); Wall W. J., Can. Med Assoc. J. 139: 21-8 (1988); und Esquivel et al., J. Pediatr. 111: 1039-45 (1987)).
Mit frühen diagnostischen Screening-Verfahren kann die Zahl von unnötigen frühen Transplantationen unter Umständen durch eine rechtzeitige chirurgische Intervention verringert werden. In Ländern und Regionen, wo Lebertransplantation nicht erhältlich ist, ist eine frühe Diagnose, gefolgt von chirurgischer Korrektur, die einzige Überlebenschance für Patienten mit EHGA.
Ungefähr ein Drittel aller Neugeborenen erscheinen bei Geburt gelbsüchtig. Ungefähr ein Zehntel von diesen bleiben nach ungefähr 10 Tagen gelbsüchtig. Diese Neugeborenen würden Kandidaten für eine EHGA-Diagnostik sein. Ein Screening-Programm für EHGA wurde vor kurzer Zeit im Vereinigten Königreich angeordnet. Die Brauchbarkeit des Screening- Programms wurde jedoch aufgrund des Fehlens einer einfachen und spezifischen Nachweistechnologie scharf diskutiert (Logan et al., Lancet 342: 256 (1993)). Daher würde ein einfacher und genauer nicht invasiver Test, um EHGA zu evaluieren, für eine frühe Diagnose und Behandlung unschätzbar sein.
Chemical Abstracts, Vol. 104, Nr. 11, 17. März 1986, Columbus, Ohio, U. S. A. Seite 471, column 1, Abstract No. 86338 (S. Maeyama) beschreibt erhöhte Level von Serum Glycylprolin-Dipeptidyl-Aminopeptidase (GPDA) Aktivität bei verschiedenen Lebererkrankungen und schlägt die Verwendung von Serum GPDA-Aktivitätsuntersuchung bei der Diagnose von hepatobiliären Erkrankungen vor.
US-A-4,191,808 (Nagatsu et al) beschreibt die Aktivität von X-Prolyl-Dipeptidyl- Aminopeptidase gegen X-L-Prolin-Y, wobei X ein Aminosäurerest und Y p-Nitroanilin, p- Phenylazoanilin oder 4-Phenylazo-1-naphthylamin ist, als ein Maß von hepatobiliären Erkrankungen und Karzinomen.
Chemical Abstracts, Vol. 113, Nr. 5, 30. Juli 1990, Columbus, Ohio, U. S. A. Seite 257, column 2, Abstract Nr. 36831 (G. W. McCaughan et al) beschreibt die Gewebeverteilung, Reinigung und N-terminale Aminosäuresequenz von Gallenkanal-Zellenoberflächen-Dipeptidyl- Peptidase IV unter der Verwendung von Immunperoxidase-Färbung mit einem monoklonalen Antikörper.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vielzahl von Assay-Verfahren zur Untersuchung der Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie. Ein exemplarisches Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt in Kontakt bringen einer Testprobe mit einem Proteasesubstrat ein, daß mit Depeptidyl-Peptidase IV reaktiv ist, wodurch eine Reaktion gestartet wird; und Nachweisen der Reaktion von dem Substrat oder Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts ein. Die Reaktion oder Anwesenheit des Reaktionsprodukts ergibt sich aus der Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV in der Testprobe und zeigt eine extrahepatische Gallenatresie an. Das Substrat kann ein chromogenes Substrat sein, und die Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV wird durch die Produktion eines farbigen Reaktionsprodukts angezeigt. Mögliche Substrate schließen Xaa-Pro-para-nitro-analid und Xaa-Pro-coumann ein, worin Xaa jede natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäure ist.
Ein anderer möglicher Test zur Evaluierung der Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie gemäß der vorliegenden Erfindung schließt ein in Kontakt bringen der Probe mit einem ersten Antikörper, der spezifisch für Dipeptidyl-Peptidase IV ist, ein, wodurch eine Antikörper-gebundene Dipeptidyl-Peptidase IV hergestellt wird. Die Antikörper-gebundene Dipeptidyl-Peptidase IV wird dann mit einem Nachweisreagenz in Kontakt gebraucht, wie zum Beispiel einem Proteasesubstrat, einem markierten zweiten Antikörper der spezifisch für Dipeptidyl-Peptidase IV ist oder einem zweiten Antikörper der spezifisch für Dipeptidyl- Peptidase IV ist, der indirekt einen nachweisbaren Marker bindet, wodurch ein nachweisbares Reaktionsprodukt gebildet wird. Die Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts ergibt sich aus der Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV in der Testprobe und zeigt die Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie an.
Die Tests können in der Form von Testvorrichtungen zur Analyse einer Testprobe und Evaluierung der Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie entwickelt werden. In einer Grundform schließen solche Vorrichtungen eine feste Phase ein, die ein Substrat enthält oder mit einem solchen Substrat beschichtet ist, das mit Dipeptidyl-Peptidase IV reaktiv ist, wobei das Substrat mit Dipeptidyl-Peptidase IV reagiert, die in der Testprobe vorhanden ist und eine nachweisbare Reaktion ergibt, die extrahepatische Gallenatresie anzeigt.
Eine andere analytische Vorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge von Dipeptidyl-Peptidase IV in einer Testprobe umfaßt einen Streifen aus porösem Material, der ein proximales und distales Ende aufweist, wobei die Testprobe von dem proximalen Ende zum distalen Ende durch kapilläre Aktion wandern kann. Ein Antikörper wird an einer Fangstelle immobilisiert, die zwischen den proximalen und distalen Enden positioniert ist, wobei der Antikörper Dipeptidyl-Peptidase IV bindet. Ein Indikatoreagenz, das an der Fangstelle positioniert ist oder auf dem Streifen stromaufwärts von der Fangstelle positioniert ist, kann ein markierter Antikörper sein, der an Dipeptidyl-Peptidase IV bindet und ein nachweisbares Signal an der Fangstelle erzeugt, wodurch die Anwesenheit oder Menge von Dipeptidyl- Peptidase IV in der Testprobe angezeigt wird. Die Vorrichtung kann gegebenenfalls eine Auftragungsfläche in Fließverbindung mit dem proximalen Ende des Streifens einschließen, wobei die Aufnahmefläche die Testprobe aufnimmt und das Indikatorreagenz enthält. Zusätzlich kann das Fangreagenz innerhalb des Streifens in Form von einer oder mehreren getrennten Fangstellen immobilisiert sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Dipeptidyl-Peptidase IV und Leucin-Aminopeptidase-Aktivitäten in Urinproben von Kontroll- und EHGA-Patienten.
Fig. 2 zeigt die Dipeptidyl-Peptidase IV-Aktivität in Serumproben.
Fig. 3 zeigt die Leucin-Aminopeptidase-Aktivität in Serumproben.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schließt die Diagnose von extrahepatischer Gallenatresie (EHGA) über den Nachweis von erhöhten Urin- und Serum Dipeptidyl-Peptidase IV-Aktivitätsleveln ein. Dipeptidyl-Peptidase IV (DPPIV; E. C. N. 3.4.14.5, auch bekannt als Thymozyten costimulierendes Protein oder CD 26) ist eine Protease mit einer sehr spezifischen Gewebeverteilung. Sie ist auf der Lumenseite der Epithel-Zellenlage in den Gallengängen lokalisiert (siehe Bristol et al., J. Immunol. 148: 332-338 (1992) und 149: 367-372 (1992)). Die Hypothese, die zu der vorliegenden Erfindung führte war, daß, wenn nicht freigesetzte Gallendetergenzien das Epithelium abbauen, unter Druck in den unvollständigen Gängen vorliegendes DPPIV, unter Umständen durch die tight-junctions zwischen den Zellen hindurch austritt und in das Blut übertritt. Dies führte zu einer Untersuchung des Bluts und Urins des Patienten auf DPPIV-ähnliche Aktivität.
DPPIV und Leucin-Aminopeptidase (LAP, CD 13, E. C. N. 3.4.11.2) Messungen wurden mit Serum und Urinproben von Patienten durchgeführt, die vorher als mit EHGA diagnostiziert wurden, und von Patienten mit Gelbsucht aufgrund von ABO Inkompatibilität oder viraler Hepatitis. Die Ergebnisse zeigten das unterschiedliche diagnostische Potential des Tests und zeigten, daß erhöhte DPPIV-Aktivität EHGA anzeigt. Ein DPPIV-Urinspiegel von typischerweise mindestens 1 nmol/min/ml, oder weiter bevorzugt von mindestens 2 nmol/min/ml oder ein Serumlevel von mindestens 15 nmol/min/ml wurde als für EHGA indikativ gefunden.
Die vorliegende Erfindung stellt daher kostengünstige und einfach durchzuführende Tests zur Verwendung bei Screening auf EHGA zur Verfügung. Zusätzlich können Änderungen in Serumspiegeln von sowohl LAP- und DPPIV-Aktivitäten von zusätzlicher Hilfe für bereits existierende Enzym- und anderen diagnostischen Tests für die differenzierte Diagnose von EHGA sein. Darüber hinaus können die Tests der vorliegenden Erfindung und die Vorrichtungen zur Durchführung dieser Tests dazu verwendet werden, Patienten im Anschluß an korrektive Chirurgie zu überwachen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt einen chemischen Assay auf DPPIV ein. Der Assay verwendet ein Enzymsubstrat, das mit DPPIV reagiert, um ein nachweisbares Reaktionsprodukt zu bilden. Alternativ kann die Reaktionsrate des Substrats verfolgt werden, um die Anwesenheit oder Menge von DPPIV in einer Testprobe nachzuweisen. Geeignete Enzymsubstrate schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Dipeptid- Substrate, wie zum Beispiel Xaa-Pro-para-nitro-analid (Xaa-Pro-PNA) oder Xaa-Procoumann. Die variable Aminosäure, Xaa, kann jede natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäure sein. Ein beispielhaftes Dipeptid-Substrat ist Gly-Pro-para-nitro-analid (Gly-Pro-PNA). Bei einer Wellenlänge von 405 Nanometern weist das Substrat keine Absorption auf; jedoch, wenn das Dipeptid-Substrat (hinter dem Pro) aufgrund der Anwesenheit von DPPIV gespalten wird, kann die Bildung eines Reaktionsprodukts spektrophotometrisch visualisiert werden, weil eine gelb-grüne Farbe produziert wird. Andere Substrate, wie zum Beispiel Xaa-Pro-coumann, können spektrofluorometrisch visualisiert werden, weil eine · Fluoreszenz-Emission durch die Reaktion produziert wird.
Assays, die solche Reagenzien und Reaktionen enthalten, können in jedem geeigneten Reaktionsgefäß durchgeführt werden, zum Beispiel einem Teströhrchen oder Tüpfel einer Mikrotiterplatte. Alternativ können Assay-Vorrichtungen in wegwerfbarer Form wie zum Beispiel als Tauchstäbchen- oder Teststreifen-Vorrichtungsformate entwickelt werden, die dem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind und die eine einfache Herstellung und Verwendung · zur Verfügung stellen. Solche wegwerfbaren Assay-Vorrichtungen können in der Form von Kits verpackt sein, die alle nötigen Materialien, Reagenzien und Gebrauchsanweisungen enthalten. Die Kits könnten an Eltern von denjenigen Neugeborenen geliefert werden, deren Gelbsucht nicht nach ungefähr 10 Tagen verschwindet. Diese Neugeborenen könnten durch die Assays der vorliegenden Erfindung streng überwacht werden, um die Anwesenheit oder Menge von DPPIV in einer Testprobe (bevorzugterweise Urin für Testnachweise zu Hause) nachzuweisen und dadurch die Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie zu evaluieren.
Assay-Vorrichtungen zur Durchführung der Assays der vorliegenden Erfindung könnten vorteilhafterweise als Tauchstäbchen- oder Teststreifen-Vorrichtungen formatiert sein. Zum Beispiel kann ein Tauchstäbchen aus einem Stück saugfähigen Materials gemacht sein, das ein chromogenes Substrat für DPPIV enthält. Alternativ könnte das Tauchstäbchen aus einem nicht-porösen Material hergestellt sein, auf das das Substrat beschichtet ist. Nach in Kontakt bringen der Vorrichtung mit der gewünschten Testprobe würde das Substrat und jede DPPIV, die in der Probe vorhanden ist, interagieren, um eine nachweisbare Reaktion auf der Vorrichtung zu bilden.
In einer alternativen Ausführungsform kann die Vorrichtung ein Teststreifen sein, wobei das Substrat in einer oder mehreren Zonen entlang der Länge eines Streifens aus saugfähigem Material enthalten ist. Nach Kontakt von einem Ende des Streifens mit der gewünschten Testprobe wandert die flüssige Probe entlang des saugfähigem Materials. Die Reaktion des Substrats und die Herstellung eines nachweisbaren Signals zeigen die Anwesenheit von DPPIV in der Testprobe an. In einer Vorrichtung mit vielen Zonen kann die Zahl von einzelnen oder isolierten Zonen entlang der Länge des Streifens, die ein nachweisbares Signal ergeben, auch die Menge von in der Testprobe vorhandener DPPIV anzeigen. Alternativ kann ein Hauptteil des Teststreifens das Substrat enthalten. Die Länge der Farbreaktion, die in einem Teststreifen, der solch eine einzelne verlängerte Substratzone aufweist gebildet wird, kann verwendet werden, um die Anwesenheit oder Menge von DPPIV in der Testprobe anzuzeigen.
In einer alternativen Assay-Ausführungsform kann die Rate, bei der die Reaktion auftritt als ein Hinweis auf die Menge von in der Testprobe vorhandener DPPIV nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann die Rate, bei der das Substrat reagiert wird, dazu verwendet werden, die Menge von in der Testprobe vorhandener DPPIV anzuzeigen. Alternativ kann die Rate, bei der das Reaktionsprodukt gebildet wird dazu verwendet werden, um die Menge von in der Testprobe vorhandener DPPIV anzuzeigen.
In noch einer anderen Ausführungsform kann ein Fang- oder Bindungs-Assay durchgeführt werden, um die Protease nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. Zum Beispiel kann ein Antikörper, der mit DPPIV-Protein reaktiv ist, jedoch nicht mit der Peptidase-Aktivität interferiert, auf einer festen Phase immobilisiert sein. Die Testprobe wird dann über den immobilisierten Antikörper hinweg passiert und DPPIV, falls vorhanden, bindet an den Antikörper und ist ihrerseits zum Nachweis immobilisiert. Ein Substrat kann dann hinzugefügt werden und das Reaktionsprodukt kann nachgewiesen werden, um die Anwesenheit oder Menge von DPPIV in der Testprobe anzuzeigen. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung kann der Begriff "feste Phase" so verwendet werden, um jedes Material oder Gefäß einzuschließen, in dem oder auf dem der Test durchgeführt werden kann und schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf, poröse Materialien, nicht poröse Materialien, Testgefäße, Tüpfel, Scheiben, usw.
In einer beispielhaften Teststreifenvorrichtung wird eine Testprobenauftragungsfläche gegebenenfalls an ein Ende eines porösen Streifens angebracht. Der Streifen enthält einen immobilisierten Antikörper, der an DPPIV binden wird und dadurch DPPIV an einer vorbestimmten Stelle zum anschließenden Nachweis immobilisieren wird. Gegebenenfalls kann die Vorrichtung ein Assay-Indikatorende einschließen, das an dem distalen Ende des Teststreifens weg von der Testproben-Kontaktstelle positioniert ist. Das Ende des Assay-Indikators erzeugt nach Kontakt mit der Testprobe oder einem Assay-Reagenz ein nachweisbares Signal, wodurch angezeigt wird, daß der Test vollständig ist.
Eine Testproben-Auftragungsfläche kann ein Teil des porösen Streifens selber oder ein Material Fließverbindung mit dem Ende des porösen Streifens, bezeichnet als das proximale Ende, sein, so daß die Testprobe von der Auftragungsfläche zu dem porösen Streifen passieren oder wandern kann. Fließverbindung kann physikalischen Kontakt der Auftragungsfläche mit dem porösen Streifen sowie die Trennung der Auftragungsfläche von dem porösen Streifen durch einen dazwischenliegenden Raum oder zusätzliches Material einschließen, daß es der Flüssigkeit immer noch erlaubt, zwischen der Auftragungsfläche und dem porösen Streifen zu fließen. Im wesentlichen Alles der Auftragungsfläche kann mit dem porösen Streifen überlagern, um es der Testprobe zu ermöglichen, durch im wesentlichen jeden Teil der Auftragungsfläche hindurch auf das proximale Ende des porösen Streifens zu passieren.
Alternativ kann nur ein Teil der Auftragungsfläche in Fließverbindung mit dem porösen Streifen sein. Die Auftragungsfläche kann jedes Material sein, das die Testprobe auf den porösen Streifen transferieren kann.
Der poröse Streifen der Testvorrichtung kann jedes geeignete absorbierende, poröse, saugfähige, chromatographische oder Kapillaren besitzende Material sein, durch das eine Testprobe, die den Analyten enthält, durch eine Kapillar- oder Dochtwirkung transportiert werden kann. Natürliche, synthetische oder natürlich auftretende Materialien, die synthetisch modifiziert sind, können als der poröse Streifen verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf: Zellulosematerialien, wie z. B. Papier, Zellulose und Zellulosederivate, wie z. B. Zellulose-Acetate und Nitrozellulose; Fiberglas; Stoff, sowohl natürlich auftretende (z. B. Baumwolle) und synthetische (z. B. Nylon); poröse Gele wie z. B. Silikagel, Agarose, Dextran und Gelatine; poröse fasvise Matrizes; stärkebasierte Materialien, wie z. B. kreuzvernetzte Dextranketten; Keramikmaterialien; Filme aus Polyvinylchlorid und Kombinationen von Polyvinylchlorid-Silika und ähnliches. Der poröse Streifen sollte nicht mit der Produktion eines nachweisbaren Signals interferieren. Der poröse Streifen sollte eine ausreichende inhärente Stärke aufweisen oder Stärke kann mittels eines zusätzlichen Trägers zur Verfügung gestellt werden.
Die einzelnen Ausmaße des porösen Streifens sind eine Frage der Bequemlichkeit, die abhängt von der Größe der beteiligten Testprobe, dem Assay-Protokoll, den Mitteln zum Nachweis und Messen des Signals und ähnlichem. Zum Beispiel können die Abmessungen so ausgewählt werden, um die Rate der Flüssigkeitswanderung sowie die Menge von Testprobe, die durch den porösen Streifen aufgesaugt werden soll, zu regulieren.
Bei einer möglichen Teststreifen-Vorrichtung kann ein DPPIV-Substrat und/oder DPPIV- Fang-Antikörper auf dem porösen Streifen immobilisiert sein, um mindestens eine Analytennachweisstelle zu bilden, d. h. die Region des porösen Streifens, die eine oder mehrere nichtdiffundierbar daran angebrachte Assay-Reagenzien aufweisen. In einer anderen Ausführungsform der Vorrichtung kann die Mess- oder Nachweisregion des Teststreifens eine Vielzahl von Stellen einschließen, die ein DPPIV-Substrat und/oder immobilisierten Anti-DPPIV- Antikörper enthalten. Ggf. können die verschiedenen Nachweisstellen verschiedene Mengen von Substrat und/oder immobilisierten Anti-DPPIV-Antikörper enthalten, d. h. eine höhere Menge in der ersten Nachweisstelle und geringere Mengen in nachfolgenden Stellen. Zum Beispiel, wenn 20 Nanogramm Antikörper das Äquivalent von 1 nmol/min/ml DPPIV fangen, kann die erste Nachweisstelle einer Urin-Assay-Vorrichtung 50 Nanogramm von Anti- DPPIV-Antikörper enthalten, während die nachfolgenden Stellen 10, 20, 30, usw. Nanogramm Antikörper enthalten. Nach der Zugabe von Testprobe stellt die Zahl von Stellen, die ein nachweisbares Signal zeigen, eine quantitative Anzeige der Menge von in der Probe vorhandener DPPIV zur Verfügung. Die Nachweisstellen können in der geeigneten Form angeordnet sein und sind typischerweise in der Form eines Balkens, der die Weite des Teststreifens überspannt, vorhanden.
Ggf. kann die Vorrichtung mit vielen Fangstellen auf solche Weise hergestellt werden, daß, wenn ein Schwellenwert von DPPIV nicht in der Testprobe vorhanden ist, dann im wesentlichen alles der DPPIV an den Antikörper in der ersten Fangstelle binden wird und daher an dieser Stelle immobilisiert wird. Wenn eine größere als die Schwellenwertmenge von DPPIV in der Testprobe vorhanden ist, wird die verbleibende DPPIV an nachfolgende Nachweiszonen von immobilisierten Antikörper entlang der Länge des Teststreifens binden. Je größer die Menge von DPPIV in der Testprobe ist, desto größer ist die Zahl von Fangstellen, die ein nachweisbares Signal auf Grund der Anwesenheit von DPPIV zeigen werden. Wie vom Durchschnittsfachmann erkannt werden wird, können auch Vorrichtungen hergestellt werden, die viele DPPIV-Substrat-Stellen enthalten, wobei die Menge von Substrat in den einzelnen Stellen so vorgesehen ist, daß ein quantitatives oder semiquantitatives Assay-Ergebnis produziert wird.
In noch einer anderen Ausführungsform des Testes kann die Anwesenheit oder Menge von DPPIV-Protein direkt ohne ein Messen der DPPIV-Aktivität nachgewiesen werden. Qualitative oder quantitative Immuno-Assays und Vorrichtungen können mit jedem geeigneten Anti- DPPIV-Antikörper (z. B. Anti-CD26-Antikörper (TA-1) Coulter Corporation, Miami, Florida oder so hergestellt wie in Fleischer B., CD26: A surface protease involved in T-cell activation, Immunology Today 15: 181-184 (1994) gezeigt, hergestellt werden. Sowohl polyklonale und monoklonale Antikörper können in Übereinstimmung mit Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind und verläßlich verwendet werden.
Es gibt verschiedene gut bekannte Immuno-Assay-Verfahren unter der Verwendung von Immuno-Reaktanten, wobei mindestens eine der Immuno-Reaktanten mit einer nachweisbaren Komponente markiert ist, um so analytisch identifizierbar zu sein. Zum Beispiel kann die "Sandwich-" oder "Zwei-Stellen-" Technik die Bildung eines ternären Komplexes zwischen einem Antigen-Analyten, wie z. B. DPPIV und zwei Antikörpern einschließen. Ein bequemes Verfahren zum Nachweis der Komplexbildung bei solch einer Technik ist es, einen markierten Antikörper und einen unmarkierten Antikörper zur Verfügung zu stellen, die an einen Festphasenträger gebunden sind, so daß der Komplex leicht isoliert werden kann. In diesem Beispiel ist die Menge von markiertem Antikörper, der mit der Festphase assoziiert ist, direkt proportional zu der Menge von Analyten in der Testprobe.
Eine alternative Technik ist der "kompetitive"-Assay. In einem Beispiel eines "kompetitiven"-Assays kann der Fangmechanismus wiederum einen Antikörper verwenden, der an eine nicht-lösliche feste Phase angebracht ist, wobei jedoch ein markiertes Reagenz (anders als ein markierter Antikörper) mit dem in der Testprobe vorhandenen Analyten um die Bindung an den imobilisierten Antikörper kompetitiv ist. Ähnlich kann ein immobilisiertes Reagenz mit dem Analyten von Interesse um einem markierten Antikörper kompetitiv sein. In diesen kompetetiven Assays ist die Menge von gefangenem markiertem Reagenz inversproportional zu der Menge von in der Probe vorhandenem Analyten.
Beispiele von Vorrichtungen, die auf diesen Prinzipien basieren, schließen die in den folgenden Patenten und Patentanmeldungen beschriebenen ein. Deutsch et al. beschreiben eine chromatographische Teststreifen-Vorrichtung im U. S. Pat. Nr. 4,094,647; 4,235,601 und 4,361,537. Die Vorrichtung umfaßt ein Material, das in der Lage ist, eine Lösung durch Kapillarkraft zu transportieren. Verschiedene Bereiche oder Zonen im Streifen enthalten die für die Durchführung eines Bindungs-Assays und zur Herstellung eines nachweisbarem Signals erforderlichen Reagenzien, wenn der Analyt zu oder durch diese Zonen transportiert wird. Die Vorrichtung ist für chemische Assays, sowie Bindungs-Assays geeignet, die durch die Bindungsreaktion zwischen einem Antigen und einem komplementären Antikörper typisiert sind.
Viele Variationsmöglichkeiten der Vorrichtung von Deutsch et al sind anschließend beschrieben worden. Zum Beispiel beschreiben Tom et al (U. S. Pat. Nr. 4,366,241) einen saugfähigen Träger mit einer immunsorbierenden Zone, die ein immobilisiertes spezifisches Bindungsmitglied enthält. Die Testprobe wird auf die immunsorbierende Zone aufgetragen und das Testergebnis wird an der immunsorbierenden Zone abgelesen.
Weng et al. (United States Patent Nr. 4,740,468 und 4,879,215) beschreiben ebenfalls eine Teststreifen-Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung eines Bindungs-Assays. Die Vorrichtung wird mit einer Testlösung verwendet, die die Testprobe enthält von der vermutet wird, daß sie den Analyten von Interesse enthält und einem markierten spezifischen Bindemitglied, das an den Analyten bindet. Greenquist et al (United States Patent Nr. 4,806,311 und 4,806,312) beschreiben eine Lagen-Assay-Vorrichtung zur Durchführung eines Bindungs-Assays ähnlich zu dem von Weng et al.
Der Begriff "Markierung", wie hier verwendet, betrifft jede Substanz, die sich direkt oder indirekt an ein anderes Bindemitglied Assay-Reagenz oder -Analyten anheftet, und das in der Lage ist, ein Signal zu erzeugen, das durch visuelle oder instrumentelle Mittel nachweisbar ist. Verschiedene geeignete Markierungen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können Chromogene, Katalysatoren, fluoreszierende Verbindungen, chemilumineszierende Verbindungen, radioaktive Markierungen, direkt sichtbare Markierungen, einschließlich kolloidalen, metallischen und nicht-metallischen Partikeln, Farbstoffpartikeln, Enzymen oder Substraten oder organischen Polymer-Latex-Partikeln, Liposomen oder andere Vesikel, die signalproduzierende Substanzen und ähnliches einschließen sein. Die Markierung kann sich indirekt an einen für DPPIV spezifischen Antikörper mittels zusätzlicher Liganden, wie zum Beispiel AvidinlBiotin anlagern. Zum Beispiel kann ein biotinylierter Antikörper ein Avidin/Markierungs-Reagenz binden, das an den biotinylierten Antikörper bindet, vor oder nachdem der Antikörper an DPPIV bindet.
Rosenstein (Veröffentlichung des Europäischen Patentamts Nr. 0 284 232) und Campbell et al (United States Patent Nr. 4,703,017) beschreiben Assays-Verfahren und Vorrichtungen zur Durchführung von spezifischen Bindungs-Assays, wobei die bevorzugte nachweisbare Markierung ein gefärbter Partikel ist, der aus einem Liposom besteht, das einen Farbstoff enthält. Bahar et al (United States Nr. 4,868,108) beschreiben ein Assay-Verfahren und -Vorrichtung zur Durchführung eines spezifischen Bindungs-Assays, wobei die Vorrichtung ein Träger mit vielen Zonen einschließt. Eisinger et al (United States Patent Nr. 4,943,522) beschreiben ein Assay-Verfahren und eine -Vorrichtung zur Durchführung von spezifischen Bindungs- Assays, wobei eine multi-Zonen großporige laterale Fließmembran verwendet wird, durch die eine Testprobe durch Kapillarkraft hindurch transportiert wird.
Hochstrasser (U. S. Pat. 4,059,407) beschreibt eine Tauchstäbchen-Vorrichtung, die für eine semi-quantitative Messung des Analyten in der Flüssigkeit in eine biologische Flüssigkeit eingetaucht werden kann. Die semi-quantitative Messung des Analyten wird durch Verwendung einer Serie von Reagenz-enthaltenden Flächen vervollständigt, wobei jede Fläche in der Serie in Anwesenheit einer ansteigenden Menge von Analyten eine nachweisbare Farbe produzieren wird (d. h. ein positives Ergebnis). Ebenfalls von Interesse im Bereich der Tauchstäbchen-Vorrichtung sind U. S. Pat. Nrn. 3,802,842; 3,915,639 und 4,689,309.
Grubb et al (U. S. Pat. Nr. 4,168,146) beschreiben die Verwendung eines porösen Teststreifenmaterials, an das ein Antigen-spezifischer Antikörper durch kovalente Bindung an den Streifen immobilisiert ist. Der Teststreifen wird in eine Lösung eingetaucht, von der vermutet wird, daß sie ein Antigen enthält und ein kapillares Wandern der Lösung den Teststreifen hinauf wird zugelassen. Variationen solch eines Teststreifens sind im U. S. Pat. Nr. 4,435,504 offenbart, die ein Zwei-Enzym-Indikator-System verwendet, U. S. Pat. Nr. 4,594,327, das die Zugabe eines Bindemittels zu Gesamtblutproben offenbart, was dazu führt, daß die roten Blutzellen in dem Bereich des Streifens angrenzend an die Luft/Flüssigkeit-Grenzfläche aggregieren, und US. Pat. Nr. 4,757,004, das ein Mittel zur Kontrolle der Form der Flüssigkeitsfront, die entlang des Teststreifens wandert, offenbart. Das Testprinzip ist weiterhin beschrieben in Zuk et al. Enzyme Immunochromatography - A Quantitative Immunoassay Requiring No Instrumentation, Clinical Chemistry, 31 (7): 1144-1150 (1985).
Weitere Beispiele von Streifen-Typ diagnostischen Vorrichtungen schließen die folgenden ein. Swanson et al (EP 088 636) beschreiben eine Vorrichtung zum quantitativen Nachweis eines Analyten, die ein flüssigkeits-durchlässiges, festes Medium einschließt, das eine vorgegebene Zahl von aufeinanderfolgend beabstandeten Reaktionszonen einschließt. Freisen et al (U. S. Patent Nr. 4,861,711) beschreiben eine Blattähnliche diagnostische Vorrichtung, die verschiedene funktionale Sektoren enthält, durch die die Probe hindurch passieren muss. Mindestens einer der Sektoren schließt ein immobilisiertes Reagenz ein, das eine biologische Affinität für den Analyten oder einen Analyten-Komplex aufweist.
Ebenfalls von Interesse in dem Bereich sind Tanswell et al. (United States Patent Nr. 4,642,930), Valkirs et al (United States Patent Nr. 4,727,019), Wolters et al (U. S. Patent Nr. 4,343,896) und Parikh et al (U. S. Patent Nr. 4,298,685), Gordon et al (U. S. Patent Nr. 4,956,302), Gordon et al (U. S. Patent Nr. 4,960,691) und Bolz et al (United States Patent Nr. 4,020,151).
Wie von dieser Beschreibung der möglichen Vorriehtungs-Formaten ersichtlich werden wird, gibt es eine signifikante Aktivität im Feld der Einweg-Testvorrichtungen. Es besteht ein wachsender Bedarf an Vorrichtungen, die wenige oder keine manipulativen Schritt benötigen, um den gewünschten Test durchzuführen, an Vorrichtungen, die durch relativ untrainiertes Personal verwendet werden können und an Vorrichtungen, die Ergebnisse zur Verfügung stellen, die nur minimal durch Variationen in der Weise, in der der Test durchgeführt wird, beeinträchtigt werden. Weitere Überlegungen sind die Einfachheit, mit der das erhaltene Nachweissignal beobachtet werden kann, sowie die Einfachheit mit der jede Signalsubstanz, die an der Nachweisstelle immobilisiert ist, von der Signalsubstanz, die durch die Nachweisstelle hindurchpassierte, unterschieden werden kann.
Die folgenden Testergebnisse beschreiben Dipeptidyl-Peptidase IV und CD13 Leucin/Neutrale Amino-Peptidase (LAP, E. C. N. 3.4.11.2) Messungen bei der Diagnose von EHGA. DPPIV und CD 13 LAP sind große Membran-assoziierte Proteine (ungefähr 100 kD), die in der Leber an Gallenkanälen und Gallen-Epithel, auf der Oberfläche von Darm-Epithel und einigen Nierenkanälchen, sowie auf Zellen hämatopoietischer Abstammung exprimiert werden.
Die Ergebnisse zeigen die Brauchbarkeit des DPPIV-Tests als ein Verfahren zum Nachweis von EHGA. Die Verwendung von Urin-DPPIV-Messungen sowie die physikalische Routineuntersuchung des Patienten und die Untersuchung von Stuhl und Urin auf Anzeichen von Gelbsucht stellt ein brauchbares Screening-Verfahren für EHGA zur Verfügung. Patenten mit hoher Urin-DPPIV-Aktivität können weiterhin auf Serumenzyme getestet werden. Die Zahl von EHGA-verdächtigen Patienten an diesem Punkt sollte gering genug sein, um die radiologische, Ultraschall- und histologische (Biopsie) Diagnostik-Kapazität von pediatrischen Krankenhäusern nicht zu überlasten, wodurch eine frühe Diagnose und Behandlung von EHGA sichergestellt wird.

Beispiele

Beispiel 1

Nachweis von DPPIV

DPPIV und LAP Aktivitäten wurden in Urin- und Serumproben von bekannten EHGA- Patienten gemessen. Die Tests wurden sechs Wochen vor der Operation durchgeführt. Die Patienten (durchschnittliches Alter: 8 Wochen) wurden auf Grund von persistenter Gelbsucht ins Krankenhaus eingeliefert. Alle der Fälle wurden histologisch durch Nadelbiopsien diagnostiziert.
Enzymaktivitäten wurden in 3-fachen Ansätzen bei 24ºC gemessen, indem 100u1 oder 50u1 Probe zu 100 ul oder 150 ul eines Reaktionspuffers (jeweils DPPIV oder LAP) der 200uM eines chromogenen Substrats in 0,10 M Tris-gepuffertem Triton X-100 (0,1% v/v) bei pH: 7 enthält. Die Substrate waren Gly-Pro-PNA (für DPPIV) und Leu-PNA für LAP (beide Materialien sind käuflich erhältlich von Bachem, San Diego, CA).
Die Gemische wurden für 30 Minuten in 96-Tüpfel-Mikroplatten inkubiert. Die Ablesungen der optischen Dichten wurden 4 mal während der Inkubation mit einem 405 nm Filter in einem ELISA-Lesegerät, gemäß den Anweisungen des Herstellers, aufgenommen. Die Enzym- Aktivität wurde in nmol/min/ml, basierend auf der Progressions-Kurve, die von den Konzentrationen von hydrolysiertem Substrat berechnet wurde, ausgedrückt. Gereinigtes DPPIV kann auch als eine positive Kontrolle verwendet werden, gegen die die DPPIV-Testergebnisse zu vergleichen sind. Gereinigtes DPPIV kann in Übereinstimmung mit dem Verfahren beschrieben in Bristol et al. J. Immunol. 149: 367-372 (1992) hergestellt werden. Reaktionspuffer ohne Substrat diente als Negativ-Kontrolle. Die Negativ-Kontrolle zeigte keinen Anstieg in der Konzentration von hydrolysiertem Substrat, was darauf hindeutete, daß die Substrate in dem Test stabil waren.
50 gesunde Freiwillige stellten Urinproben für die anfänglichen Kontrolluntersuchungen zur Verfügung. Alle Freiwilligen wurden auf Kreatinin im Urin getestet und zeigten normale Werte. Urin-Enzym-Aktivitäten wurden aufgrund des sehr niedrigen Levels der im normalen Urin vorhandenen Enzym-Aktivität nicht korrigiert. Zusätzlich zu den gesunden Freiwilligen wurden Urin- und Blutproben von fünf gesunden gleichaltrigen Neugeborenen gesammelt (mit Zustimmung der Eltern). Zum Vergleich mit EHGA-Patienten wurden LAP und DPPIV- Messungen an Serum- und Urinproben bei vier Neugeborenen mit Gelbsucht aufgrund von ABO Inkompatibilität und 16 Kindern (durchschnittliches Alter: 9,5 Jahre) mit viraler Hepatitis durchgeführt. Die Routine-Labortests schlossen GTP, GOT, γGT, AP und Bilirubin- Messungen ein. Die statistische Analyse wurde mit dem Sigma-Plot 5,0 (Jandel Scientific Corporation, San Rafael, CA) durchgeführt.
Die Urin-, DPPIV- und LAP-Aktivität der 50 normal jungen Freiwilligen (durchschnittliches Alter: 27 Jahre) waren jeweils 0,199 + 0,224 nmol/min/ml und 0,078 ± 0,272 nmol/min/ml. Die vier Urinproben von gleichaltrigen Kontrollen zeigten keine oder ähnlich nachweisbare Äktivität (0,06 + 0,05 nmol/min/ml für DPPIV und 0,820 ± 0,215 nmol/min/ml für LAP). Die EHGA-Patienten wiesen 6,927 ± 3,45 nmol/min/ml und 8,52 ± 13,05 nmol/min/ml Urinaktivitäten für jeweils DPPIV und LAP auf, wobei DPPIV sich signifikant (p < 0,05) von der Kontrolle unterschied. Fig. 1 zeigt die Urin-DPPIV-Aktivität von gleichaltrigen Kontrollen und EHGA-Patienten. Messungen in der EHGA-Gruppe wurden sechsmal durchgeführt. Die Zahl von Patienten in jeder Gruppe ist angegeben (Urinproben von zwei Patienten wurden zweimal gemessen). Die horizontalen Balken zeigen den Standardfehler an. Ein einzelner hoher Wert (über 15 nmol/min/ml) der LAP-Aktivität ist außerhalb des Bereiches der Figur.
Wenn die Serum DPPIV-Aktivität zwischen den Kontrollen und den verschiedenen Erkrankungsgruppen verglichen wurde (Fig. 2) wurde klar, daß die EHGA-Patienten eine signifikant höhere DPPIV-Aktivität (p < 0,05) als normal aufwiesen, sowie auch eine höhere DPPIV- Aktivität als Patienten mit Gelbsucht auf Grund von ABO Inkompatibilität. Virale Hepatitis- Patienten stellten zwei Gruppen dar; eine mit Werten so niedrig wie die Kontrolle (7 von 16 Patienten) und eine andere mit DPPIV-Aktivität (24-60 nmol/min/ml) so hoch wie die EHGA-Patienten. Im Vergleich zu den Kontrollen war die LAP-Aktivität signifikant erhöht (p < 0,05) in Hepatitis-Patienten und leicht erhöht in drei der vier EHGA-Patienten. Fig. 3 zeigt die Serum LAP-Aktivitäts-Messungen. Ein Vergleich der normalen Kontrolle und der verschiedenen Erkrankungsgruppen ist gezeigt. Messungen in der EHBA-Gruppe wurden siebenmal durchgeführt. Die Zahl von Patienten in jeder Gruppe ist angegeben und die horizontalen Balken zeigen die Standardabweichung an.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Urin-Messung der DPPIV-Aktivität ein Verfahren zum Screening auf EHGA zur Verfügung stellt. DPPIV-Level von mindestens 1-3 nmol/min/ml zeigen EHGA an. Erhöhte DPPIV-Level in Serum, wenn mit LAP und anderen Enzymen verglichen, weisen einen potentiell unterschiedlichen diagnostischen Wert auf, z. B. sind GPT- und LAP-Aktivitäten in viraler Hepatitis höher als bei EHGA-Patienten (Daten nicht gezeigt).
CD26, DPPIV und CD 13 LAP sind große Membran-assoziierte Proteine (ungefähr 100 kD), die in der Leber auf Gallenkanälchen und Gallenepithel, auf der Oberfläche von Darmepithel und auf einigen Nierenkanälchen, sowie auf Zellen hematopoietischer Abstammung exprimiert werden. Die im Serum vorhandenen Enzyme sind möglicherweise prozessierte Formen und weisen höchstwahrscheinlich erheblich geringere molekulare Massen auf Erhöhte Serum-Level zeigen eine gute lineare Korrelation mit erhöhten Urin-Leveln für beide Enzyme (rLAP = 0,843, rDPPIV = 0,87), was darauf schließen läßt, daß das Serum-Enzym filtriert werden kann oder daß es in dem Urin sekretiert wird. Weil beide Enzyme in Nierenkanälchen exprimiert werden, können urinäre Infektionen ein differenzielles diagnostisches Problem darstellen, wenn hohe Level an DPPIV oder LAP im Urin gemessen werden.

Beispiel 2

DPPIV-Tauchstäbchen-Test

Ein chromogenes Substrat, wie zum Beispiel Gly-Pro-PNA, wird auf einem Streifen oder Filterpapier aufgebracht und getrocknet. Die Menge von Substrat kann so ausgewählt werden, daß die Reaktion mit DPPIV eine visuell nachweisbare Reaktion ergeben wird, z. B. ungefähr 80 nmol/cm² von Substrat/Reaktionsstelle können verwendet werden. Die Spitze des Papiers wird anschließend mit einer Urinprobe in Kontakt gebracht. Wenn die Testprobe DPPIV enthält, reagiert das Substrat mit dem DPPIV und ergibt eine nachweisbare Farbveränderung.

Beispiel 3

DPPIV-Teststreifen-Test

Ein chromogenes Substrat (Gly-Pro-PNA, 80 nmol/cm²) wird auf eine oder mehrere getrennte Zonen in Form von Balken über die Weite eines verlängerten Streifens Filterpapier aufgetragen und getrocknet. Die Spitze des Papiers wird anschließend mit einer flüssigen Testprobe, wie zum Beispiel Serum oder Urin, in Kontakt gebracht. Die Probe fließt durch die Dochtwirkung durch den Teststreifen, wodurch sie mit dem isolierten Substrat in Kontakt kommt. Wenn die Testprobe DPPIV enthält, reagiert das Substrat mit dem DPPIV und ergibt eine nachweisbare Farbveränderung in einer oder mehrerer der Nachweiszonen. Durch variieren der Menge des in den einzelnen Zonen vorhandenen Substrats kann die Produktion eines nachweisbaren Signals quantitativ sein.

Beispiel 4

DPPIV-Teststreifen-Vorrichtung

In der vorliegenden Erfindung können Bindetests die spezifische Bindung von DPPIV und/oder einem Indikator-Reagenz (das eine Markierung direkt oder indirekt, angebracht an einem für DPPIV spezifischen Antikörper, umfaßt) an ein Fangreagenz (das einen zweiten Anti-DPPIV-Antikörper umfaßt) einschließen. Das Fangreagenz immobilisiert DPPIV auf einem chromatographischen Material oder verlangsamt zumindest die Wanderung des Analyten oder Indikator-Reagenz durch das chromatographische Material.
Die Markierung, wie oben beschrieben, erlaubt es dem Indikator-Reagenz, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, das mit der Anwesenheit oder Menge des Analyten in der Testprobe zusammenhängt. Die Auswahl eines bestimmten Markers ist nicht wichtig, jedoch wird der Marker in der Lage sein, ein nachweisbares Signal entweder selber, wie z. B. ein visuell nachweisbares Signal, das durch angefärbte anorganische-Polymerlatex Partikel erzeugt wird oder in Zusammenhang mit einem oder mehreren zusätzlichen signalproduzierenden Verbindungen, wie z. B. einem Enzym/Substrat signalerzeugenden System, zu erzeugen.
Das Fangreagenz wird in dem DPPIV-Test dazu verwendet, um die Beobachtung des nachweisbaren Signals zu erleichtern, indem DPPIV und/oder das Indikator-Reagenz von den anderen Testreagenzien und den verbleibenden Komponenten der Testprobe im wesentlichen getrennt wird. Typischerweise wird das Fangreagenz auf dem chromatographischen Material immobilisiert, um eine "Fangstelle" zu bilden, d. h. eine Region auf dem chromatographischen Material, die eine oder mehrere Fangreagenzien aufweist, die nichtdiffundierbar daran angebracht sind.
Die Testvorrichtung kann ein chromatographisches Material auch einschließen, das ein proximales Ende und ein distales Ende aufweist, wobei die Testprobe von dem proximalen Ende zu dem distalen Ende durch Kapillarkraft wandern kann. Das chromatographische Material enthält das Fangreagenz, d. h. Anti-DPPIV-Antikörper, das an einer Fangstelle immobilisiert ist und das in der Lage ist, an DPPIV zu binden. Eine optionale Testproben- Auftragungsfläche kann in Fließverbindung mit dem proximalen Ende des chromatopographischen Materials zur Verfügung gestellt werden. Die Auftragungsfläche kann dazu verwendet werden, um die Testprobe aufzunehmen und die Probe an das chromatographische Material weiterzugeben. Die Auftragungsfläche kann ggf. ein diffundierbares Indikator-Reagenz enthalten, das in der Lage ist von der Auftragungsfläche zu dem chromatographischen Material zu wandern. Das Indikator-Reagenz ist bevorzugterweise in der Lage, an DPPIV zu binden, z. B. ein markierter zweiter Anti-DPPIV-Antikörper. Die Bindung des Indikator-Reagenz an DPPIV führt zu der Bildung eines ternären oder Sandwich-Komplexes und einem nachweisbaren Signal an der Fangstelle, wodurch die Anwesenheit oder Menge von DPPIV in der Testprobe angezeigt wird.
Das Fangreagenz kann auf oder in dem chromatographischen Material in einer Vielzahl von Anordnungen positioniert werden. In alternativen Ausführungsformen kann das Fangreagenz in jedem Muster, das zum Nachweis geeignet ist, verteilt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Balken, Streifen, Zahlen, Buchstaben, Flecken und Symbolen, wie zum Beispiel "+/-", "%" oder ähnliches wie ein nachweisbares Signal nach Vervollständigung des Tests zeigen.
Das Testverfahren wird leicht durchgeführt, indem eine Testprobe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, auf die Auftragefläche plaziert wird, wodurch sie mit dem Indikator-Reagenz in Kontakt kommt. Die Testprobe und das Indikator-Reagenz werden auf chromatographische Material transferiert und wandern durch das chromatographische Material. um mit dem Fangreagenz in Kontakt zu kommen, was zu der Produktion eines nachweisbaren Signals an der Fangstelle führt.
Die vorhergehenden Beschreibungen der spezifischen Ausführungsformen zeigen die allgemeine Natur und Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung so vollständig, daß Andere solche spezifischen Ausführungsformen leicht modifizieren, anpassen und/oder optimieren können, um eine Auswahl von Testvorrichtungen und Verfahren unter der Verwendung einer Vielzahl von Reagenzien und Materialien zu erhalten, ohne sich von dem vorliegenden erfinderischen Konzept zu entfernen. Alle diese Modifikationen und Anpassungen sind als von der Bedeutung und dem Äquivalenzsbereich dieser Erfindung umfaßt gedacht. Es soll ebenfalls verstanden werden, daß der Ausdruck und die Terminologie, die hier verwendet wird, zum Zweck der Beschreibung und nicht der Begrenzung gedacht ist.

Claims

1. Verfahren zur Evaluierung der Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt von:

a) In Kontakt bringen einer Testprobe mit einem Proteasesubstrat, das mit Dipeptidyl- Peptidase IV reaktiv ist, wodurch eine Reaktion gestartet wird; und

b) Nachweisen der Reaktion von dem Substrat oder der Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts wobei die Reaktion oder Anwesenheit des Reaktionsprodukts sich aus der Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV in der Testprobe ergibt und eine extrahepatische Gallenatresie anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat ein chromogenes Substrat ist, und die Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV durch die Produktion eines farbigen Reaktionsprodukts angezeigt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Xaa-Pro-para-nitro-analid und Xaa-Pro-Coumann, worin Xaa jede natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäure ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Substrat Gly-Pro-para-nitro-analid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend den Schritt von zuerst Bindung der Dipeptidyl-Peptidase IV der Testprobe an einen anti-Dipeptidyl-Peptidase IV- Antikörper.

6. Test zur Evaluierung der Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie, wobei der Test die Schritte umfaßt von:

a) In Kontakt bringen der Testprobe mit einem ersten Antikörper, der spezifisch für Dipeptidyl-Peptidase IV ist, wodurch eine Antikörper-gebundene Dipeptidyl-Peptidase IV hergestellt wird;

b) In Kontakt bringen der Antikörper-gebundenen Dipeptidyl-Peptidase IV mit einem Nachweis-Reagenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Proteasesubstrat, einem markierten zweiten Antikörper, der spezifisch für Dipeptidyl-Peptidase IV ist und einem zweiten Antikörper, der spezifisch für Dipeptidyl-Peptidase IV ist, der indirekt einen nachweisbaren Marker bindet, wodurch ein nachweisbares Reaktionsprodukt gebildet wird; und

c) Nachweis der Bildung des nachweisbaren Reaktionsprodukts, das sich aus der Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV in der Testprobe ergibt, wobei die Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV extrahepatische Gallenatresie anzeigt.

7. Test nach Anspruch 6, wobei das Nachweisreagenz ein Proteasesubstrat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Xaa-Pro-para-nitro-analid und Xaa-Pro- Coumann, worin Xaa jede natürlich vorkommende oder synthetische Aminosäure ist.

8. Test nach Anspruch 6, wobei das Nachweisreagenz ein markierter anti-Dipeptidyl- Peptidase IV Antikörper ist.

9. Test nach Anspruch 6, wobei der erste Antikörper an einer isolierten Stelle von einem Eintauch-Teststäbchen oder Teststreifen immobilisiert ist.

10. Verfahren zur Evaluierung der Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie, umfassend: Testen einer Urinprobe auf die Menge von Dipeptidyl-Peptidase IV in der Testprobe, wobei die Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV in einer Menge von mindestens 1 nmol/min/ml extrahepatische Gallenatresie anzeigt.

11. Verfahren zur Evaluierung der Wahrscheinlichkeit von extrahepatischer Gallenatresie, umfassend: Testen einer Serumprobe auf die Menge von Dipeptidyl-Peptidase IV in der Testprobe, wobei die Anwesenheit von Dipeptidyl-Peptidase IV in einer Menge von mindestens 15 nmol/min/ml extrahepatische Gallenatresie anzeigt.