CN102818866B - 用于新生儿胆道闭锁的诊断标记物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血清牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用，所述的医疗器械的诊断标记物为血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值。本发明还提供鹅去氧胆酸的应用。本发明优点在于：首次提出牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为胆道闭锁诊断标记物的应用，可用于区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病，为患儿争取最佳手术时间，提高手术疗效。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，是用于诊断新生儿胆道闭锁，区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病（包括婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎和胆总管囊肿）的诊断标记物的应用。
背景技术
胆道闭锁（Biliary atresia，BA）是一种破坏性的新生儿胆管炎症纤维阻塞，影响着不同长度的肝内和肝外胆管，是新生儿阻塞性黄疸最主要原因，也是小儿肝移植最主要原因，40-50%儿童肝移植是由此引起的。
肝门空肠吻合术（Kasai根治术）是胆道闭锁的首选治疗方案。手术时间对于Kasai手术的疗效有很大影响。研究发现，在出生后60天内进行Kasai手术，其术后黄疸消失率和五年的自体肝生存率显著升高，对肝移植的需求显著降低。
由于缺乏有效的诊断标记物，患儿通常需要经过长时间的复杂诊断才能确诊，延误了最佳手术时间。不明原因的婴儿肝炎综合征是干扰胆道闭锁确诊的主要疾病。巨细胞病毒感染在胆道闭锁患儿中普遍存在，导致直接胆红素升高的巨细胞病毒性肝炎也是胆道闭锁诊断的干扰因素。胆道闭锁患儿需要尽早诊断，与婴儿肝炎综合征和病毒性肝炎区分。
临床研究发现，胆道闭锁的血清总胆汁酸含量升高，但是该指标不能将胆道闭锁和其他的婴儿胆汁淤积疾病以及病毒性肝炎区分。最近的出版物公开了血清蛋白APOC2作为胆道闭锁的诊断标记物，区分胆道闭锁和婴儿肝炎综合征（H. Wang 等，2010，J Pediatr Gastroenterol Nutr., 50(4):411-6； Z. Song 等，2012，J Pediatr Gastroenterol Nutr.）。迄今为止的报道证明了用于区分胆道闭锁诊断和婴儿肝炎综合征的诊断标记物的重要。
中国专利文献CN101221129B公开了磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒，适用于肝胆疾病的快速筛查和诊断，尤其适用于新生儿期黄疸、先天性胆道闭锁症的早期发现。但是关于用于新生儿胆道闭锁的诊断标记物目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供血清牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用。
本发明的再一的目的是，提供血清鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：血清牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用，所述的医疗器械的诊断标记物为血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值。
所述的医疗器械的诊断阙值是血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值1610，当牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值大于1610时，诊断为新生儿胆道闭锁。
所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是血清。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：血清鹅去氧胆酸作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用，所述的医疗器械的诊断标记物为血清中鹅去氧胆酸的含量。
所述的医疗器械的诊断阙值是血清中鹅去氧胆酸的含量0.024μmol/L，当血清中鹅去氧胆酸的含量小于0.024μmol/L时，诊断为新生儿胆道闭锁。
所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是血清。
本发明优点在于：
首次提出牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸作为胆道闭锁诊断标记物的应用，可用于区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病，为患儿争取最佳手术时间，提高手术疗效。
附图说明
附图1是血清胆汁酸检测总离子流图。A为标准品检测的总离子流图；B为胆道闭锁患儿血清胆汁酸检测的总离子流图。
附图2是牛磺鹅去氧胆酸/鹅去氧胆酸（TCDC/CDC）在胆道闭锁、其它婴儿胆汁淤积疾病、高胆红素血症和正常婴儿血清中含量。
附图3是鹅去氧胆酸（CDC）在胆道闭锁、其它婴儿胆汁淤积疾病，高胆红素血症和正常婴儿血清中含量。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明涉及用于诊断新生儿胆道闭锁，以及区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病（包括婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎和胆总管囊肿）的诊断标记物。
人体血液中的主要胆汁酸包括胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、石胆酸、甘氨石胆酸、牛磺石胆酸。通过胆道闭锁、婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎和胆总管囊肿中14种主要胆汁酸（胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、石胆酸和牛磺石胆酸）丰度和相互关系的比较分析，与婴儿肝炎综合征、巨细胞病毒性肝炎和胆总管囊肿比较的特征性丰度和特征性关系，即是胆道闭锁的重要指标，可用作胆道闭锁的诊断标记物。
为了鉴定这些胆汁酸的差异，血清样品来自胆道闭锁婴儿术前血21例，其它婴儿胆汁淤积（包括婴儿肝炎综合征11例、巨细胞病毒性肝炎8例、和胆总管囊肿2例），高胆红素血症16例和正常对照21例。甲醇沉淀后的血清样品通过高效液相色谱-串联质谱定量检测，定量了每种胆汁酸的丰度。有些胆汁酸在胆道闭锁中含量更高，而有些以明显较低的丰度存在。
一、材料和方法
1.血清样品采集和处理：
收集1ml新鲜血样于无抗凝剂的采血管中，室温静置2小时后，3000rpm离心10分钟后，取上层血清。取50μl血清样品，加入含0.25μM的甲醇150μl，剧烈震荡5分钟，然后16000g离心15分钟，取上清。
2.标准品：
活性碳脱盐的血清样品作为溶剂，加入不同浓度的胆汁酸标准品制作标准曲线，各胆汁酸（胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、鹅去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、脱氧胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、熊去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、石胆酸和牛磺石胆酸）的浓度分别为：5nM、10nM、20nM、40nM、100nM、400nM、2μM、10μM和50μM。
3.高效液相色谱-串联质谱分析：
如表1所示，设定串联质谱的检测模式，高效液相色谱的程序如表2所示，进行质谱分析。上样量为10μl。色谱柱采用Luna C18 column （50×2.0mm，粒径 3μm）；流动相A为0.012%蚁酸，5mM乙酸铵溶于水；流动相B为0.012%蚁酸，5mM乙酸铵溶于97:3的乙腈/水溶液。
表1：胆汁酸质谱检测参数
| 母离子[m/z] | 子离子 [m/z] | DP | CE | CXP | |
| 石胆酸 | 375,2 | 375,2 | -135 | -54 | -9 |
| 熊去氧胆酸 | 391,2 | 391,2 | -140 | -46 | -5 |
| 鹅去氧胆酸 | 391,2 | 391,2 | -140 | -44 | -8 |
| 脱氧胆酸 | 391,2 | 391,2 | -140 | -54 | -9 |
| 胆酸 | 407,2 | 343,3 | -145 | -44 | -5 |
| d4-胆酸 | 411,3 | 347,3 | -125 | -48 | -6 |
| 甘氨熊去氧胆酸 | 448,2 | 73,9 | -140 | -68 | -1 |
| 甘氨鹅去氧胆酸 | 448,2 | 73,9 | -105 | -50 | -10 |
| 甘氨脱氧胆酸 | 448,2 | 73,9 | -130 | -78 | -11 |
| 甘氨胆酸 | 464,2 | 73,9 | -140 | -68 | -11 |
| 牛磺胆酸 | 482,2 | 79,9 | -135 | -112 | -1 |
| 牛磺熊去氧胆酸 | 498,2 | 79,9 | -175 | -120 | -1 |
| 牛磺鹅去氧胆酸 | 498,2 | 79,9 | -195 | -110 | -1 |
| 牛磺脱氧胆酸 | 498,2 | 79,9 | -195 | -105 | -1 |
| 牛磺胆酸 | 514,2 | 80,0 | -165 | -115 | -11 |
DP（declustering potential）：解簇电压；CE（collision energy）：碰撞能量；CXP （collision cell exit potential）：碰撞室出口电压。
表2：HPLC程序
| 时间 | 流动相B |
| 0 | 31.50% |
| 3.3 | 50% |
| 6 | 50% |
| 6.2 | 100% |
| 8 | 100% |
| 12 | 31.50% |
二、结果
1.牛磺鹅去氧胆酸/鹅去氧胆酸（TCDC/CDC）作为胆道闭锁诊断标记物的应用
请参照附图2，附图2是牛磺鹅去氧胆酸/鹅去氧胆酸（TCDC/CDC）在胆道闭锁、其它婴儿胆汁淤积疾病、高胆红素血症和正常婴儿血清中含量。其中1为胆道闭锁，2为其它婴儿胆汁淤积，3为高胆红素血症，4为正常婴儿。在胆道闭锁婴儿中，血清TCDC/CDC的均值为3407，最大值为6589，最小值为1634；在其它胆汁淤积患儿中，血清TCDC/CDC的均值为839，最大值为1904，最小值为67；在高胆红素血症婴儿中，血清TCDC/CDC的均值为98，最大值为180，最小值为21；在正常婴儿中，血清TCDC/CDC的均值为5.1，最大值为16，最小值为0.21。取TCDC/CDC值大于1610，得到胆道闭锁诊断的灵敏度为100%，特异性为95.2%。血清中的这个比值，胆道闭锁患儿是婴儿肝炎综合征患儿的3.9倍，胆道闭锁患儿是巨细胞病毒性肝炎患儿的4.1倍，胆道闭锁患儿是胆总管囊肿患儿的100倍。因此，这个比值相对于其他胆汁淤积疾病的上调，被优选研究作为胆道闭锁的特征性指标。
2.血清鹅去氧胆酸作为胆道闭锁的诊断标记物的应用
请参照附图3，附图3是鹅去氧胆酸（CDC）在胆道闭锁、其它婴儿胆汁淤积疾病，高胆红素血症和正常婴儿血清中含量。其中1为胆道闭锁，2为其它婴儿胆汁淤积，3为高胆红素血症，4为正常婴儿。在胆道闭锁婴儿中，血清CDC的均值为0.018μmol/L，最大值为0.048μmol/L，最小值为0.005μmol/L；在其它胆汁淤积患儿中，血清CDC的均值为0.091μmol/L，最大值为0.53μmol/L，最小值为0.020μmol/L；在高胆红素血症婴儿中，血清CDC的均值为0.089μmol/L，最大值为0.27μmol/L，最小值为0.009μmol/L；在正常婴儿中，血清CDC的均值为0.34μmol/L，最大值为2.1μmol/L，最小值为0.005μmol/L。胆道闭锁患儿血清鹅去氧胆酸丰度比婴儿肝炎综合征下调了5.4倍，比巨细胞病毒性肝炎下调了4.3倍，比胆总管囊肿下调了1.9倍。因此，胆道闭锁血清鹅去氧胆酸含量相对于其他婴儿胆汁淤积疾病的下调，被优选作为胆道闭锁的特征性指标。取血清中鹅去氧胆酸的含量小于0.024μmol/L，得到胆道闭锁诊断的灵敏度为85.7%，特异性为90.5%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械的诊断阙值是血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值1610，当牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量比值大于1610时，诊断为新生儿胆道闭锁。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是血清。
4.血清中鹅去氧胆酸的含量作为诊断标记物在制备诊断新生儿胆道闭锁的医疗器械中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械的诊断阙值是血清中鹅去氧胆酸的含量0.024μmol/L，当血清中鹅去氧胆酸的含量小于0.024μmol/L时，诊断为新生儿胆道闭锁。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的医疗器械是诊断试纸或试剂盒，所述的医疗器械的诊断样品是血清。
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