CN113533596A - 基于新生儿血斑代谢物的胆道闭锁早期筛查标志物及其应用 - Google Patents
基于新生儿血斑代谢物的胆道闭锁早期筛查标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了生物标志物的用途，其特征在于：所述生物标志物选自如下特定生物标志物中的一种或几种：A.谷氨酸(Glutamicacid)；B.吲哚乙酸(Indoleaceticacid)；C.α‑酮异戊酸(alpha‑Ketoisovalericacid)；D.酮亮氨酸(Ketoleucine)；E.2‑羟基戊二酸(2‑hydroxyglutaricacid)；F.牛磺猪胆酸(THCA)；G.牛磺胆酸(TCA)；H.甘氨胆酸(GCA)；所述用途：用于制备检测新生儿胆道闭锁早期风险筛查试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及医疗领域，具体地，涉及一种基于新生儿血斑代谢物的胆道闭锁早期筛查标志物、用途及其筛选方法。
背景技术
胆道闭锁(Biliary atresia，BA)是婴幼儿时期的一种胆汁淤积性疾病，其特征为肝内外胆管进行性炎症、梗阻及快速肝纤维化，已成为小儿肝移植最主要原因[Hartley JL等，胆道闭锁。柳叶刀,2009,374(9702):1704-1713]。胆道闭锁发病率为1:8000-1:18000个存活出生婴儿，以亚洲报道的病例为多，我国胆道闭锁发病率约为西方国家的4-5倍[SokolRJ等，儿科胃肠病学与营养学,2003,37(1):4-21；Sanchez-Valle等。胆道闭锁：流行病学、遗传学、临床进展及公共卫生。儿科前沿,2017,64(1):285-305]。在出生后60天内行肝门空肠吻合术(Kasai术)对胆道闭锁治疗效果好，术后黄疸消失率和5年自体肝生存率显著升高[Song Z等。对行Kasai手术时年龄小于60天的不同病因胆道闭锁婴儿预后的回顾性研究。医学(巴尔的摩)，2017,96(26):e7267]。由于缺乏有效的早期诊断标记物，患儿往往在60天内不能进行Kasai术，错过了最佳手术时间，导致了患儿预后差及生存率低下。胆道闭锁患儿早期的临床表现与其它婴幼儿胆汁淤积疾病存在重叠性，鉴别诊断困难且复杂，往往依赖肝活检和十二指肠管检查，而这些检查涉及的手术给患儿带来额外伤害。因此探索简单有效的诊断生物标志物对胆道闭锁的早期筛查和后续有效诊治具有重要意义。
目前诊断胆道闭锁潜在标志物有：①血清胆红素。新生儿血清总胆红素>2.0mg/dL或直接胆红素>1.0mg/dL满足胆道闭锁排查条件，但对于诊断胆道闭锁稳定性和特异性差[Sanjiv Harpava等，直接或结合胆红素筛查新生儿胆道闭锁的诊断率，美国医学会杂志，2020，323(12):1141-1150]；②血清谷氨酰转移酶(GGT)。胆道闭锁患儿GGT血清含量明显高于其他胆汁淤积疾病患儿，但血清GGT在不同年龄患儿之间差异较大，诊断胆道闭锁准确性受限。[Chen X等，GGT与年龄结合诊断胆道闭锁的价值。儿科胃肠病学与营养学，2016,63(3):370-373]；③血清基质金属蛋白酶-7(MMP7)。胆道闭锁患儿MMP7血清含量明显高于健康患儿，但剂盒抗体效价，诊断阈值不统一，不能很好区分胆道闭锁与其他婴幼儿胆汁疾病，特异性受限[Yang L等，血清基质金属蛋白酶-7对胆道闭锁的诊断价值，2018，68(6):2069-2077；.Hung TM等，一种新的、拥有多种功能的物质-基质金属蛋白酶-7可以增加肝硬化风险。肝病学杂志，2009,50(4):1184-1193]。另外，这些潜在诊断标志物都依赖于对婴幼儿进行抽血，风险高，实际操作比较困难，不能作为新生儿筛查标志物。
为了克服上述问题，在现有技术的研究中发现仍旧存在各种问题：
例如：现有技术中通过比较胆道闭锁及淤胆型婴儿肝炎综合征患儿的血清microRNA表达谱的差异，用于胆道闭锁的诊断，但microRNA不稳定容易降解。
还如：现有技术公开了磺酸化胆汁酸酶荧光毛细分析法及酶荧光定量试剂盒，适用于适用于新生儿期黄疸早期发现，但存在区分婴幼儿黄疸疾病亚型困难的问题。
还如：现有技术公开了血清中牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸的比值作为新生儿胆道闭锁的诊断标志物，但区分胆道闭锁和其它婴儿胆汁淤积疾病特异性不高。
另外，现有的胆道闭锁潜在诊断标志物都依赖于大量血清。对症状不明显的新生儿或婴幼儿进行抽血可行性差且风险高。症状明显的患儿抽血检测往往错过了最佳治疗窗口期，不能进行新生婴儿早期筛查。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，探索便捷、可靠的能够评估新生儿胆道闭锁风险的方法或途径，为临床新生儿胆道闭锁快速、高效地筛查和诊断提供可行方案。
在本发明中提出，基于新生儿出生血斑，通过检测胆道闭锁患儿及对照婴儿出生血斑中的代谢物，筛选出8种差异代谢物Glutamic acid，Indoleacetic acid,alpha-Ketoisovaleric acid,Ketoleucine,2-hydroxyglutaric acid,Taurohyocholic acid(THCA),Taurocholic acid(TCA)和glycocholic acid(GCA)。胆道闭锁血斑代谢物Glutamic acid(93.99±26.77μmol/Lvs.62.45±15.47μmol/L,p<0.0001)、2-Hydroxyglutaric acid(14.84±5.743μmol/Lvs.9.955±2.668μmol/L,p＝0.0007)、THCA(1.332±1.289μmol/Lvs.0.3305±0.3538μmol/L，P<0.0001)、TCA(4.345±4.035μmol/Lvs.1.152±1.024μmol/L，P＝0.0013)和GCA(4.56±4.641μmol/Lvs.0.9019±0.9208μmol/L，P<0.0001)的含量较对照患儿血斑中的含量显著性升高.代谢物Ketoleucine(9.154±4.884μmol/Lvs.17.66±7.438μmol/L，P<0.0001)、Indoleacetic acid(0.8005±0.4069μmol/Lvs 1.31±0.5501μmol/L,P＝0.0004)和alpha-Ketoisovaleric(0.7514±0.7646μmol/Lvs.1.691±0.9263μmol/L,P<0.0001)在胆道闭锁血斑中的含量显著性低于对照患儿组。代谢物Glutamic acid AUC达到0.861(95％CI＝(0.769-0.9529)，取截断值78.25μmol/L，其灵敏度达到84％(75.32％-90.57％)，特异性达到76.2％(52.83％-91.78％)。代谢物THCA AUC达到0.8519(95％CI＝(0.7347-0.9692)，取截断值78.25μmol/L，其灵敏度达到89％(81.17％-94.38％)，特异性达到81％(58.09％-94.55％)。Glutamic acid与THCA代谢物联合AUC达到0.906(95％CI＝(0.81-1)，取截断值-1.097，其灵敏度达到93％(69.9％-98.8％)，特异性达到90.7％(86％-97.1％)。8种差异代谢物联合AUC达到0.945(95％CI＝(0.878-1)，取截断值>-1.109，其灵敏度达到91％(83.6％-95.8％)，特异性达到90.5％(69.62％-98.83％)。可见新生儿干血斑中的代谢物的含量可以作为新生儿胆道闭锁风险评估的标志物是可靠的，提供了新的胆道闭锁新生儿筛选方法和标志物，有助于早期诊断率，减少误诊，提高胆道闭锁自身肝脏生存率。
本发明提供了一类生物标志物的用途，其特征在于：
上述生物标志物选自如下特定生物标志物中的一种或几种：
A.谷氨酸(Glutamic acid)；
B.吲哚乙酸(Indoleacetic acid)；
C.α-酮异戊酸(alpha-Ketoisovaleric acid)；
D.酮亮氨酸(Ketoleucine)；
E.2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid)；
F.牛磺猪胆酸(THCA)；
G.牛磺胆酸(TCA)；
H.甘氨胆酸(GCA)；
上述用途：
用于制备检测新生儿胆道闭锁的试剂盒。
进一步地，本发明提供的生物标志物的用途，其特征还在于：
包含血斑内代谢物定量检测试剂；
所述血斑内代谢物定量检测试剂包括A-H 8种差异代谢物代谢物质控品、内标准品、分散体系有机溶剂和血斑棉滤纸；
其中，所述分散体系有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇和乙腈中之一种或几种的组合。
进一步地，本发明提供的生物标志物的用途，其特征还在于：
用所述试剂盒评估新生儿胆道闭锁风险的试剂盒的方法为：
S1.获取新生儿出生后3-4天足底的离体血斑样本；
S2.通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱定量测定血斑样本中代谢物标志物的表达水平；
S3.分析血斑中差异代谢物的表达水平以进行风险评估，分析结合差异代谢物的准确性、灵敏性、特异性及截断值，选用1种或者多种差异代谢物的组合来对检测对象胆道闭锁风险高低进行评估；
或选用1种或者多种差异代谢物以及任选地联合其他直接或间接对新生儿胆道闭锁有诊断能力的指标之一种或几种的组合来对检测对象胆道闭锁风险高低进行评估。
上述其他直接或间接对新生儿胆道闭锁有诊断能力的指标可选自：胆红素、γ-谷氨酰转移酶、MMP-7等。
进一步地，本发明提供的生物标志物的用途，其特征还在于：
上述用途还包括：应用于检测系统/设备中，具体使用方法如下：
S1.对离体血样/干血斑进行色谱-质谱分析，获取分析结果；
S2.针对分析结果，筛选出特定生物标志物；
当特定生物标志物符合预设的规则时，所述检测系统/设备的前端提示“存在隐患”。
进一步地，本发明提供的生物标志物的用途，其特征还在于：
上述用途还包括：用于制备胆道闭锁早期筛查诊断试剂盒。
进一步地，本发明提供的生物标志物的用途，其特征还在于：
上述用途还包括：用于制备通过改变代谢物水平干预治疗胆道闭锁的靶向药物。
另外，本发明还提供额一种获得生物标志物的方法，其特征在于：
上述生物标志物为基于新生儿血斑代谢物的胆道闭锁早期筛查标志物；
具体的方法为：
S1.收集新生儿血斑样本；
S2.准备相关代谢物标准品；
S3.对S1获取的血斑样本进行预处理；
S4.采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测；
S5.采用靶向代谢组学分析，筛选获得差异代谢物，和/或生物标志物代谢通路。
进一步地，本发明提供的一种获得生物标志物的方法，其特征还在于：
上述S4中的超高效液相色谱-串联质谱中色谱参数设置如下：
采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；柱温40℃；流动相A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈：异丙醇＝7:3；流速为0.4mL/min；进样量为5uL；梯度洗脱条件：0-1min(5％B),1-5min(5-30％B),5-9min(30-50％B),9-11min(50-78％B),11-13.5min(78-95％B),13.5-14min(95-100％B),14-16min(100％B,0.6mL/min),16-16.1min(100-5％B),16.1-18min(5％B)
进一步地，本发明提供的一种获得生物标志物的方法，其特征还在于：
上述S4中的超高效液相色谱-串联质谱中质谱参数设置如下：
电喷雾离子源采用正/负离子扫描模式(ESI+/ESI-)，毛细管电压1.5kV，离子源温度150℃,脱溶剂气温度550℃,反向锥孔气流150L/h,脱溶剂气1000L/h,低质量区分辨率4.7,高质量区分辨率15,多反应检测模式采集数据。
进一步地，本发明提供的一种获得生物标志物的方法，其特征还在于：
上述S4中差异代谢物的筛选方法如下：
S4-1：通过偏最小二乘回归分析法分析，获得所有差异代谢物；
S4-2：采用单维检验法，依据数据的正态性和方差齐性选取T Test或Mann-Whitney U Test，筛选出最终的差异代谢物。
进一步地，本发明提供的一种获得生物标志物的方法，其特征还在于：
上述S4中代谢通路的筛选方法如下：
使用选定的SMPDB库对差异代谢物进行通路富集分析，获得生物标志物代谢通路。
附图说明
图1.OPLS-DA分析和置换检验结果；
图2-1.差异代谢物筛选结果；
图2-2.差异代谢物筛选结果；
图3.差异代谢物通路分析结果；
图4-1.差异代谢物的ROC曲线图；
图4-2.差异代谢物特异性、敏感性，Cutoff和AUC结果。
具体实施方式
1.新生儿血斑的制备和收集
1)制备新生儿出生3-4天内血斑样本。具体过程如下：
S1.轻按摩以及用75％乙醇或碘伏棉签擦拭足底采血部位。
S2.用一次性消毒采血针刺入采血部位2-3mm，立即出针。
S3.血液自然流出后，用一次性微量吸管吸血或将血滴加在滤纸片上，然后用无菌干棉球压住伤口止血。
S4.标识收集好样本。阴凉处避光干燥4小时,放入铝箔袋中,-80℃保存。
2)本项目血斑样品收集自上海市儿科医学研究所新生儿代谢病检测平台。共计收集121例新生儿血斑，根据已确诊胆道闭锁的患儿信息，通过溯源方法找到了21例胆道闭锁患儿出生血斑，且随机挑选了100例出生时间和孕周数匹配的患儿作为对照。血斑患儿出生时间为：2013月9月17日至2020年1月20日。13例胆道闭锁血斑及40例对照患儿血斑为试验组；8例胆道闭锁血斑及60例对照患儿血斑作为代谢物检测验证组。2.干血斑内代谢物检测
1)标准品和试剂：
准备324种代谢物标准品，该代谢物标准品购买自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA),Steraloids Inc.(Newport,RI,USA)以及TRC Chemicals(Toronto,ON,Canada)。
S1-1.所有的标准品经过准确的称量后，溶解到水、甲醇、碱性溶液或酸性溶液中，配制合适的标准品单标母液。
S1-2.取适量的标准品母液，混合成需要的混合标准品溶液。
其中，分析纯的甲酸购买自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)；
质谱纯的甲醇、乙腈、异丙醇购买自Thermo-Fisher Scientific(FairLawn,NJ,USA)。
超纯水由Mill-Q(Millipore,Billerica,MA,USA)纯水系统制备。
样本准备和衍生化流程按照说明书操作，例如：参考Xie GX等，A MetaboliteArray Technology for Precision Medicine.Anal Chem.2021 Apr 13；93(14):5709-5717的方法。
2)干血斑处理：
S2-1.-80度冰箱中取出干血斑样本，室温复温30分钟。
S2-2.每份干血斑用打孔器打4个直径为3.2mm的血斑用于检测。
S2-3.各样本加入10微升去离子水，室温静置20分钟；
S2-4.将96孔板置于Biomek 4000自动移液工作站(Biomek 4000,BeckmanCoulter,Inc.,Brea,California,USA)。
S2-5.各孔加入含标准品的冰冻甲醇，室温震荡20分钟。
S2-6.将96孔板转移到离心机(Allegra X-15R，Beckman Coulter,Inc.,Indianapolis,IN,USA)，10度4000g离心30分钟。
S2-7.离心结束后将96孔板放回自动移液工作站，转移30微升上清到新的96孔板，加入20微升新鲜配制的衍生化试剂和EDC溶液。
S2-8.封膜，30度震荡反应60分钟。
S2-9.反应完成后，各孔加入350微升的冰冻50％甲醇，-20度冰箱冷冻20分钟。
S2-10.将96孔板转移到离心机(Allegra X-15R，Beckman Coulter,Inc.,Indianapolis,IN,USA)，10度4000g离心30分钟。
S2-11.将96孔板放回自动移液工作站，转移140微升上清到干净的进样板，再加入10微升含内标溶液2；
S2-12.封膜，震荡，等待进样。
3)仪器设备和参数设置：
靶向代谢组学分析使用超高效液相色谱-串联质谱进行检测(ACQUITY UPLC-XevoTQ-S,Waters Corp.,Milford,MA,USA)。仪器配备二元溶剂控制器和样本控制室以及电喷雾离子源。
其中，色谱条件：采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；柱温40℃；流动相A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈：异丙醇＝7:3；流速为0.4mL/min；进样量为5uL；梯度洗脱条件：0-1min(5％B),1-5min(5-30％B),5-9min(30-50％B),9-11min(50-78％B),11-13.5min(78-95％B),13.5-14min(95-100％B),14-16min(100％B,0.6mL/min),16-16.1min(100-5％B),16.1-18min(5％B)。
质谱条件：电喷雾离子源采用正/负离子扫描模式(ESI+/ESI-)，具体条件如下：毛细管电压1.5kV，离子源温度150℃,脱溶剂气温度550℃,反向锥孔气流150L/h,脱溶剂气1000L/h,低质量区分辨率4.7,高质量区分辨率15,多反应检测模式采集数据。
3结果分析
1)差异代谢物筛选
通过偏最小二乘回归分析法(OPLS-DA)分析可以清晰地观察到试验组(如图1A所示)以及验证组(如图1B所示)内胆道闭锁患儿与对照患儿血斑代谢物差异明显(如图1所示)。
采用单维检验(依据数据的正态性和方差齐性选取T Test或Mann-Whitney UTest)共得到8个差异代谢物，分别为:Glutamic acid,Indoleacetic acid,alpha-Ketoisovaleric acid,Ketoleucine,2-hydroxyglutaric acid,Taurohyocholic acid(THCA),Taurocholic acid(TCA)和glycocholic acid(GCA)(如图2-1和图2-2所示)。胆道闭锁血斑代谢物Glutamic acid(93.99±26.77μmol/Lvs.62.45±15.47μmol/L,p<0.0001)、2-Hydroxyglutaric acid(14.84±5.743μmol/Lvs.9.955±2.668μmol/L,p＝0.0007)、THCA(1.332±1.289μmol/Lvs.0.3305±0.3538μmol/L，P<0.0001)、TCA(4.345±4.035μmol/Lvs.1.152±1.024μmol/L，P＝0.0013)和GCA(4.56±4.641μmol/Lvs.0.9019±0.9208μmol/L，P<0.0001)的含量较对照患儿血斑中的含量显著性升高.代谢物Ketoleucine(9.154±4.884μmol/Lvs.17.66±7.438μmol/L，P<0.0001)、Indoleaceticacid(0.8005±0.4069μmol/Lvs 1.31±0.5501μmol/L,P＝0.0004)和alpha-Ketoisovaleric(0.7514±0.7646μmol/Lvs.1.691±0.9263μmol/L,P<0.0001)在胆道闭锁血斑中的含量显著性低于对照患儿组(如图2所示)。
使用选定的Pathway-associated metabolite sets(SMPDB)库对差异代谢物进行通路富集分析显示潜在生物标志物代谢通路主要集中在Glutathione Metabolism、BileAcid Biosynthesis、Valine,leucine and isoleucine biosynthesis and degradation(如图3所示)。
2)潜在生物标志物诊断结果
利用各个候选的代谢物浓度信息和分组信息分别绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)，如图4-1和图4-2所示：
代谢物Glutamic acid AUC达到0.8610(95％CI＝(0.7690-0.9529)，取截断值>78.25μmol/L，其灵敏度达到84％(75.32％-90.57％)，特异性达到76.2％(52.83％to91.78％)；
代谢物THCAROC曲线下面积(Area Under Curve，AUC)达到0.8519(95％CI＝(0.7347-0.9692)，取截断值>0.679μmol/L，其灵敏度达到89％(81.17％-94.38％)，特异性达到81％(58.09％to 94.55％)；
THCA和Glutamic acid联合AUC为0.906(95％CI＝(0.81-1)，取截断值＝-1.097，其灵敏度达到93％(69.6％-98.8％)，特异性达到90.7％(86％to 97.1％)；
8种差异代谢物Glutamic acid，Indoleacetic acid,alpha-Ketoisovalericacid,Ketoleucine,2-hydroxyglutaric acid,Taurohyocholic acid(THCA),Taurocholicacid(TCA)和glycocholic acid(GCA)联合AUC达到0.945(95％CI＝(0.878-1)，取截断值>-1.109，其灵敏度达到91％(83.6％-95.8％)，特异性达到90.5％(69.62％-98.83％)。
本实施例还提供一种用于评估新生儿胆道闭锁风险的试剂盒，包含血斑内代谢物定量检测试剂。
具体地，包括8种差异代谢物(A.谷氨酸(Glutamic acid)；B.吲哚乙酸(Indoleacetic acid)；C.α-酮异戊酸(alpha-Ketoisovaleric acid)；D.酮亮氨酸(Ketoleucine)；E.2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid)；F.牛磺猪胆酸(THCA)；G.牛磺胆酸(TCA)；H.甘氨胆酸(GCA))代谢物质控品、内标准品、有机溶剂和血斑棉滤纸。
有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇、异丙醇和乙腈中之一种或几种的组合，如：乙腈：异丙醇＝7:3，乙腈：丙二醇＝1：1等。
根据实际使用的需要质控品还可以进行调整，例如：仅包含A.谷氨酸(Glutamicacid)；B.吲哚乙酸(Indoleacetic acid)；C.α-酮异戊酸(alpha-Ketoisovaleric acid)；D.酮亮氨酸(Ketoleucine)；E.2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid)；F.牛磺猪胆酸(THCA)；G.牛磺胆酸(TCA)；H.甘氨胆酸(GCA)中的一种或几种的方案。
采用试剂盒评估新生儿胆道闭锁风险的使用方法还可以为：
(1)新生儿出生后3-4天足底血斑样本；
(2)通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-TQMS)定量测定血斑样本中代谢物标志物的表达水平；
(3)分析血斑中差异代谢物的表达水平以进行风险评估，分析结合差异代谢物的准确性、灵敏性、特异性及截断值，选用1种或者多种差异代谢物组合用于检测对象胆道闭锁风险高低的评估；可任选地联合检测其他直接或间接对新生儿胆道闭锁有诊断能力的指标之一种或几种，如胆红素、γ-谷氨酰转移酶、MMP-7，进一步评估新生儿胆道闭锁风险。
当将上述差异代谢物应用于检测系统/设备中，具体使用方法如下：
S1.对离体血样/干血斑进行超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-TQMS)定量测定，获取分析结果；
S2.针对分析结果，筛选出特定生物标志物，并将其与预设的阈值进行比对；
当特定生物标志物符合预设的规则(例如：A物质的含量低于或高于标准值，或A-H中的3项及以上的含量不符合标准值范围)时，所述检测系统/设备的前端提示“存在隐患”。
Claims (11)
1.生物标志物的用途，其特征在于：
所述生物标志物选自如下特定生物标志物中的一种或几种：
A.谷氨酸(Glutamic acid)；
B.吲哚乙酸(Indoleacetic acid)；
C.α-酮异戊酸(alpha-Ketoisovaleric acid)；
D.酮亮氨酸(Ketoleucine)；
E.2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutaric acid)；
F.牛磺猪胆酸(THCA)；
G.牛磺胆酸(TCA)；
H.甘氨胆酸(GCA)；
所述用途：
用于制备检测新生儿胆道闭锁的试剂盒。
2.如权利要求1所述的生物标志物的用途，其特征在于：
包含血斑内代谢物定量检测试剂；
所述血斑内代谢物定量检测试剂包括A-H 8种差异代谢物代谢物质控品、内标准品、分散体系有机溶剂和血斑棉滤纸；
其中，所述分散体系有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇和乙腈中之一种或几种的组合。
3.如权利要求1所述的生物标志物的用途，其特征在于：
用所述试剂盒评估新生儿胆道闭锁风险的试剂盒的方法为：
S1.获取新生儿出生后3-4天足底的离体血斑样本；
S2.通过超高效液相色谱-三重四极杆质谱定量测定血斑样本中代谢物标志物的表达水平；
S3.分析血斑中差异代谢物的表达水平以进行风险评估，分析结合差异代谢物的准确性、灵敏性、特异性及截断值，选用1种或者多种差异代谢物组合用于检测对象胆道闭锁风险高低的评估；
或选用1种或者多种差异代谢物以及任选地联合其他直接或间接对新生儿胆道闭锁有诊断能力的指标之一种或几种的组合来对检测对象胆道闭锁风险高低进行评估。
4.如权利要求1所述的生物标志物的用途，其特征在于：
所述用途还包括：应用于检测系统/设备中，具体使用方法如下：
S1.对离体血样/干血斑进行色谱-质谱分析，获取分析结果；
S2.针对分析结果，筛选出特定生物标志物；
当特定生物标志物符合预设的规则时，所述检测系统/设备的前端提示“存在隐患”。
5.如权利要求1所述的生物标志物的用途，其特征在于：
所述用途还包括：用于制备胆道闭锁早期筛查诊断试剂盒。
6.如权利要求1所述的生物标志物的用途，其特征在于：
所述用途还包括：用用于制备通过改变代谢物水平干预治疗胆道闭锁的靶向药物。
7.一种获得生物标志物的方法，其特征在于：
所述生物标志物为基于新生儿血斑代谢物的胆道闭锁早期筛查标志物；
具体的方法为：
S1.收集新生儿血斑样本；
S2.准备相关代谢物标准品；
S3.对S1获取的血斑样本进行预处理；
S4.采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测；
S5.采用靶向代谢组学分析，筛选获得差异代谢物，和/或生物标志物代谢通路。
8.如权利要求5所述的一种获得生物标志物的方法，其特征在于：
所述S4中的超高效液相色谱-串联质谱中色谱参数设置如下：
采用UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；柱温40℃；流动相A：水(0.1％甲酸)，B：乙腈：异丙醇＝7:3；流速为0.4mL/min；进样量为5uL；梯度洗脱条件：0-1min(5％B),1-5min(5-30％B),5-9min(30-50％B),9-11min(50-78％B),11-13.5min(78-95％B),13.5-14min(95-100％B),14-16min(100％B,0.6mL/min),16-16.1min(100-5％B),16.1-18min(5％B)。
9.如权利要求5所述的一种获得生物标志物的方法，其特征在于：
所述S4中的超高效液相色谱-串联质谱中质谱参数设置如下：
电喷雾离子源采用正/负离子扫描模式(ESI+/ESI-)，毛细管电压1.5kV，离子源温度150℃,脱溶剂气温度550℃,反向锥孔气流150L/h,脱溶剂气1000L/h,低质量区分辨率4.7,高质量区分辨率15,多反应检测模式采集数据。
10.如权利要求5所述的一种获得生物标志物的方法，其特征在于：
所述S4中差异代谢物的筛选方法如下：
S4-1：通过偏最小二乘回归分析法分析，获得所有差异代谢物；
S4-2：采用单维检验法，依据数据的正态性和方差齐性选取T Test或Mann-Whitney UTest，筛选出最终的差异代谢物。
11.如权利要求5所述的一种获得生物标志物的方法，其特征在于：
所述S4中代谢通路的筛选方法如下：
使用选定的SMPDB库对差异代谢物进行通路富集分析，获得生物标志物代谢通路。
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