CN112666291A - 基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于高通量液相色谱‑质谱联用技术的胆汁酸检测方法，包括：S1.精密称取人血清中胆汁酸标准品，加入甲醇溶解，制得质量浓度为1000mg/L的单标储备液；S2.取适量步骤S1中配制的单标储备液加入同一离心试管中，涡旋混匀，得到混合储备液；进行所述混合储备液的色谱分析及质谱分析，得到第一检测结果，并根据第一检测结果及单标储备液的浓度绘制标准曲线；S3.按1：3～4的混合比例向离心管中加入人血清样本和乙腈溶液，静置1min后涡旋震荡30s，然后通过高速离心处理吸取上清液作为检测样本；S4.进行所述检测样本的色谱分析及质谱分析，得到第二检测结果；基于所述第二检测结果和标准曲线，获得人血清样本中胆汁酸浓度。

Description

基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法

技术领域

本发明属于胆汁酸检测技术领域，具体涉及基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法。

背景技术

胆汁酸为胆汁的主要成分,是一组结构类似的类固醇酸的总称。在人的胆汁中，胆汁酸有游离型胆汁酸和结合型胆汁酸两大类。胆汁酸能够在肠道促进脂类消化吸收，同时还可以抑制胆汁中胆固醇结晶析出。胆汁酸主要在肝脏由胆固醇转化而来，具有广泛的生物学作用。

近年来研究发现胆汁酸对调节糖、脂代谢以及能量代谢具有重要作用，因此胆汁酸成分及含量的检测对于靶向代谢组学研究、了解疾病状态等都有重要意义。目前，常用的胆汁酸检测方法主要有酶循环法和高效液相色谱法，这些检测方法主要存在以下一些问题：

酶循环法只能检测总胆汁酸含量，无法准确区分胆汁酸的不同分型，无法对疾病进行更准确的分析诊断和鉴别，临床指导意义有限；

高效液相色谱法需要衍生处理，特别是牛磺酸结合型胆汁酸还需要水解后再衍生化，前处理操作步骤十分复杂。

发明内容

鉴于此，为解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，包括如下步骤：

S1.单标储备液制备：精密称取人血清中胆汁酸标准品，加入甲醇溶解，制得质量浓度为1000mg/L的单标储备液；

S2.混合储备液制备及处理：取适量步骤S1中配制的单标储备液加入同一离心试管中，涡旋混匀，得到混合储备液；利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，进行所述混合储备液的色谱分析及质谱分析，得到第一检测结果，并根据第一检测结果及单标储备液的浓度绘制标准曲线；

S3.样本处理：按1：3～4的混合比例向离心管中加入人血清样本和乙腈溶液，静置1min后涡旋震荡30s，然后通过高速离心处理吸取上清液作为检测样本；

S4.样本检测：利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，进行所述检测样本的色谱分析及质谱分析，得到第二检测结果；基于所述第二检测结果和标准曲线，获得人血清样本中胆汁酸浓度。

优选的，所述预设的检测条件包括色谱分析条件，且色谱分析条件包括：C18色谱柱，柱温为28～40℃，流速为0.6mL/min；流动相A采用3～5mmol/L醋酸铵和0.01％甲酸混合水溶液；流动相B采用3～5mmol/L醋酸铵和0.01％甲酸甲醇混合溶液；所述流动相采用梯度洗脱。

优选的，所述梯度洗脱包括：0～0.5min，流动相A从50％线性变化至35％；0.5～2.0min，流动相A从35％线性变化至28.5％；2.0～2.3min，流动相A从28.5％线性变化至26％；2.3～3.0min，流动相A从26％线性变化至20％；3.0～3.5min，流动相A从20％线性变化至2％；3.5～4.0min，流动相A从2％恢复至50％；4.0～4.5min，流动相A保持在50％。

优选的，所述预设的检测条件包括两级串联质谱分析条件，且质谱分析条件包括：在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；离子源温度为150℃，雾化气温度为350～450℃，流速为600～900L/h。

优选的，利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下进行质谱分析时，采用蠕动泵以10μL/min的速度，将所述混合储备液或者所述检测样本注入质谱的离子源中。

优选的，在制备步骤S1中所配制的单标储备液后，在4℃的温度条件下进行所述单标储备液的冷藏保存。

优选的，在人血清中包括如下胆汁酸：胆酸CA、去氧胆酸DCA、鹅去氧胆酸CDCA、熊去氧胆酸UDCA、石胆酸LCA、甘氨胆酸GCA、甘氨脱氧胆酸GDCA、甘氨鹅去氧胆酸GCDCA、甘氨熊去氧胆酸GUDCA、牛磺胆酸TCA、牛磺脱氧胆酸TDCA、牛磺石胆酸TLCA、牛磺鹅去氧胆酸TCDCA、牛磺熊去氧胆酸TUDCA。

优选的，在进行步骤S2所述的混合储备液制备时：

分别精确称量各胆汁酸的单标储备液；

加入甲醇定容，使得胆酸CA、石胆酸LCA、去氧胆酸DCA、鹅去氧胆酸CDCA、熊去氧胆酸UDCA的浓度均为10mg/L，其余胆汁酸浓度均为50mg/L；

将不同浓度的各胆汁酸的单标储备液加入同一离心试管中。

优选的，在进行步骤S3所述的样本处理时：在4℃的温度条件下进行高速离心处理，且离心处理转速为15000r/min，离心处理时间为10min。

优选的，在进行步骤S3所述的样本处理时：利用0.2～0.25μm的有机滤网对所吸取的上清液进行过滤，并以过滤后的滤液作为检测样本。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

在本发明，详细提供了中基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，该方法采用蛋白沉淀进行样本前处理，操作简单、成本低、并大大缩短了样本处理及检测时间；相比于传统的检测方法而言，本发明可在5min内完成分析检测，同时利用质谱技术多反应监测的优势，使干扰因素大大减少，提高检测灵敏度、进而使得检测结果更为准确。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明中，提供了一种基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，具体包括如下步骤：

S1.单标储备液制备

精密称取人血清中胆汁酸标准品，加入甲醇溶解，制得质量浓度为1000mg/L的单标储备液；

具体的，在人血清中所包含的胆汁酸包括：胆酸CA、去氧胆酸DCA、鹅去氧胆酸CDCA、熊去氧胆酸UDCA、石胆酸LCA、甘氨胆酸GCA、甘氨脱氧胆酸GDCA、甘氨鹅去氧胆酸GCDCA、甘氨熊去氧胆酸GUDCA、牛磺胆酸TCA、牛磺脱氧胆酸TDCA、牛磺石胆酸TLCA、牛磺鹅去氧胆酸TCDCA、牛磺熊去氧胆酸TUDCA。

S2.混合储备液制备及处理

分别精确称量各胆汁酸的单标储备液；

加入甲醇定容，使得胆酸CA、石胆酸LCA、去氧胆酸DCA、鹅去氧胆酸CDCA、熊去氧胆酸UDCA的浓度均为10mg/L，其余胆汁酸浓度均为50mg/L；

将不同浓度的各胆汁酸的单标储备液加入同一离心试管中，涡旋混匀，得到混合储备液；

利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，进行混合储备液的色谱分析及质谱分析，得到第一检测结果，并根据第一检测结果及单标储备液的浓度绘制标准曲线；

S3.样本处理

按1：3～4的混合比例向离心管中加入人血清样本和乙腈溶液，静置1min后涡旋震荡30s；

然后在4℃的温度条件下进行高速离心处理，且离心处理转速为15000r/min，离心处理时间为10min；

吸取离心上清液，利用0.2～0.25μm的有机滤网对所吸取的上清液进行过滤，并以过滤后的滤液作为检测样本；

S4.样本检测

利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，进行检测样本的色谱分析及质谱分析，得到第二检测结果；基于第二检测结果和标准曲线，获得人血清样本中胆汁酸浓度。

上述，液相色谱-质谱联用仪所对应的预设的检测条件包括色谱分析条件和两级串联质谱分析条件，其中：

色谱分析条件包括：C18色谱柱，柱温为28～40℃，流速为0.6mL/min；流动相A采用3～5mmol/L醋酸铵和0.01％甲酸混合水溶液；流动相B采用3～5mmol/L醋酸铵和0.01％甲酸甲醇混合溶液；流动相采用梯度洗脱，且梯度洗脱包括：0～0.5min，流动相A从50％线性变化至35％；0.5～2.0min，流动相A从35％线性变化至28.5％；2.0～2.3min，流动相A从28.5％线性变化至26％；2.3～3.0min，流动相A从26％线性变化至20％；3.0～3.5min，流动相A从20％线性变化至2％；3.5～4.0min，流动相A从2％恢复至50％；4.0～4.5min，流动相A保持在50％。

质谱分析条件包括：在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；离子源温度为150℃，雾化气温度为350～450℃，流速为600～900L/h；并且，利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下进行质谱分析时，采用蠕动泵以10μL/min的速度，将混合储备液或者检测样本注入质谱的离子源中。

针对上述胆汁酸检测方法，提供如下实施例进行详细解释

实施例1

按照上述方法完成步骤S1及步骤S2；

S3.样本处理

移取100μL的人血清样本至离心管中，并向离心管中加入400μL的乙腈溶液，静置1min后涡旋震荡30s；

在4℃的温度条件下进行高速离心处理，且离心处理转速为15000r/min，离心处理时间为10min；

吸取离心上清液100μL，并对100μL的上清液重复进行高速离心处理；

再次吸取离心上清液，并用甲醇定容到0.5mL，然后利用0.22μm的有机滤网对所吸取的上清液进行过滤，以过滤后的滤液作为检测样本。

按照上述方法完成步骤S4。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.单标储备液制备

精密称取人血清中胆汁酸标准品，加入甲醇溶解，制得质量浓度为1000mg/L的单标储备液；

S2.混合储备液制备及处理

取适量步骤S1中配制的单标储备液加入同一离心试管中，涡旋混匀，得到混合储备液；利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，进行所述混合储备液的色谱分析及质谱分析，得到第一检测结果，并根据第一检测结果及单标储备液的浓度绘制标准曲线；

S3.样本处理

按1：3～4的混合比例向离心管中加入人血清样本和乙腈溶液，静置1min后涡旋震荡30s，然后通过高速离心处理吸取上清液作为检测样本；

S4.样本检测

利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下，进行所述检测样本的色谱分析及质谱分析，得到第二检测结果；基于所述第二检测结果和标准曲线，获得人血清样本中胆汁酸浓度。

2.根据权利要求1所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，所述预设的检测条件包括色谱分析条件，且色谱分析条件包括：

C18色谱柱，柱温为28～40℃，流速为0.6mL/min；流动相A采用3～5mmol/L醋酸铵和0.01％甲酸混合水溶液；流动相B采用3～5mmol/L醋酸铵和0.01％甲酸甲醇混合溶液；所述流动相采用梯度洗脱。

3.根据权利要求2所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱包括：

0～0.5min，流动相A从50％线性变化至35％；

0.5～2.0min，流动相A从35％线性变化至28.5％；

2.0～2.3min，流动相A从28.5％线性变化至26％；

2.3～3.0min，流动相A从26％线性变化至20％；

3.0～3.5min，流动相A从20％线性变化至2％；

3.5～4.0min，流动相A从2％恢复至50％；

4.0～4.5min，流动相A保持在50％。

4.根据权利要求1所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，所述预设的检测条件包括两级串联质谱分析条件，且质谱分析条件包括：

在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；离子源温度为150℃，雾化气温度为350～450℃，流速为600～900L/h。

5.根据权利要求4所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，利用液相色谱-质谱联用仪在预设的检测条件下进行质谱分析时，采用蠕动泵以10μL/min的速度，将所述混合储备液或者所述检测样本注入质谱的离子源中。

6.根据权利要求1所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，在制备步骤S1中所配制的单标储备液后，在4℃的温度条件下进行所述单标储备液的冷藏保存。

7.根据权利要求1所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，在人血清中包括如下胆汁酸：

胆酸CA、去氧胆酸DCA、鹅去氧胆酸CDCA、熊去氧胆酸UDCA、石胆酸LCA、甘氨胆酸GCA、甘氨脱氧胆酸GDCA、甘氨鹅去氧胆酸GCDCA、甘氨熊去氧胆酸GUDCA、牛磺胆酸TCA、牛磺脱氧胆酸TDCA、牛磺石胆酸TLCA、牛磺鹅去氧胆酸TCDCA、牛磺熊去氧胆酸TUDCA。

8.根据权利要求7所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，在进行步骤S2所述的混合储备液制备时：

分别精确称量各胆汁酸的单标储备液；

加入甲醇定容，使得胆酸CA、石胆酸LCA、去氧胆酸DCA、鹅去氧胆酸CDCA、熊去氧胆酸UDCA的浓度均为10mg/L，其余胆汁酸浓度均为50mg/L；

将不同浓度的各胆汁酸的单标储备液加入同一离心试管中。

9.根据权利要求1所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，在进行步骤S3所述的样本处理时：

在4℃的温度条件下进行高速离心处理，且离心处理转速为15000r/min，离心处理时间为10min。

10.根据权利要求9所述的基于高通量液相色谱-质谱联用技术的胆汁酸检测方法，其特征在于，在进行步骤S3所述的样本处理时：

利用0.2～0.25μm的有机滤网对所吸取的上清液进行过滤，并以过滤后的滤液作为检测样本。