CN112505187A - Uplc-ms/ms联用检测粪便中胆汁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种UPLC‑MS/MS联用检测粪便中胆汁酸的方法。该方法包括：标准曲线建立；待测粪便样品处理，将冷冻的待测粪便样品采用质谱水进行溶解，得到待测浆液；采用萃取剂将待测浆液进行萃取和离心分离，得到上清液；将上清液进行干燥后采用初始流动相进行复溶，得到复溶体系；将复溶体系进行离心得到待检测液，萃取剂包括乙腈和甲醇的混合液，混合液中乙腈和甲醇的体积为7:3～9:1，初始流动相包括体积比为7:3～9:1的乙腈和0.1％的甲酸水溶液的混合液；采用UPLC‑MS/MS联用对待检测液进行检测，得到各胆汁酸的离子谱峰；根据标准曲线和离子谱峰换算各胆汁酸的含量。该方法可以对33种胆汁酸进行定量。

Description

UPLC-MS/MS联用检测粪便中胆汁酸的方法
技术领域
本发明涉及粪便中胆汁酸的检测技术领域，具体而言，涉及一种UPLC-MS/MS联用检测粪便中胆汁酸的方法。
背景技术
胆汁酸是胆汁的重要组成成分，其主要的生理功能是维持体内脂质代谢的平衡，在生物体内它通常以胆固醇为原料在肝脏中进行合成从而生成初级胆汁酸，初级胆汁酸随着胆汁分泌到十二指肠，随后通过一系列反应生成次级胆汁酸，此外初级胆汁酸还与甘氨酸或牛磺酸结合形成结合型胆汁酸，胆汁酸在生物体内会被肠道重吸收，由肝脏所摄取，从而形成胆汁进行再次分泌，此过程为肝肠循环，每天重复多次，在此过程中有95％胆汁酸被重吸收，另外的5％会由粪便排出造成丢失，所以粪便中的胆汁酸为研究生物体内的胆汁酸代谢过程提供了丰富的信息，因此建立一种粪便中胆汁酸的检测方法对于整个生物学来讲具有重要意义。
目前的检测技术大多都是检测体内总胆汁酸的含量，且检测的方式过于繁琐和复杂，实验耗费时间较长，然而总胆汁酸对于不同疾病的诊断特异性也较差，对检测结果的指导存在局限性，从而影响判断。另外还有一些检测技术只能检测部分胆汁酸，主要包括胆酸(CA)、石胆酸(LCA)、脱氧胆酸(DCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)等，检测结果不全面，且大多的检测对象为血清样本，研究深度较浅显、方向过于单一化。
公开号为CN 108072704 A的中国专利申请公开了一种基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法，具体步骤为，取已冻干粪便，研磨破碎后加入乙醇，研磨后超声，经离心后，取上清液移入收集管，然后用乙醇超声提取一遍，再用异丙醇提取残留的胆汁酸，合并三次提取的上清液于收集管中冷冻干燥。冻干后用乙腈水溶液复溶，经过滤后进行液相色谱质谱联用仪器分析。该方法将先进的色谱分离及质谱分辨技术结合，从粪便提取液中能够检测到22种胆汁酸。
而实际中粪便中的胆汁酸种类远多于22种，因此上述检测方法的检测范围仍然存在不足。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种UPLC-MS/MS联用检测粪便中胆汁酸的方法，以解决现有技术中的粪便中胆汁酸检测范围不足的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种UPLC-MS/MS联用检测粪便中胆汁酸的方法，胆汁酸包括牛磺猪脱氧胆酸钠盐、牛磺猪胆酸钠盐、7-酮基石胆酸、23-脱甲胆酸、牛磺脱氧胆酸钠盐、猪脱氧胆酸、甘氨猪胆酸钠盐、23-脱甲脱氧胆酸、异石胆酸、12-酮基石胆酸、别石胆酸、石胆酸-3-硫酸钠盐、脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、甘氨熊脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、牛磺熊脱氧胆酸二水合物、甘氨石胆酸-3-葡糖苷、石胆酸、3β-熊去氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠盐、甘氨胆酸水合物、牛磺石胆酸钠盐、熊去氧胆酸、3-脱氢胆酸、猪胆酸、阿尔法-鼠胆酸、贝塔-鼠胆酸、牛磺胆酸、牛磺-阿尔法-鼠胆酸钠盐、甘氨脱氧胆酸，方法包括：标准曲线建立，利用UPLC-MS/MS联用建立各胆汁酸的浓度和峰面积的标准曲线；待测粪便样品处理，将冷冻的待测粪便样品采用质谱水进行溶解，得到待测浆液；采用萃取剂将待测浆液进行萃取和离心分离，得到上清液；将上清液进行干燥后采用初始流动相进行复溶，得到复溶体系；将复溶体系进行离心得到待检测液，萃取剂包括乙腈和甲醇的混合液，混合液中乙腈和甲醇的体积为7:3～9:1，初始流动相包括体积比为7:3～9:1的乙腈和0.1％的甲酸水溶液的混合液；检测，采用UPLC-MS/MS联用对待检测液进行检测，得到各胆汁酸的离子谱峰；根据标准曲线和离子谱峰换算各胆汁酸的含量，其中，UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱为C18色谱柱，所用流动相包括可选的A相和B相，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈，同时含有A相和B相时，A相和B相的体积比为45:55～80:20。
进一步地，上述采用萃取剂将待测浆液进行萃取和离心分离得到上清液的步骤包括：将萃取剂与待测浆液涡旋混合后置于0～5℃下静置3～10min以进行萃取形成萃取体系；将萃取体系在2～5℃下进行离心，得到上清液。
进一步地，上述将上清液进行干燥后采用初始流动相进行复溶得到复溶体系的步骤包括：采用氮吹仪将上清液进行吹干处理，得到干燥物；采用初始流动相对干燥物进行复溶，得到复溶体系，优选初始流动相与待测粪便样品的比例为1：1～2：1，优选初始流动相包括体积比为8:2的乙腈和0.1％的甲酸水溶液的混合液。
进一步地，上述色谱柱的柱参数为2.1mm×100mm×2.5μm。
进一步地，上述检测过程中，色谱柱的柱温为48～52℃。
进一步地，上述检测过程中采用梯度洗脱，梯度洗脱过程中，流动相自初始流动相开始以A相逐渐减小B相逐渐增加的方式进行梯度变化，并以与初始流动相相同组成的流动相洗脱结束梯度洗脱。
进一步地，上述初始流动相洗脱的时间为1min，且初始流动相洗脱结束后在10～15min内，流动相中A相和B相的体积比自65:35逐渐变化至45:55，接着以B相洗脱2～3min后再以初始流动相进行洗脱。
进一步地，上述检测所采用的离子源为负离子电离模式的电喷雾电离源。
进一步地，上述离子源温度为520～560℃、离子源电压-4500V。
进一步地，上述萃取剂还包括至少三种所述胆汁酸的同位素内标，该同位素内标为鹅去氧胆酸-D4、胆酸-D4、熊去氧胆酸-D4、甘氨鹅脱氧胆酸-D4、甘氨胆酸-D4和石胆酸-D4。
应用本发明的技术方案，本申请将UPLC-MS/MS联用，提高了检测结果的准确性，且在样品处理过程中采用了上述特定组成的萃取剂和初始流动相对待检测粪便样品中的胆汁酸进行了充分萃取和分离，实现了采样的全面性；然后利用UPLC-MS/MS联用结合C18色谱柱和特定的流动相组成，实现了所形成的待检测液中各胆汁酸的有效分离，得到分离度较好的各胆汁酸的离子谱峰，再利用内标法进行定量。由此可见，本申请方法基于超高效液相色谱质谱联用技术，方法特异性强、灵敏度高、检测范围广，可以对生物体内的33种胆汁酸进行分离，实现了胆汁酸的绝对定量。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本发明的实施例1的33种胆汁酸混标的提取离子流图；
图2示出了根据本发明的实施例1的样品检测得到的总离子流图；
图3示出了根据本发明的对比例1的样品检测得到的总离子流图；
图4示出了根据本发明的对比例2的样品检测得到的总离子流图；
图5示出了根据本发明的实施例2的33种胆汁酸混标检测得到的总离子流图；
图6示出了根据本发明的对比例3的样品检测得到的总离子流图；
图7示出了根据本发明的对比例4的33种胆汁酸混标检测得到的总离子流图；
图8示出了根据本发明的对比例5的样品检测得到的总离子流图；
图9示出了根据本发明的对比例6的样品检测得到的总离子流图；
图10示出了根据本发明的对比例7的33种胆汁酸混标检测得到的总离子流图。
各图中横坐标为时间，单位为min。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
如本申请背景技术所记载的，基于液相色谱质谱联用的粪便中胆汁酸的检测方法相对于常规现有技术虽然有了很大进步，但是，其检测的胆汁酸种类仅仅22种，远低于已有胆汁酸种类，其检测范围有限，在应用时难以提供可靠准确的测试结果，为了解决该问题，本申请提供了一种UPLC-MS/MS联用检测粪便中胆汁酸的方法，该胆汁酸包括牛磺猪脱氧胆酸钠盐、牛磺猪胆酸钠盐、7-酮基石胆酸、23-脱甲胆酸、牛磺脱氧胆酸钠盐、猪脱氧胆酸、甘氨猪胆酸钠盐、23-脱甲脱氧胆酸、异石胆酸、12-酮基石胆酸、别石胆酸、石胆酸-3-硫酸钠盐、脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、甘氨熊脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、牛磺熊脱氧胆酸二水合物、甘氨石胆酸-3-葡糖苷、石胆酸、3β-熊去氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠盐、甘氨胆酸水合物、牛磺石胆酸钠盐、熊去氧胆酸、3-脱氢胆酸、猪胆酸、阿尔法-鼠胆酸、贝塔-鼠胆酸、牛磺胆酸、牛磺-阿尔法-鼠胆酸钠盐、甘氨脱氧胆酸，该方法包括：标准曲线建立、待测粪便样品处理和检测三个步骤，其中的标准曲线建过程包括利用UPLC-MS/MS联用建立各胆汁酸的浓度和峰面积的标准曲线；待测粪便样品处理过程包括将冷冻的待测粪便样品采用质谱水进行溶解，得到待测浆液；采用萃取剂将待测浆液进行萃取和离心分离，得到上清液；将上清液进行干燥后采用初始流动相进行复溶，得到复溶体系；将复溶体系进行离心得到待检测液，萃取剂包括乙腈和甲醇，混合液中乙腈和甲醇的体积为7:3～9:1，初始流动相包括体积比为7:3～9:1的乙腈和0.1％的甲酸水溶液的混合液；检测过程包括采用UPLC-MS/MS联用对待检测液进行检测，得到各胆汁酸的离子谱峰；根据标准曲线和离子谱峰换算各胆汁酸的含量，其中，UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱为C18色谱柱，所用流动相包括可选的A相和B相，A相为0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈，同时含有A相和B相时，A相和B相的体积比为45:55～80:20。
本申请将UPLC-MS/MS联用，提高了检测结果的准确性，且在样品处理过程中采用了上述特定组成的萃取剂和初始流动相对待检测粪便样品中的胆汁酸进行了充分萃取和分离，实现了采样的全面性；然后利用UPLC-MS/MS联用结合C18色谱柱和特定的流动相组成，实现了所形成的待检测液中各胆汁酸的有效分离，得到分离度较好的各胆汁酸的离子谱峰，再利用内标法进行定量。由此可见，本申请方法基于超高效液相色谱质谱联用技术，方法特异性强、灵敏度高、检测范围广，可以对生物体内的33种胆汁酸进行分离，实现了胆汁酸的绝对定量。
为了便于跟踪，优选上述萃取剂还包括至少三种胆汁酸的同位素内标。
为了加快待检测粪便样品中的胆汁酸的提取，优选在采用质谱水溶解处理之前，将待测粪便样品在液氮中研磨成粉。采用上述萃取剂一次萃取即可，无需两次萃取，大大节省了前处理的步骤和时间；流动相使用简单的甲酸和乙腈溶液，不添加挥发性盐，更能够保证方法的稳定性。
本申请为了使待检测粪便样品中的胆汁酸被充分提取出来，在一种实施例中，上述采用萃取剂将待测浆液进行萃取和离心分离得到上清液的步骤包括：将萃取剂与待测浆液涡旋混合后置于0～5℃下静置3～10min以进行萃取形成萃取体系；将萃取体系在2～5℃下进行离心，得到上清液。其中在上述温度下进行静置的目的是使待检测物质可以被充分萃取出来；在上述温度下进行离心的目的是避免待检测物质降解。萃取时，萃取剂用量越多，萃取越快，本领域技术人员可以根据实际需要选择合适的萃取剂与待测粪便样品的比例。
为了进一步提高进入色谱柱的样品纯度，提高检测精度，优选上述将上清液进行干燥后采用初始流动相进行复溶得到复溶体系的步骤包括：采用氮吹仪将上清液进行吹干处理，得到干燥物；采用初始流动相对干燥物进行复溶，得到复溶体系，优选初始流动相与待测粪便样品的比例为1：1～2：1，优选初始流动相包括体积比为8:2的乙腈和0.1％的甲酸水溶液的混合液。流动相使用0.1％甲酸水溶液和乙腈，不需要添加挥发性盐即可实现待检测物质的良好分离，并且稳定性更强。
为了提高本申请的各胆汁酸的分离度，优选上述色谱柱的柱参数为2.1×100mm×2.5μm。进一步优选上述检测过程中，色谱柱的柱温为48～52℃。
由于本申请的检测对象中胆汁酸种类太多，为了保证各胆汁酸良好的分离度，优选上述检测过程中采用梯度洗脱，该梯度洗脱过程中，流动相自初始流动相开始以A相逐渐减小B相逐渐增加的方式进行梯度变化，并以与初始流动相相同组成的流动相洗脱结束梯度洗脱。
Figure BDA0002832424100000051
Figure BDA0002832424100000061
为了进一步提高各胆汁酸的分离度，在一种实施例中，上述初始流动相洗脱的时间为1min，且初始流动相洗脱结束后在10～15min内，流动相中A相和B相的体积比自65:35逐渐变化至45:55，接着以B相洗脱2～3min后再以初始流动相进行洗脱。
本申请UPLC-MS/MS联用中，检测时所采用的检测器可以为本领域常规的检测其，优选上述检测所采用的离子源为负离子电离模式的电喷雾电离源。为了提高检测效率和准确性，优选上述离子源温度为520～560℃、离子源电压-4500V。
此外，优选地，上述萃取剂还包括至少三种所述胆汁酸的同位素内标，本申请所采用的同位素内标可以参考现有技术中所选用的胆汁酸的同位素内标，为了提高内标标识，优选上述同位素内标为鹅去氧胆酸-D4、胆酸-D4、熊去氧胆酸-D4、甘氨鹅脱氧胆酸-D4、甘氨胆酸-D4和石胆酸-D4。
以下将结合实施例和对比例，进一步说明本申请的有益效果。
实施例1
内标工作液配制：
先将6种胆汁酸内标物鹅去氧胆酸-D4、胆酸-D4、熊去氧胆酸-D4、甘氨鹅脱氧胆酸-D4、甘氨胆酸-D4和石胆酸-D4分别配制成1mg/mL的内标母液，再将母液按照表1中所示浓度进行稀释得到内标储备液，将内标储备液再次按照表1中的要求做下一步处理得到内标工作液。
表1
Figure BDA0002832424100000062
色谱条件：
色谱柱：Agela Venusil MP C18 2.1mm×100mm×2.5μm；
流动相：A相：0.1％甲酸水溶液；B相：乙腈；
柱温：50℃；
进样量：2μL；
色谱梯度如表2所示。
表2
时间min 流速ml/min A％ B％
0.0 0.5 80 20
0.5 0.5 80 20
1.0 0.5 65 35
2.5 0.5 63 37
4.1 0.5 62 38
5.0 0.5 62 38
6.0 0.5 61 39
6.5 0.5 60 40
8.5 0.5 56 44
9.0 0.5 55 45
9.5 0.5 48 52
11.5 0.5 45 55
12.5 0.5 0 100
15.0 0.5 0 100
15.1 0.5 80 20
17.0 0.5 80 20
质谱条件：
电喷雾电离(ESI)源，负离子电离模式。离子源温度550℃,离子源电压-4500V，气帘气30psi，雾化气和辅助气均为65psi，采用多重反应监测(MRM)进行扫描。
线性溶液配制和标准曲线建立：
用移液器分别移取33种胆汁酸母液(1mg/mL)30μL，加入甲醇10μL，混匀，制得浓度为30000ng/mL的线性母液，以甲醇为稀释液对浓度为30000ng/mL的线性母液进行稀释，得到浓度为20000ng/mL的线性母液、10000ng/mL的线性母液、1000ng/mL的线性母液、100ng/mL的线性母液、10ng/mL的线性母液、3000ng/mL的线性母液、300ng/mL的线性母液、30ng/mL的线性母液。
在上述色谱条件和质谱条件对线性母液进行测试，得到图1所示的33种胆汁酸混标的提取离子流图。图中有部分曲线重叠，比如像9.42分钟出峰的23-脱甲脱氧胆酸与9.56分钟出峰的12-酮基石胆酸两种物质，但是重叠的曲线并不是完全覆盖，而是存在交叉，因此仍然可以进行定量。并根据该图建立相应的标准曲线，各标准曲线的对应的线性回归方程见表3，并且根据样品谱图和标准曲线方程计算得到的各胆汁酸的定量结果见表3。
表3
Figure BDA0002832424100000081
Figure BDA0002832424100000091
粪便样本处理和检测：
1)从冰箱中取出样本；
2)将研磨珠放入2ml研磨管中，将研磨管放入液氮中做预冷处理，取出后放到千分位天平去皮，称取100mg粪便样本放入其中并放回液氮中预冷；
3)将分装好的样本放到研磨机上按照默认的参数(50Hz，1Min)做研磨处理；
4)用移液枪吸取900μL质谱水加入到研磨好的粉末中，涡旋混匀，配成匀浆液；
5)吸取100μL稀释完的匀浆液转移到1.5mL离心管中，加入500μL含同位素内标的萃取剂(乙腈/甲醇8:2V/V)，涡旋混匀1min，冰浴放置5min后，在4℃条件下12000g离心10min；
6)尽量转移全部上清到1.5mL的离心管中，待样本转移完成后，放到氮吹仪上进行吹干，用100μL初始比例的流动相进行复溶，涡旋混匀后，4℃条件下12000g离心10min，转移上清到样品瓶内，作为待测液；
7)取出色谱样品托盘，将样品按顺序置于托盘上。
8)采用上述色谱条件和质谱条件对处理后得到的待测液进行分析，得到的谱图如图2所示。
对比例1
与实施例1相比，区别在于萃取剂为乙腈。
各取100mg粪便样本，分别使用实施例1和对比例1的萃取剂进行萃取，后取等量样本上机检测，从总离子流图2和3可以看出，使用实施例1的萃取剂处理后的样本(图2，信号为1.9E8)，信号比对比例1的萃取剂处理后的样本(图3，信号为1.6E8)高，说明乙腈/甲醇体积比8:2的萃取剂萃取效率比乙腈高。
对比例2
与实施例1相比，区别在于萃取剂为甲醇。
各取100mg粪便样本，分别使用实施例1和对比例2的萃取剂进行萃取，后取等量样本上机检测，从总离子流图2和4可以看出，使用实施例1的萃取剂处理后的样本(.附图2，信号为1.9E8)，信号比对比例2的萃取剂处理后的样本(图4，信号为1.6E8)高，说明乙腈/甲醇体积比8:2的萃取剂萃取效率比甲醇高。
实施例2
与实施例1相比，区别在于色谱梯度如表4所示。
表4
时间min 流速ml/min A％ B％
0.0 0.5 80 20
0.5 0.5 80 20
2 0.5 65 35
10 0.5 50 50
16 0.5 0 100
16.1 0.5 80 20
19 0.5 80 20
按照实施例2的色谱梯度对混标样品进行分离，分离效果较实施例1差，具体表现为峰分布不均，并且梯度末尾有杂峰，详见图5示出的总离子流图。
对比例3
与实施例1相比，区别在于初始流动相组成为A相和B相体积比为6:4。
按照对比例3的初始比例，分离效果较实施例1差，具体表现为物质出峰太早，部分物质在死体积(1分钟之内)出峰，部分峰无法实现分离，详见图6示出的总离子流图。
对比例4
与实施例1相比，区别在于初始流动相组成为纯B相。按照对比例4的初始比例，分离效果较实施例1差，具体表现出峰晚并且在5-10分钟密集出峰，部分峰之间无法分离，详见图7示出的总离子流图。
对比例5
与实施例1相比，区别在于萃取剂为乙醇。
各取100mg粪便样本，分别使用实施例1和对比例5的萃取剂进行萃取，后取等量样本上机检测，从总离子流图2和8可以看出，使用实施例1的萃取剂处理后的样本(图2，信号为1.9E8)，信号比对比例5的萃取剂处理后的样本(图8，信号为1.1E8)高，说明乙腈/甲醇体积比8:2的萃取剂萃取效率比乙醇高。
对比例6
与实施例1相比，区别在于萃取剂为异丙醇。
各取100mg粪便样本，分别使用实施例1和对比例6的萃取剂进行萃取，后取等量样本上机检测，从总离子流图2和9可以看出，使用实施例1的萃取剂处理后的样本(图2，信号为1.9E8)，信号比对比例6的萃取剂处理后的样本(图9，信号为1.3E8)高，说明乙腈/甲醇体积比8:2的萃取剂萃取效率比异丙醇高。
对比例7
与实施例1相比，区别在于使用C8色谱柱，柱参数为100mm×2.1mm×1.7μm，色谱梯度如表5所示。
表5
时间min 流速ml/min A％ B％
0.0 0.5 80 20
0.5 0.5 80 20
2 0.5 65 35
8 0.5 0 100
10 0.5 0 100
10.1 0.5 80 20
12 0.5 80 20
按照对比例5的色谱梯度对混标样品进行分离，分离效果较实施例1差，具体表现为2.5-5.5分钟密集出峰，并且峰之间无法分离，详见图10示出的总离子流图。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
本申请将UPLC-MS/MS联用，提高了检测结果的准确性，且在样品处理过程中采用了上述特定组成的萃取剂和初始流动相对待检测粪便样品中的胆汁酸进行了充分萃取和分离，实现了采样的全面性；然后利用UPLC-MS/MS联用结合C18色谱柱和特定的流动相组成，实现了所形成的待检测液中各胆汁酸的有效分离，得到分离度较好的各胆汁酸的离子谱峰，再利用内标法进行定量。由此可见，本申请方法基于超高效液相色谱质谱联用技术，方法特异性强、灵敏度高、检测范围广，可以对生物体内的33种胆汁酸进行分离，实现了胆汁酸的绝对定量。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种UPLC-MS/MS联用检测粪便中胆汁酸的方法，其特征在于，所述胆汁酸包括牛磺猪脱氧胆酸钠盐、牛磺猪胆酸钠盐、7-酮基石胆酸、23-脱甲胆酸、牛磺脱氧胆酸钠盐、猪脱氧胆酸、甘氨猪胆酸钠盐、23-脱甲脱氧胆酸、异石胆酸、12-酮基石胆酸、别石胆酸、石胆酸-3-硫酸钠盐、脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛磺鹅去氧胆酸钠盐、甘氨熊脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、胆酸、牛磺熊脱氧胆酸二水合物、甘氨石胆酸-3-葡糖苷、石胆酸、3β-熊去氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸钠盐、甘氨胆酸水合物、牛磺石胆酸钠盐、熊去氧胆酸、3-脱氢胆酸、猪胆酸、阿尔法-鼠胆酸、贝塔-鼠胆酸、牛磺胆酸、牛磺-阿尔法-鼠胆酸钠盐、甘氨脱氧胆酸，所述方法包括：
标准曲线建立，利用UPLC-MS/MS联用建立各所述胆汁酸的浓度和峰面积的标准曲线；
待测粪便样品处理，将冷冻的待测粪便样品采用质谱水进行溶解，得到待测浆液；采用萃取剂将所述待测浆液进行萃取和离心分离，得到上清液；将所述上清液进行干燥后采用初始流动相进行复溶，得到复溶体系；将所述复溶体系进行离心得到待检测液，所述萃取剂包括乙腈和甲醇的混合液，所述混合液中所述乙腈和所述甲醇的体积为7:3～9:1，所述初始流动相包括体积比为7:3～9:1的乙腈和0.1％的甲酸水溶液的混合液；
检测，采用UPLC-MS/MS联用对所述待检测液进行检测，得到各所述胆汁酸的离子谱峰；根据所述标准曲线和所述离子谱峰换算各所述胆汁酸的含量，其中，所述UPLC-MS/MS联用所用的色谱柱为C18色谱柱，所用流动相包括可选的A相和B相，所述A相为0.1％甲酸水溶液，所述B相为乙腈，同时含有所述A相和所述B相时，所述A相和所述B相的体积比为45:55～80:20。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用萃取剂将所述待测浆液进行萃取和离心分离得到上清液的步骤包括：
将所述萃取剂与所述待测浆液涡旋混合后置于0～5℃下静置3～10min以进行所述萃取形成萃取体系；
将所述萃取体系在2～5℃下进行离心，得到所述上清液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将所述上清液进行干燥后采用初始流动相进行复溶得到复溶体系的步骤包括：
采用氮吹仪将所述上清液进行吹干处理，得到干燥物；
采用所述初始流动相对所述干燥物进行复溶，得到所述复溶体系，优选所述初始流动相与所述待测粪便样品的比例为1：1～2：1，优选所述初始流动相包括体积比为8:2的乙腈和0.1％的甲酸水溶液的混合液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱柱的柱参数为2.1mm×100mm×2.5μm。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测过程中，所述色谱柱的柱温为48～52℃。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测过程中采用梯度洗脱，所述梯度洗脱过程中，所述流动相自所述初始流动相开始以A相逐渐减小B相逐渐增加的方式进行梯度变化，并以与所述初始流动相相同组成的流动相洗脱结束所述梯度洗脱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述初始流动相洗脱的时间为1min，且初始流动相洗脱结束后在10～15min内，所述流动相中A相和B相的体积比自65:35逐渐变化至45:55，接着以B相洗脱2～3min后再以初始流动相进行洗脱。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测所采用的离子源为负离子电离模式的电喷雾电离源。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述离子源温度为520～560℃、离子源电压-4500V。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取剂还包括至少三种所述胆汁酸的同位素内标，所述同位素内标为鹅去氧胆酸-D4、胆酸-D4、熊去氧胆酸-D4、甘氨鹅脱氧胆酸-D4、甘氨胆酸-D4和石胆酸-D4。
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