CN111141854A - 一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法 - Google Patents

一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111141854A
CN111141854A CN201811314619.4A CN201811314619A CN111141854A CN 111141854 A CN111141854 A CN 111141854A CN 201811314619 A CN201811314619 A CN 201811314619A CN 111141854 A CN111141854 A CN 111141854A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polar
metabolites
organic solvent
biological sample
liquid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811314619.4A
Other languages
English (en)
Inventor
张晓哲
刘丹
刘欣欣
程孟春
赵楠
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Original Assignee
Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian Institute of Chemical Physics of CAS filed Critical Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority to CN201811314619.4A priority Critical patent/CN111141854A/zh
Publication of CN111141854A publication Critical patent/CN111141854A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • G01N30/04Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06Preparation
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • G01N30/04Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06Preparation
    • G01N30/14Preparation by elimination of some components
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • G01N2030/022Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027Liquid chromatography
    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02Column chromatography
    • G01N30/04Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06Preparation
    • G01N2030/062Preparation extracting sample from raw material

Abstract

本发明公开了一种用于生物样本中极性和弱极性代谢物同时提取的方法,在待分析的生物样本中对极性和弱极性代谢物进行选择性富集。分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层,上层直接于nano‑LC‑MS非靶向分析多肽组,下层经干燥复溶后于LC‑MS非靶向分析弱极性代谢物和靶向分析诸如类固醇激素类成分的物质。本发明的优点在于可以通过少量生物样品一次性提取尽可能多的极性和弱极性代谢物,并进行非靶向和靶向代谢组分析,节约了生物样本用量,极性代谢物组和弱极性代谢物组来自同一样本,两者之间的相对重复性好于多次提取,便于多平台分析的数据整合。

Description

一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法
技术领域
本申请涉及分析化学领域,具体涉及一种在生物样本中同时提取极性和弱极性代谢物并进行基于液相色谱-质谱联用的极性和弱极性代谢物分析的方法。
背景技术
生物体的代谢紊乱涉及众多疾病的发生发展,基于液相色谱-质谱联用的非靶向和靶向代谢组分析是研究疾病代谢标志物的重要手段。生物样本组成成分复杂,尤其是血浆含有高丰度蛋白质干扰物;在人体活体检查时获得的生物样本量有限,常用的小鼠模型可得到的血浆和组织样本亦很少;且极性和弱极性代谢物极性差异较大,使得同时提取较困难,分别提取的方法消耗生物样本量较大,且两者之间的相对重复性较差,不利于多平台分析的数据整合。因此需要在实际的代谢物组学分析中采用一种高效、节省组织用量的同时提取极性和弱极性代谢物组的提取方法。
目前,有机溶剂(甲醇、乙腈、丙酮等)的蛋白质沉降方法和有机溶剂(氯仿/甲醇、甲基叔丁基醚)萃取是生物样品前处理的常规技术,但对于组成及其复杂的生物样本,如血浆样本,高丰度蛋白去除不彻底,带来样本分析过程的污染问题和色谱分离柱的消耗问题,并且极难与高效毛细管液相色谱兼容分析血浆中代谢物;SPE和超滤膜成本较高,处理步骤繁琐、耗时较长。虽然在线SPE样品前处理简化了整个处理过程,手动操作步骤减少,但在线操作需要特殊设备,其维护和方法设置较复杂,且往往带来较长的色谱运行时间,因此,实验室和临床样本分析中很少用到。
针对目前常用生物样本提取方法存在的需要分别提取极性和非极性代谢物组;且很难与毛细管高效液相色谱兼容性差等不足,本发明发展了一种从生物样本中同时提取极性和弱极性代谢物的新方法,单次提取同时获得生物样本中极性和弱极性的代谢物,继而通过毛细管液相色谱-质谱和高效液相色谱-质谱方法进行生物样本代谢物组分析。
发明内容
本发明的目的在于建立一种在生物样本中同时获得极性和弱极性代谢物并用于nanoLC-MS和LC-MS分析的新方法。
该方法至少包括以下步骤:
(1)向生物样品加入酸性蛋白变性剂,定量移取并加入内标溶液,涡旋混匀,得到体系I;
(2)将步骤(1)中体系I进行极性和弱极性代谢物的选择性富集及杂质去除,得到体系II;
(3)将步骤(2)中的体系II进行有机溶剂萃取,分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层。
在优选的实施方式中,该方法还包括,将所述富含极性代谢物的上层进行毛细管液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析,将富含弱极性代谢物的下层进行超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析。
在该方法中,所述生物样品的体积为50μL~1200μL,酸性蛋白变性剂溶液用量为生物样品用量的0.1~1倍,优选地为0.1~0.4倍体积。
优选地,酸性蛋白变性剂选自磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液、三氯乙酸水溶液中的至少一种。
优选地,所述酸性蛋白变性剂溶液的浓度为0.1v%~5v%。
在极性和弱极性代谢物选择性富集及杂质去除的步骤中,采用盐析辅助液液萃取。
在优选的实施方式中,将盐析辅助液液萃取试剂加入到步骤(1)中所述体系I中,振荡,涡旋,离心,取上层上清液。
所述盐析辅助液液萃取试剂包括亲水性有机溶剂和盐溶液,其中,优选所述亲水有机溶剂与生物样品的体积比为20:1~1:1,盐溶液和亲水性有机溶剂的体积比为1:1~1:4;
进一步优选地,所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙腈和异丙醇中的至少一种。
进一步优选地,所述盐溶液选自磷酸氢二钾溶液、磷酸钾溶液和氯化镁溶液中的至少一种。优选地,所述盐溶液的溶剂为水,盐溶液的浓度为0.7M~4M。
在将盐析辅助液液萃取试剂加入到体系I的步骤中,先加入所述盐溶液,再加入所述亲水有机溶剂。
优选地,所述振荡的次数为10次。
优选地,所述振荡之后进行涡旋,涡旋的时间为25~35秒。
优选地,所述离心的条件为3000rpm~15000rpm离心20分钟-60分钟。
优选地,亲水有机溶剂复溶的步骤包括:加入亲水有机溶剂后,超声,涡旋,取上清液。优选地,所述超声的时间为25秒~35秒,涡旋的时间为2秒~35秒。
步骤(3)中所述极性和弱极性代谢物收集包括:将步骤(2)中所述体系II中的上清液干燥,加入液相色谱流动相A复溶,加入有机溶剂,振荡,涡旋,离心,上层上清液为极性代谢物富集组分,可用于nano-LC-MS分析极性代谢物和多肽组。下层溶液为弱极性代谢物富集组分,干燥后,加入液相色谱流动相B,振荡,涡旋,离心,上清液用于LC-MS分析弱极性代谢物和脂质组。
优选地,所述液相色谱流动相A为体积分数为5%~30%的乙腈,溶剂为水,加入量为1/20~1/5倍生物样品体积。
优选地,所述液相色谱流动相A与有机溶剂的体积比为1:1~5:1。
优选地,所述超声的时间为25~35秒;所述涡旋的时间为25~35秒。
优选地,所述离心的条件为3000rpm~15000rpm离心20~60分钟。
优选地,所述液相色谱流动相B的体积分数为40%~60%乙腈,加入量为1/20~1/5倍生物样品体积。
优选地,所述液相色谱流动相B与有机溶剂的体积比为1:1~5:1,进一步优选地,液相色谱流动相B的加入量为20μl~100μl。
步骤(2)中去除的杂质包括高丰度蛋白、无机盐和固体杂质。
生物样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液、生物组织匀浆液。
本申请所使用的萃取方法之一是盐析辅助液液萃取系统(SALLE),它时一种萃取富集代谢物的有效手段,由亲水性有机溶剂、盐溶液组成,具有条件温和,操作简单,可调因素多等优势。
本申请中,“高丰度蛋白质”,是指mg/ml级的蛋白质。
本申请中,“nanoLC-MS”,是指纳升液相色谱-质谱分析。
本申请中,所有涉及数值范围的条件均可独立地选自所述数值范围内的任意中间范围。
本申请中,如无特别说明,所有涉及数值范围的条件均包含端点值。
本申请中,本领域技术人员根据所述方案中涉及的范围条件(如体积比等)中的任一具体数值条件,均可完成本申请中的技术方案,实现本申请中所述的有效效果。
通过本发明的方法,可以从血浆、血清、尿液、脑脊液、组织匀浆液等中,同时获得极性和弱极性代谢物,去除高丰度蛋白、无机盐和固体杂质等干扰物,用于nanoLC-MS非靶向分析极性代谢物组和多肽组,LC-MS分析非靶向和靶向分析弱极性代谢物,从而产生了如下有益效果。
本申请能产生的有益效果包括:
1.极性和弱极性代谢物来自于同一次提取,两者之间的相对重复性好于多次提取,便于多平台分析的数据整合。
2.本申请中同时获取极性和弱极性代谢物,极性代谢物富集于上层,弱极性代谢物富集于下层,减少了生物样本用量。
3.本申请中极性和弱极性代谢物首先富集于SALLE体系的上层亲水有机相,易于萃取液的转移,且亲水有机溶剂沸点低易于后处理。
4.本申请中盐析辅助液液萃取所选用的亲水有机溶剂可与水完全混溶,因此不需要漫长或剧烈的混合步骤来促进代谢物和杂质在两相间的分配,也不需要长时间的高速离心来辅助体系的分相,操作过程简单、快速,适用于高通量分析。
附图说明
图1A血浆中极性代谢物的总离子流图。
图1B血浆中弱极性代谢物的总离子流图。
图2抑郁症和对照组血浆弱极性代谢物组提取特征的分布。
图3A抑郁症和对照组血浆样本极性代谢物的PLS-DA因子得分图。
图3B抑郁症和对照组血浆样本弱极性代谢物的PLS-DA因子得分图。
图4A示出实施例1中多肽联合标志物受试者工作特征曲线(ROC曲线)
图4B示出实施例1中弱极性小分子联合标志物受试者工作特征曲线(ROC曲线)
图4C示出实施例1中多肽和弱极性小分子联合标志物受试者工作特征曲线(ROC曲线)
图5极性和弱极性同时提取方法和经典的甲基叔丁基醚萃取血浆中类固醇激素的提取峰面积比较。
具体实施方式
作为一种具体的实施方式,所述方法至少包括:
(a)代谢物解析附:在生物样品中加入酸性溶液(磷酸、三氟乙酸、三氯乙酸),涡旋30秒,解吸附与高丰度蛋白质弱共价键吸附的代谢物;
(b)代谢物的选择性富集及杂质去除:生物体液样本经步骤(a)处理后,加入生物体液样本体积2.5~10倍的磷酸氢二钾水溶液,涡旋30秒,加入生物体液样本体积1~10倍的异丙醇,充分振荡10次,涡旋30秒,3000rpm离心10分钟,同时进行代谢物的选择性富集和高丰度蛋白质、无机盐和固体杂质的去除。
(c)代谢物收集:在步骤(b)干燥的样品中加入小体积1/20~1/5的液质分析兼容的低浓度有机溶剂A(5~30%乙腈),加入二氯甲烷或三氯甲烷,使低浓度有机溶剂与二氯甲烷或三氯甲烷体积比为1:1~5:1,超声30秒,涡旋30秒,15000rpm离心40分钟,取上层上清即为所需的极性代谢物富集组分,用于Nano-LC-MS分析,取下层溶液干燥,加入小体积1/20~1/5的液质分析兼容的有机溶剂B(40~60%乙腈),超声30秒,涡旋30秒,15000rpm离心10分钟,取上清即为所需的弱极性代谢物富集组分,用于LC-MS分析。
下面结合实施例详述本申请,但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明,本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
本申请的实施例中分析方法如下:
利用LTQ-Orbitrap Discovery(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)联合nano-LC(Eksigent Technologies,California,USA)进行非靶向分析多肽组。利用Agilent G6200 Series Time-of-Flight联合Agilent 2695LC(Agilent,USA)进行非靶向弱极性代谢组分析。QTrap 5500(SCIEX,USA)进行靶向类固醇激素分析。在本发明中,以类固醇激素为例,对弱极性代谢组进行了靶向分析,但是本领域技术人员应该知晓,通过本发明方法富集得到的弱极性代谢物,还适用于其他类型目标物的靶向分析。
实施例1同时提取分析血浆中极性和弱极性代谢物
1.血浆收集
用商业化的真空采血管(BDTM P800,Becton,Dickinson and Company,USA)收集抑郁症患者和健康对照组全血(所有纳入研究的志愿者在血浆样本采集前已签署知情同意书),在3000rpm转速下离心10min,取上清液即得血浆,可直接预处理或冰箱-80℃保存。
2.血浆中极性和弱极性代谢物同时提取
(1)蛋白质变性
取步骤(1)中的人血浆600μL,置于10ml离心管中,加入催产素的同位素内标(终浓度200pg/mL)(Pro[13C5,15N]oxytocin,Invitrogen Trading Co.,Ltd,上海,中国)、孕酮、孕烯醇酮、17羟孕酮、可的松、脱氢表雄酮、雄烯二酮、雌酮、雌二醇的同位素内标(终浓度100pg/mL)(shanghai Pufen Biotechnology Co.,Ltd,上海,中国),加入240μL 5v%磷酸水溶液,涡旋30s。
(2)极性和弱极性代谢物富集和杂质去除
血浆样本经步骤(2)处理后,加入4mL的磷酸氢二钾水溶液(4M),涡旋30秒,加入4mL异丙醇,充分振荡10次,涡旋30秒,在3000rpm转速下离心10分钟,转移离心管中的上层上清液4ml至新离心管。
(3)极性和弱极性代谢物收集
将步骤(3)处理的样品转移至氮吹仪中,氮吹至干燥,加入80μL的15%乙腈(体积分数为15%,溶剂为水)和40μL二氯甲烷,超声30秒,涡旋30秒,在15000rpm转速下离心40min,取上清即为所需的极性代谢物富集组分,取下层15μL,用40℃氮吹至干燥加入50μL的60%乙腈(体积分数为60%,溶剂为水)即为所需的弱极性代谢物富集组分。
3.基于nanoLC-LTQ-Oritrap的多肽组代谢物非靶向分析
将极性代谢物富集组分,使用nanoLC-LTQ-Oritrap进行检测。nanoLC分离所用分析柱采用内径为75μm,长20cm,一端带有10μm喷针的PicoFrit系列的毛细管柱(NewObjective,Woburn,MA,美国),C18(3μm,Dr.Maisch GmbH,Ammerbuch-Entringen,德国)填料实验室自装填。自装预柱(3cm×100μm ID),柱管PEEK column holder(Upchurch,Oak Harbor,WA,USA),填料C18AQ particles(5μm,Dr.Maisch GmbH,Ammerbuch-Entringen,Germany)。质谱仪分析在正离子模式下进行,喷雾电压为1.5-2.0V,加热毛细管温度为320℃。采用Xcalibur软件记录总离子流图(图1A),质荷比范围为m/z 100~2000。
4.基于LC-QTOF的血浆弱极性代谢组非靶向分析
将弱极性代谢物富集组分,使用LC-QTOF进行检测。色谱柱Agilent poroshell120EC-C18(150mm×3.0mm,2.7μm),柱温50℃。流动相A尾0.5%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,流速为0.35mL/min。洗脱梯度为:0-4min,20-70%B,4-10min,70-100%B,并保持2min,然后降至20%B并保持3min。质谱仪分析在正离子模式下进行,喷雾电压为3.5V,加热毛细管温度为350℃。采用Agilent MassHunter Workstation软件记录总离子流图(图1B),质荷比范围为m/z 100~1200。
抑郁症组(55例)和健康对照组(60例)之间的血浆代谢变化分别通过非靶向的多肽组学分析和非靶向的弱极性代谢物组学分析开展研究。通过当前的提取和分析方法,在极性代谢物富集组分中获得丰富的多肽信息,通过软件进行信息挖掘,426个多肽被鉴定。在弱极性代谢物富集组分分析中,通过软件进行信息提取,在QC和实际样品中共获得2249个离子特征,分子量在100~1000之间,m/z<300的小分子所占比重最大。用总离子强调校准离子特征的响应后,构建RSD分布图2。结果表明,92.7%的特征RSD%<30%,这些特征的响应和达到总响应的99.5%,所有这些数据表明该提取分析方法具有良好的重复性和稳定性。图3A和图3B分别为抑郁症组和健康对照组样本的极性代谢物组和弱极性代谢物组的PLS-DA分类图,抑郁症组和健康对照组可完全分开,即抑郁症患者血浆中极性多肽和弱极性的代谢物的代谢均呈现出显著的代谢干扰。抑郁症组和健康对照组共筛选出14个差异离子,有3个多肽在MDD组表达上调,11个表达下调,其中5个多肽被组合成联合多肽标志物(图4A)。在弱极性代谢物组鉴定了除脂类之外的34个差异代谢产物,归属于类固醇激素、酰胺肉碱、胆酸、维生素等成分,其中3个小分子被组合为联合标志物(图4B)。本发明涉及的同时提取方法,极性和弱极性代谢物来自于同一次提取,两者之间的相对重复性好于多次提取,可实现多肽组学分析和小分子代谢物组分析的数据整合,最终筛选2个多肽和3个弱极性小分子代谢物组成联合标志物,如图4C所示,其AUC达到0.994,灵敏度和特异性分别为99.5%和93.3%。
实施例2血浆中类固醇激素的靶向分析
1.血浆采集
取商业化人血浆100uL,置于离心管中,加入催产素的同位素内标(终浓度200pg/mL)(Pro[13C5,15N]oxytocin,Invitrogen Trading Co.,Ltd,上海,中国),孕酮、孕烯醇酮、17羟孕酮、可的松的同位素内标(终浓度100pg/mL)(shanghai Pufen BiotechnologyCo.,Ltd,上海,中国)。
2.极性和弱极性代谢物同时提取
(1)蛋白质变性
加入40μL 5v%磷酸水溶液,涡旋30s。
(2)代谢物富集和杂质去除
血浆样本经步骤(1)处理后,加入4mL的磷酸氢二钾水溶液(4M),涡旋30秒,加入4mL异丙醇,充分振荡10次,涡旋30秒,在3000rpm转速下离心10分钟,转移离心管中的上层上清液4ml至新离心管。
(3)代谢物收集
将步骤(2)处理的样品转移至氮吹仪中,氮吹至干燥,加入50μL的60%乙腈复溶。
3.甲基叔丁基醚提取弱极性代谢物组(经典的弱极性代谢物组提取方法)
采用经典的甲基叔丁基醚提取血浆中的弱极性代谢物组,并移取相当体积的上层溶液,干燥后60%乙腈复溶。
4.靶向分析类固醇激素
超高效液相色谱-电喷雾三重四级杆质谱仪(QTrap AB)用于血浆弱极性代谢物富集组分中类固醇激素的靶标分析,进样量为5uL。色谱柱Agilent poroshell 120EC-C18(150mm×3.0mm,2.7μm),柱温50℃。流动相A为0.5%甲酸水溶液,流动相B为乙腈,流速为0.35mL/min。洗脱梯度为:0-2min,5-25%B,2-8min,25-70%B,8-10min,70-90%B,并保持2min,然后降至5%B并保持3min。质谱仪分析在正离子和负离子模式下进行,MRM模式的离子对和条件如表1所示。
表1类固醇激素MRM分析相关参数
定量比较两种提取方法对4种类固醇激素的提取回收率,如图5所示。与经典的弱极性代谢物组学提取方法甲基叔丁基醚提取物相比,极性和弱极性代谢物同时提取方法对4中类固醇激素的提取峰面积与经典方法相当或略高。
本发明涉及的同时提取方法,极性和弱极性代谢物来自于同一次提取,两者之间的相对重复性好于多次提取,可实现多肽组学分析和小分子代谢物组分析的数据整合,筛选联合标志物提高诊断准确性和灵敏度,该方法还具有节省生物样本、检测成本低、重复性好的特点。本发明还可应用于极性和弱极性代谢物的靶向分析,与经典的极性和弱极性代谢物组学提取方法80%甲醇沉淀和甲基叔丁基醚提取物相比,对生物样本中高丰度蛋白去除更彻底,允许提取物直接进样与毛细管液相色谱-质谱联用仪和高效液相色谱-质谱联用仪等超高效分析仪器。
以上所述,仅是本申请的几个实施例,并非对本申请做任何形式的限制,虽然本申请以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限制本申请,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本申请技术方案的范围内,利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例,均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法,其特征在于,至少包括以下步骤:
(1)向生物样品加入酸性蛋白变性剂,定量移取并加入内标溶液,涡旋混匀,得到体系I;
(2)将步骤(1)中体系I进行极性和弱极性代谢物的选择性富集及杂质去除,得到体系II;
(3)将步骤(2)中的体系II进行有机溶剂萃取,分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,将所述富含极性代谢物的上层进行毛细管液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析,将富含弱极性代谢物的下层进行超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述生物样品的体积为50μL~1200μL,酸性蛋白变性剂溶液用量为生物样品用量的0.1~1倍,优选地为0.1~0.4倍体积;
优选地,所述酸性蛋白变性剂选自磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液、三氯乙酸水溶液中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中所述极性和弱极性代谢物选择性富集及杂质去除的步骤包括盐析辅助液液萃取;
优选地,所述极性和弱极性代谢物的选择性富集及杂质去除的步骤包括:将盐析辅助液液萃取试剂加入到步骤(1)中所述体系I中,振荡,涡旋,离心,取上层上清液;
优选地,所述盐析辅助液液萃取试剂包括亲水性有机溶剂和盐溶液,其中,优选所述亲水有机溶剂与生物样品的体积比为20:1~1:1,盐溶液和亲水性有机溶剂的体积比为1:1~1:4;
进一步优选地,所述亲水性有机溶剂选自甲醇、乙腈和异丙醇中的至少一种;优选地,所述盐溶液选自磷酸氢二钾溶液、磷酸钾溶液和氯化镁溶液中的至少一种;优选地,所述盐溶液的溶剂为水,盐溶液的浓度为0.7M~4M。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,在将盐析辅助液液萃取试剂加入到体系I的步骤中,先加入所述盐溶液,再加入所述亲水有机溶剂。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述极性和弱极性代谢物收集包括:将步骤(2)中所述体系II中的上清液干燥,加入液相色谱流动相A复溶,加入有机溶剂,离心,上层为极性代谢物富集组分,下层为弱极性代谢物富集组分;
优选地,所述液相色谱流动相A为体积分数为5%~30%的乙腈,加入量为1/20~1/5倍生物样品体积;
优选地,所述有机溶剂选自二氯甲烷和三氯甲烷中的至少一种;
优选地,所述液相色谱流动相A与有机溶剂的体积比为1:1~5:1。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)中收集得到的弱极性代谢物富集组分干燥后,用液相色谱流动相B复溶;
优选地,所述液相色谱流动相B为体积分数为50%~70%的乙腈,加入量为20~100μl。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)中去除的杂质包括高丰度蛋白、无机盐和固体杂质。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物样品包括血浆、血清、尿液、脑脊液和生物组织匀浆液中的至少一种。
10.根据权利要求4或6所述的方法,其特征在于,所述离心的步骤以3000rpm~15000rpm,离心20分钟~60分钟执行。
CN201811314619.4A 2018-11-06 2018-11-06 一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法 Pending CN111141854A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811314619.4A CN111141854A (zh) 2018-11-06 2018-11-06 一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811314619.4A CN111141854A (zh) 2018-11-06 2018-11-06 一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111141854A true CN111141854A (zh) 2020-05-12

Family

ID=70515262

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811314619.4A Pending CN111141854A (zh) 2018-11-06 2018-11-06 一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111141854A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112014198A (zh) * 2020-06-09 2020-12-01 中国科学院生物物理研究所 一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法
CN112525631A (zh) * 2020-10-16 2021-03-19 华南农业大学 一种用于虾肉样本非靶向代谢组学和非靶向脂质组学研究的样品制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1294519A (zh) * 1999-02-18 2001-05-09 英法马有限公司 含有促进活性成分吸收活性的化合物的药物组合物
AU2007207241A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-26 Lattec I/S A novel dry stick device construction and method for determining an analyte in a sample using said dry stick device
CN101888828A (zh) * 2007-07-27 2010-11-17 蒂宝制药公司 脉冲胃滞留剂型
CN102323351A (zh) * 2011-08-12 2012-01-18 深圳华大基因科技有限公司 膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱、建立方法及用途
KR101490179B1 (ko) * 2013-06-14 2015-02-05 한국과학기술연구원 액체크로마토그래피 및 질량분석기를 이용하여 소금 중에 포함되어있는 여러 종류의 프탈레이트 성분들의 동시 분석방법
US20170328921A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-16 Sanis Biomedical, LLC Methods for detecting hormones and other analytes
CN108445116A (zh) * 2018-03-14 2018-08-24 中国科学院大连化学物理研究所 一种生物体液样品中游离催产素前处理方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1294519A (zh) * 1999-02-18 2001-05-09 英法马有限公司 含有促进活性成分吸收活性的化合物的药物组合物
AU2007207241A1 (en) * 2006-01-19 2007-07-26 Lattec I/S A novel dry stick device construction and method for determining an analyte in a sample using said dry stick device
CN101888828A (zh) * 2007-07-27 2010-11-17 蒂宝制药公司 脉冲胃滞留剂型
CN102323351A (zh) * 2011-08-12 2012-01-18 深圳华大基因科技有限公司 膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱、建立方法及用途
KR101490179B1 (ko) * 2013-06-14 2015-02-05 한국과학기술연구원 액체크로마토그래피 및 질량분석기를 이용하여 소금 중에 포함되어있는 여러 종류의 프탈레이트 성분들의 동시 분석방법
US20170328921A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-16 Sanis Biomedical, LLC Methods for detecting hormones and other analytes
CN108445116A (zh) * 2018-03-14 2018-08-24 中国科学院大连化学物理研究所 一种生物体液样品中游离催产素前处理方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PONZETTO, FEDERICO 等: "UHPLC-HRMS Analysis for Steroid Profiling in Serum (Steroidomics)", 《METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》 *
SIRKKU E.JÄNTTI 等: "Steroid and steroid glucuronide profiles in urine during pregnancy determined by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry", 《ANALYTICA CHIMICA ACTA》 *
米晓霞 等: "猪血浆中33种类固醇激素的高效液相色谱-", 《分析测试学报》 *
马有宁 等: "超高效液相色谱-串联质谱法测定斑马鱼性腺中13 种类固醇激素", 《分析测试学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112014198A (zh) * 2020-06-09 2020-12-01 中国科学院生物物理研究所 一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法
CN112525631A (zh) * 2020-10-16 2021-03-19 华南农业大学 一种用于虾肉样本非靶向代谢组学和非靶向脂质组学研究的样品制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6401230B2 (ja) 広範囲の疎水性を有する被検成分の精製及び検出のためのlc−ms構成
US8470602B2 (en) Methods and systems for determining the presence or amount of delta 5 steroid compounds in a sample
CN109564207B (zh) 用于检测和定量代谢物的质谱方法
Lopes et al. Metabolomic strategies involving mass spectrometry combined with liquid and gas chromatography
Zhao et al. Sensitive determination of cholesterol and its metabolic steroid hormones by UHPLC–MS/MS via derivatization coupled with dual ultrasonic‐assisted dispersive liquid–liquid microextraction
CN111141854A (zh) 一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法
Kim et al. Top–down lipidomic analysis of human lipoproteins by chip-type asymmetrical flow field-flow fractionation–electrospray ionization-tandem mass spectrometry
US20210302288A1 (en) Systems and methods for analyzing an analyte extracted from a sample using an adsorbent material
Li et al. Enrichment of peptides from plasma for peptidome analysis using multiwalled carbon nanotubes
Cheng et al. Enhancing performance of liquid sample desorption electrospray ionization mass spectrometry using trap and capillary columns
Zhang et al. Rapid screening and quantification of glucocorticoids in essential oils using direct analysis in real time mass spectrometry
EP3555615A1 (en) Mass spectrometry assay method for detection and quantitation of kidney function metabolites
CN108445116B (zh) 一种生物体液样品中游离催产素前处理方法
CN103529159A (zh) 一种血液非靶标代谢组学研究样品的前处理方法
Honour Gas chromatography-mass spectrometry
US11061005B2 (en) Mass spectrometry assay method for detection and quantitation of organic acid metabolites
Tang et al. On-line multi-residue analysis of fluoroquinolones and amantadine based on an integrated microfluidic chip coupled to triple quadrupole mass spectrometry
TW202111322A (zh) 新穎二維lc—ms/ms系統
CN105699575A (zh) 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中皮质醇的方法及试剂盒
Garwolińska et al. New sample preparation strategies for comprehensive lipidomics of human breast milk
CN113138275A (zh) 血清脂质代谢物组合物及试剂盒和应用
Yang et al. Quantitative of progesterone using isotope dilution-matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry
CN112014509A (zh) 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法
CN112964815A (zh) 生物体液多种类固醇激素的检测方法
Yuan et al. Strategies for Improving Sensitivity for Targeted Quantitation by LC–MS

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200512