CN110988235A - 一种人血清中15种胆汁酸谱的液相-质谱检测方法 - Google Patents

一种人血清中15种胆汁酸谱的液相-质谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本公开属于胆汁酸检测技术领域，具体涉及一种人血清中15种胆汁酸谱的液相‑质谱检测方法。由于血清中胆汁酸含量具有良好敏感性和特异性，其表达水平对肝硬化等疾病具有良好的指示作用，建立一种血清中胆汁酸谱的检测方法对于相关肝疾病的诊断具有重要意义。由于血清中胆汁酸含量相对较低，检测存在一定的难度。本公开提供了一种对人血清中15种胆汁酸谱进行检测的方法，采用液相‑质谱联用的方法，通过甲醇对血清样品进行预处理、梯度洗脱对样品中的胆汁酸成分进行分离后检测，可以对15种胆汁酸类成分实现精确的检测，应用于相关疾病的诊断具有重要的意义。

Description

一种人血清中15种胆汁酸谱的液相-质谱检测方法
技术领域
本公开属于胆汁酸检测技术领域，具体涉及一种通过液相色谱-串联质谱技术快速检测人血清中15种胆汁酸含量的方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
胆汁酸是一大类胆烷酸的总称，在脂肪代谢中起着重要作用。其生理功能可概括为：影响胆汁分泌、促进肠道对脂类物质的吸收并影响肠道功能。胆汁酸是由胆固醇在肝细胞中形成，并在摄食后分泌到肠道中。肝分泌到胆汁中的胆汁盐是强有力的乳化剂，在肠腔中，胆汁盐乳化脂肪，从而促进对脂类物质的消化和吸收。
胆汁酸按来源分：初级胆汁酸和次级胆汁酸；按结构分：游离型胆汁酸和结合型胆汁酸(甘氨酸或牛磺酸结合)；
Figure BDA0002291816430000011
胆汁酸为双亲分子，既含有亲水性的羟基及羧基或磺酸基，又含有疏水性烃核和甲基，因此胆汁酸又可以分为亲水性胆汁酸和疏水性胆汁酸；疏水性胆汁酸具有“去污性”，可以溶解细胞膜膜脂，引起细胞膜通透性增加，进而导致肝细胞坏死；亲水性胆汁酸有拮抗疏水性胆汁酸的毒性作用、刺激肝胆管分泌、调节免疫的作用；人体常见各种游离型及结合型胆汁酸按照亲水性大小的的顺序依次为：UDCA>CA>CDCA>DCA>LCA，牛磺酸结合型胆汁酸>甘氨酸结合型胆汁酸>游离型胆汁酸；研究证实胆汁酸疏水性与细胞毒性密切相关。UDCA作为亲水性最强的胆汁酸，几乎无毒性。LCA疏水性最强，毒性最大，可以导致动物肝脏实质细胞的损伤。
健康人体中，胆汁酸谱组分相对恒定，发生胆石症、动脉粥样硬化、高血压等多种疾病时，会引起人体胆汁酸代谢异常，导致胆汁酸含量发生改变，建立稳定可靠的胆汁酸检验方法，可以了解机体胆汁酸的代谢，有助于为疾病的诊断和治疗提供可靠的依据。由于胆汁采集通常需要穿刺获取，创面较大，取样不方便，本领域采用血清总胆汁酸(TBA)作为检测指标。血清总胆汁酸具有良好的敏感性和特异性，是反映急性肝细胞损伤的敏感指标，对于肝硬化等疾病的诊断具有重大意义。现有技术中多采用液相-质谱联用的检测手段对生物样品中的胆汁酸成分进行检测，如邓阳等人的研究中提供了一种通过液-质联用检测小鼠肝脏中16种胆汁酸的方案。专利CN107621503A中提供了一种通过LC-MC/MS检测胆汁和血清中熊脱氧胆酸的方法。
发明内容
由于健康状态下，血清中胆汁酸含量相对较低，当胆汁淤积时，血清中的胆汁酸浓度会随之升高。本公开通过研究提供了一种基于血清样本的胆汁酸检测方法，可以实现对人血清中15种胆汁酸谱进行检测，并且具有良好的检测灵敏度，对相关疾病的诊断具有重要的意义。
基于上述研究成果，本公开提供以下技术方案：
本公开第一方面，提供一种人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，所述胆汁酸谱包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、石胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛黄胆酸、牛黄鹅脱氧胆酸、牛黄熊脱氧胆酸、牛黄石胆酸、牛黄脱氧胆酸；
所述检测方法包括以下步骤：
(1)对待测血清进行预处理获取待测样品；
(2)通过液相-质谱联合检测待测样品。
优选的，所述步骤(1)的具体操作如下：向待测样品中加入甲醇涡旋后离心获取上清部分作为待测样品。
优选的，所述步骤(2)中液相采用梯度洗脱程度，所述梯度洗脱程序如下：0～0.8min，50～70％流动相B；0.8～2.8min，70～85％流动相B；2.8～3.5min，80～90％流动相B；3.5～5.0min，80～100％流动相B；5.0～7.0min，80～100％流动相B；7～8min，55～65％流动相B。
进一步优选的，所述梯度洗脱程序如下：
0～0.8min，55～65％流动相B；0.8～2.8min，75～85％流动相B；2.8～3.5min，80～85％流动相B；3.5～5.0min，90～100％流动相B；5.0～7.0min，80～100％流动相B；7～8min，58～63％流动相B。
优选的，所述步骤(2)中液相的流动相为：
流动相A：H2O-10mM乙酸铵，流动相B：MeOH。
优选的，所述步骤(2)中液相的流动相为：
流动相A：0.05％甲酸水-5mM乙酸铵，流动相B：甲醇-0.1％FA。
优选的，所述液相采用C18色谱柱进行检测。
优选的，所述质谱采用电喷雾离子源，或负离子模式。
优选的，所述检测采用内标法进行检测。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
1.现有技术中针对胆酸类成分检测通常选胆汁作为研究对象，血浆或血清中由于胆酸含量较低，检测难度较大。本公开提供的是一种以血清为检测对象的方法，并且可以一次性实现15种胆汁酸的检测。
2.本公开进一步调整了邓阳等人的研究提供了一种通过液-质谱联用方式测定小鼠肝脏中胆汁酸的方案，以肝脏样品作为检测对象，该方案中，高效液相需要采用较低的流速配合洗脱程序才能实现样品的分离。本公开针对洗脱程序着重进行了调整，采用1mL/min流速条件配合本公开中的洗脱程序可以实现快速的检测出多种胆汁酸成分，出峰时间均在8min之内，对于大批量样品的检测具有重要的意义。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中的胆酸的标准曲线图；
图2为实施例1中的脱氧胆酸的标准曲线图；
图3为实施例1中的鹅脱氧胆酸的标准曲线图；
图4为实施例1中的熊脱氧胆酸的标准曲线图；
图5为实施例1中的石胆酸的标准曲线图；
图6为实施例1中的甘氨胆酸的标准曲线图；
图7为实施例1中的甘氨脱氧胆酸的标准曲线图；
图8为实施例1中的甘氨鹅脱氧胆酸的标准曲线图；
图9为实施例1中的甘氨熊脱氧胆酸的标准曲线图；
图10为实施例1中的甘氨石胆酸的标准曲线图；
图11为实施例1中的牛黄胆酸的标准曲线图；
图12为实施例1中的牛黄脱氧胆酸的标准曲线图；
图13为实施例1中的牛黄鹅脱氧胆酸的标准曲线图；
图14为实施例1中的牛黄熊脱氧胆酸的标准曲线图；
图15为实施例1中的牛黄石胆酸的标准曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，血清胆汁酸是肝脏病理检查中的重要指标，对多种肝疾病具有指示作用。本公开提供了一种针对人血清中总胆汁酸进行检测的方法，能够同时检测血清中的15种胆汁酸成分，检测灵敏度高、精确度良好。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
1.1仪器说明
液质联用仪(LC-MS/MS)，包括Sciex API 4500plus或同类级别质谱，岛津LC 20AD泵和SIL-20AC自动进样器
分析软件Sciex Analyst(版本1.6.3)
色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18(4.6×150mm，5μm)
分析天平：精确度可达0.00001g
微量分析天平：精确度可达0.000001g
纯水系统：Milli-Q超纯水仪(18.2MΩ·cm)
涡旋混合器：工作转速可达2000rpm
离心机：工作转速14000g
标准品：胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、石胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛黄胆酸、牛黄鹅脱氧胆酸、牛黄熊脱氧胆酸、牛黄石胆酸、牛黄脱氧胆酸、甘氨胆酸-D5、牛黄胆酸-D5、牛黄脱氧胆酸-D4共18种标准品，品牌为：TRC。
试剂：甲醇(MeOH)、甲酸(FA)、乙酸铵、乙腈(ACN)、异丙醇均要求色谱级，PBSbuffer pH7.4；纯化水(H2O)18.2MΩ·cm。
所述标准品的配置方法如表1所示：
表1标准曲线配制浓度
Figure BDA0002291816430000051
Figure BDA0002291816430000061
所述质控样品配制浓度如下表2所示：
表2质控样品配制浓度
编号 分析物 质控样品配制浓度(ng/mL) 浓度标识
1 胆酸 3，9，90，480 1
2 脱氧胆酸 3，9，90，480 1
3 鹅脱氧胆酸 5，15，150，800 2
4 熊脱氧胆酸 5，15，150，800 2
5 石胆酸 10，30，300，1600 3
6 甘氨胆酸 10，30，300，1600 3
7 甘氨脱氧胆酸 10，30，300，1600 3
8 甘氨鹅脱氧胆酸 10，30，300，1600 3
9 甘氨熊脱氧胆酸 10，30，300，1600 3
10 甘氨石胆酸 10，30，300，1600 3
11 牛黄胆酸 10，30，300，1600 3
12 牛黄鹅脱氧胆酸 10，30，300，1600 3
13 牛黄熊脱氧胆酸 10，30，300，1600 3
14 牛黄石胆酸 20，60，600，3200 4
15 牛黄脱氧胆酸 10，30，300，1600 3
所述内标物的混合工作液(IS–Mix)的配置方法如表3所示：
表3内标物的混合工作液的配置浓度
Figure BDA0002291816430000062
Figure BDA0002291816430000071
1.2色谱条件:
色谱柱:Agilent Eclipse XDB C18(4.6×150mm，5μm)
流动相A：H2O-10mM乙酸铵
流动相B：MeOH
洗针溶剂：甲醇/乙腈/纯水/异丙醇(48:12:30:10，v/v/v/v)
进样量：20μL
流速：1mL/min
洗针液体积：200μL
针位置：49mm
浸洗时间：3sec
洗针模式：进样前和进样后
柱温：50℃
自动进样器温度：4℃
其中，高效液相采用梯度洗脱程序，所述洗脱程序如下表4所示：
表4高效液相梯度洗脱程序
Figure BDA0002291816430000072
当采用上述色谱条件时，各胆酸成分的出峰时间如下表5所示，备注：以上保留时间可能随色谱柱和仪器的不同有微调：
表5各胆酸成分出峰时间
分析物/内标 保留时间(minutes)
胆酸 ～5.2
脱氧胆酸 ～6.3
鹅脱氧胆酸 ～6.2
熊脱氧胆酸 ～4.8
石胆酸 ～7.3
甘氨胆酸 ～4.6
甘氨脱氧胆酸 ～5.3
甘氨鹅脱氧胆酸 ～5.1
甘氨熊脱氧胆酸 ～4.1
甘氨石胆酸 ～6.0
牛黄胆酸 ～4.1
牛黄鹅脱氧胆酸 ～4.6
牛黄熊脱氧胆酸 ～3.6
牛黄石胆酸 ～5.3
牛黄脱氧胆酸 ～4.7
甘氨胆酸-D5 ～4.6
牛黄胆酸-D5 ～4.1
牛黄脱氧胆酸-D4 ～4.7
1.3质谱条件:
接口：电喷雾离子源
模式：负离子模式
表6 MRM离子对
Figure BDA0002291816430000081
Figure BDA0002291816430000091
质谱参数如下表7所示：
表7质谱参数
参数 设置
IS -4500
Tem 500
CAD 12
CUR 30
Gas 1 60
Gas 2 60
EP -10
CXP -13
1.4配制准备
(1)500mM乙酸铵
称取1.927g乙酸铵，加入50mL纯水于试剂瓶中并混合。
(2)流动相及洗针液
流动相A(含5mM乙酸铵和0.05％甲酸的纯水):
转移10mL 500mM乙酸铵和0.5mL甲酸于1000mL纯水在适当的试剂瓶中配制并混合。
流动相B(甲醇-0.1％FA):
转移1000mL甲醇在适当的试剂瓶中，加入1mL甲酸并混合。
洗针液(甲醇/乙腈/纯水/异丙醇(48:12:30:10，v/v/v/v)):
将480mL甲醇，120mL乙腈，300mL水和100mL异丙醇在适当的试剂瓶中配制并混合。
1.5样品处理方法
将血清样品200μL于2mL EP管中，加入50μL内标工作液，涡旋混匀；向其中加入甲醇涡旋10min，然后10000rpm离心10分钟；取离心后的上清液900μL，在室温氮气下吹干，残渣用100μL甲醇复溶，涡旋，上液相色谱质谱联用系统进样20μL分析。
1.6数据计算
数据采用Sciex Analyst软件(版本1.6.2)采集并处理。以分析物峰面积与内标峰面积比对标准曲线中的分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。样品中分析物的实测浓度由以下回归方程计算：
y＝ax+b
其中y＝分析物与内标的峰面积比
b＝截距
a＝斜率
x＝分析物的浓度(ng/mL)
(权重因子1/x*x).
根据临床检验质量规范，进行方法学验证，相关结果如表8所示：表8精密度和准确度
Figure BDA0002291816430000111
Figure BDA0002291816430000121
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述胆汁酸谱包括胆酸、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、石胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、甘氨熊脱氧胆酸、甘氨石胆酸、牛黄胆酸、牛黄鹅脱氧胆酸、牛黄熊脱氧胆酸、牛黄石胆酸、牛黄脱氧胆酸；
所述检测方法包括以下步骤：
(1)对待测血清进行预处理获取待测样品；
(2)通过液相-质谱联合检测待测样品。
2.如权利要求1所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体操作如下：向待测样品中加入甲醇涡旋后离心获取上清部分作为待测样品。
3.如权利要求1所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相采用梯度洗脱程度，所述梯度洗脱程序如下：
0～0.8min，50～70％流动相B；0.8～2.8min，70～85％流动相B；2.8～3.5min，80～90％流动相B；3.5～5.0min，80～100％流动相B；5.0～7.0min，80～100％流动相B；7～8min，55～65％流动相B。
4.如权利要求3所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相采用梯度洗脱程度，所述梯度洗脱程序如下：
0～0.8min，55～65％流动相B；0.8～2.8min，75～85％流动相B；2.8～3.5min，80～85％流动相B；3.5～5.0min，90～100％流动相B；5.0～7.0min，80～100％流动相B；7～8min，58～63％流动相B。
5.如权利要求1所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相的流动相为：
流动相A：H2O-10mM乙酸铵，流动相B：MeOH。
6.如权利要求1所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中液相的流动相为：
流动相A：0.05％甲酸水-5mM乙酸铵，流动相B：甲醇-0.1％FA。
7.如权利要求1所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述液相采用C18色谱柱进行检测。
8.如权利要求1所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述质谱采用电喷雾离子源。
9.如权利要求1所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述质谱采用负离子模式。
10.如权利要求1所述人血清中胆汁酸谱的液相-质谱检测方法，其特征在于，所述检测采用内标法进行检测。
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