CN109030676A - 同时测定16种胆汁酸的串联质谱检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定16种胆汁酸的串联质谱检测试剂盒，包括：标准品、质控品、内标品、沉淀剂、稀释剂和流动相；所述的沉淀剂为甲醇、乙醇和乙腈中的至少一种；所述的稀释剂由水、甲醇、乙醇和乙腈组成；水、甲醇、乙醇和乙腈的体积比为1～50∶0～90∶0～50∶0～50，其中甲醇、乙醇和乙腈不同时为0；所述的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸铵或乙酸铵‑甲酸或乙酸的水溶液，所述流动相B为甲醇和/或乙腈。本发明还公开了所述串联质谱检测试剂盒的应用。本发明的串联质谱检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好等特点，可准确、简便、快速地同时测定基质中16种胆汁酸，具有广阔的应用价值。

Description

同时测定16种胆汁酸的串联质谱检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及临床检测领域，尤其涉及一种同时测定16种胆汁酸的串联质谱检测试剂盒及其应用。

背景技术

胆汁酸是胆固醇在肝脏降解代谢的产物，通过胆汁酸的肠肝循环，机体可有效地利用肝脏合成的有限的胆汁酸。胆汁酸按结构可分为2大类，一类为游离型胆汁酸，包括胆酸(CA)、去氧胆酸(DCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)和石胆酸(LCA)，另一类是游离型胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸的结合产物，分别称为甘氨结合型胆汁酸和牛磺结合型胆汁酸。

随着研究的进展，人们对胆汁酸的代谢调节及其生理功能和病理作用都有了更深入的了解。胆汁酸的浓度水平的变化，对肝胆疾病的诊断、鉴别及发病机理的研究具有重要价值。

在人体中，胆汁酸池为3～5g，肝脏合成胆汁酸的速度最大为6g/天，不到胆汁酸每天正常分泌的一半。人体通过肠肝循环，将90％～95％的胆汁酸经由门静脉重吸收入肝脏，从而有效地利用肝脏合成的有限的胆汁酸，故周围血中胆汁酸含量很低。因此，当肝脏对胆汁酸的摄取、分泌、运转功能受损及其他可引起胆汁酸代谢发生改变的疾病时，血中胆汁酸浓度会明显升高，血中胆汁酸浓度是反应肝功能损伤的敏感项目。

因为血中胆汁酸的浓度水平很低，这就要求检测方法的灵敏度很高。目前胆汁酸的检测方法有气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法等。气相色谱法和液相色谱法需对胆汁酸按类别进行水解和衍生，使得气相色谱法和液相色谱法的检测速度不高，样品通量不大，而且灵敏度低。

公开号为CN1281983A的中国专利文献公开了一种血清总胆汁酸测定试剂，该试剂是由含有硝基四氮唑蓝、氧化型辅酶I、黄递酶、丙酮酸钠、磷酸盐的缓冲液构成的试剂I；和由含有3α-HSD、人血清白蛋白、EDTA、磷酸盐缓冲液的溶液构成的试剂II组成。该试剂采用黄递酶和硝基四氮唑蓝组合，易污染比色杯及堵塞生化分析仪管道，其测定灵敏度也偏低，受血液中还原性物质及酶类的干扰严重；且试剂为冻干粉制剂，试剂复溶后的稳定时间短，临床使用不方便。

公开号为CN1378077A的中国专利文献公开了一种总胆汁酸测定方法和测定试剂，反应原理是利用3α-HSD和硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原性硫代氧化型辅酶(Thio-NADH)；在3α-HSD存在的条件下，3-酮类固醇和还原型辅酶I(NADH)又生成胆汁酸和氧化型辅酶(NAD)每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶I(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得胆汁酸的含量。该发明中提供的试剂，在2-8℃开盖使用状态下，试剂稳定的时间较短；在2-8℃度密闭避光存储的过程中，试剂稳定性不理想，随着放置时间的延长，反应度会下降。

因此有必要开发一种新的具有良好稳定性和检测准确性的胆汁酸测定试剂盒。

发明内容

本发明提供了一种同时测定16种胆汁酸的串联质谱检测试剂盒，采用该试剂盒可同时测定16种胆汁酸，具有准确、简便、快速等优点。

本发明提供了如下技术方案：

一种同时测定16种胆汁酸的串联质谱检测试剂盒，包括：标准品、质控品、内标品、沉淀剂、稀释剂和流动相；

所述的沉淀剂为甲醇、乙醇和乙腈中的至少一种；

所述的稀释剂由水、甲醇、乙醇和乙腈组成；水、甲醇、乙醇和乙腈的体积比为1～50∶0～90∶0～50∶0～50，其中甲醇、乙醇和乙腈不同时为0；

所述的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的水溶液，所述流动相B为甲醇和/或乙腈。

本发明所述的16种胆汁酸为胆酸(CA)、去氧胆酸(DCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨去氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)；所述的内标品为氘代去氧胆酸、氘代牛磺去氧胆酸和氘代甘氨去氧胆酸。

16中胆汁酸中，胆酸、去氧胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸和石胆酸为游离态，甘氨胆酸、甘氨去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、甘氨熊去氧胆酸和甘氨石胆酸为甘氨结合态，牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸和牛磺石胆酸为牛磺结合态；氘代去氧胆酸作为游离态胆汁酸的内标物，氘代甘氨去氧胆酸作为甘氨结合态胆汁酸的内标物，氘代牛磺去氧胆酸作为牛磺结合态胆汁酸的内标物。

由于氘代内标价格昂贵，若16种胆汁酸都采用氘代内标，经济上不具有可行性。本发明中分别选取游离态、甘氨结合态和牛磺结合态的胆汁酸氘代物各一种，分别作为游离态、甘氨结合态和牛磺结合态胆汁酸的内标，即可获得理想效果。

优选的，所述标准品包括多个，浓度呈梯度分布；所述标准品的浓度为1～10000ng/mL。

标准品的制备方法包括：

(a)配置16种胆汁酸的混合标准溶液，再用空白基质将混合标准溶液分别稀释至所需浓度；

(b)将稀释至所需浓度的标准品溶液经冷冻干燥预包被于孔板孔中；

或，将稀释至所需浓度的标准品溶液点渍以滤纸上，于室温下自然晾干。

所述的空白基质是指其中不含胆汁酸的基质，所述的基质包括血清、血浆、胆汁和全血。

空白血清、血浆或胆汁的获取方法为：向血清、血浆或胆汁中加入活性炭，进行吸附后分离出活性炭，重复多次即可；血清、血浆或胆汁与活性炭的体积质量比为1mL∶80～150mg。

空白全血的获取方法为：将全血的血浆和血细胞分离，血浆按上述方法处理，血细胞用生理盐水洗涤多次，再将处理好的空白血浆和血细胞以55∶45的体积比进行混合即可。

本发明涉及的16种胆汁酸个体差异性较大，工作曲线的线性范围可根据实际情况调整，可将16种胆汁酸在人体中的含量情况，将16种胆汁酸分为三组不同的浓度水平配制标准工作溶液。

优选的，将16种胆汁酸标准品分为三组：

第一组包括牛磺熊脱氧胆酸，牛磺胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨熊脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，甘氨胆酸，鹅脱氧胆酸；

第二组包括胆酸，熊脱氧胆酸，猪脱氧胆酸，牛磺石胆酸，脱氧胆酸，石胆酸；

第三组包括甘氨石胆酸；

第一组胆汁酸标准品中各胆汁酸的浓度为10～10000ng/mL；第二组胆汁酸标准品中各胆汁酸的浓度为5～5000ng/mL；第三组胆汁酸标准品中各胆汁酸的浓度为1～1000ng/mL。

如此设置标准品浓度范围，可以使得制作的工作标准曲线更可靠，准确度和灵敏度更高。

优选的，所述的质控品中，16种胆汁酸各自的浓度为25～8000ng/mL。

质控品的制备方法同标准品。

标准品、质控品和内标品可预先包被于孔板孔中。

在生化检查领域，各种试剂的配用需要精心筛选，往往细微地改变试剂用量都可能导致检查的失败或精密度和准确度的降低。

优选的，所述的流动相A中，甲酸铵或乙酸铵浓度为0～20mmol/L，甲酸或乙酸浓度为0.1～1％。

本发明还公开了使用所述的串联质谱检测试剂盒同时测定16种胆汁酸的方法，包括以下步骤：

(1)将标准品和内标品加入到孔板孔中混匀，将待测样品和内标品加入到孔板孔中混匀；

(2)向标准品和待测样品的孔中加入沉淀剂，震荡沉淀后冷冻离心，得上清液I；

(3)取上清液I顺序置入洁净的孔板中，冷冻干燥后，分别加入稀释剂，再冷冻离心，得上清液II；

(4)取上清液II顺序置入洁净的孔板中，每孔加入稀释剂，混匀后进行串联质谱检测，记录16种胆汁酸和相应内标的峰面积用于定量分析。

所述的待测样品可以为血清、血浆、全血、胆汁及相应干基质斑。

优选的，所述沉淀剂的用量为100～500uL。

优选的，步骤(4)中，液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，柱温箱温度为30～60℃；流动相流速为0.3～1mL/min。

进一步优选的，采用梯度洗脱，梯度洗脱参数如表1所示。

表1流动相洗脱梯度

时间(min)	流速(mL/min)	流动相A百分比(％)	流动相B百分比(％)
				0.00	0.8	80	20
0.3	0.8	80	20
				5.3	0.8	70	30
11	0.8	36	64
				11.2	0.8	80	20
12	0.8	80	20

优选的，步骤(4)中，质谱条件为：ESI离子源，负离子模式，离子源温度150℃，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流量150L/h，脱溶剂气流量1000L/h，喷雾器压力7bar，毛细管电压3kV。

进一步优选的，采用MRM模式进行检测，各化合物的LC-MS参数见表2。

表2多反应监测MRM参数

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的串联质谱检测试剂盒具有灵敏度高、特异性好等特点，可准确、简便、快速地同时测定基质中16种胆汁酸，具有广阔的应用价值。

附图说明

图1为16中胆汁酸标准品的质谱检测谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。

一、检测试剂盒的组成如表3所示：

表3试剂盒组成

二、标准品、质控品和内标品的包被方法

1、标准工作溶液配置：首先配置各胆汁酸浓度为100μg/mL的16种胆汁酸混合标准溶液，再采用逐级稀释的方式，分别配置50000、10000、5000、1000、100ng/mL的标准溶液。再分别取上述标准溶液10ul，加入90ul的空白基质，即得到浓度分别为10000、5000、1000、500、100、10ng/mL的标准工作溶液。

2、质控样品配置：首先配置各胆汁酸浓度为80000、9000和250ng/mL的质控品标准溶液，再分别取上述标准溶液10ul，加入90ul的空白基质，即得到浓度分别为8000、900、25ng/mL的质控样品(Q3-Q1)。

3、取10uL内标溶液(各内标品浓度为100ng/mL)加入96孔提取板孔中，经冷冻干燥后预包被于96孔板上；将50uL标准品、质控品分别加入对应孔中，冷冻干燥或冷冻离心，得到预包被的96孔提取板。

4、干基质标准品和质控品的制备

干基质标准品：按照上述方法配置标准工作溶液后，取各标准工作溶液50uL滴加于whatman 903滤纸上，于室温下自然晾干2小时。

干基质质控样品：按照上述方法配置质控样品溶液后，取各质控样品溶液50uL滴加于whatman 903滤纸上，于室温下自然晾干2小时。

5、本发明涉及的16种胆汁酸个体差异性较大，工作曲线的线性范围可根据实际情况调整。可将16种胆汁酸在人体中的含量情况，将16种胆汁酸分为三组不同的浓度水平配制标准工作溶液。

第一组：牛磺熊脱氧胆酸，牛磺胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨熊脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，甘氨胆酸，鹅脱氧胆酸；

第二组：胆酸，熊脱氧胆酸，猪脱氧胆酸，牛磺石胆酸，脱氧胆酸，石胆酸；

第三组：甘氨石胆酸。

第一组线性范围为10～10000ng/mL；第二组线性范围为5～5000ng/mL；第三组线性范围为1～1000ng/mL。

6、空白基质的制备

胆汁酸为内源性物质，需要对获得的基质样本进行处理以得到空白基质；本发明涉及的液体基质包括但不限于血清、血浆、全血、胆汁等。

血清、血浆和胆汁按照表4所述方式进行处理。

表4血清、血浆和胆汁的处理

以空白血清为例，以健康人的血清按150mg/1mL的比例加活性炭，4℃吸附一天，于冷冻离心机上16000rpm离心1小时，取上清液，重复上述步骤三次，可得到空白血清，实验表明，处理后的血清中99％的胆汁酸被活性炭吸附。

全血的处理方法为：将全血分离成血细胞和血浆，血浆按照上述方法处理。将血细胞按1∶1的比例用生理盐水清洗后，再与空白血浆以45∶55的比例混合即可得到空白全血基质。

三、使用试剂盒同时测定16种胆汁酸的方法，包括如下步骤：

(a)将待测液体样本加入到提取板的样品孔中，或将干基质斑打入到提取板的样品孔中，标准品孔，质控品孔和样品孔中各加入200uL沉淀剂，贴膜覆盖后放入震荡器中震荡30min，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；

(b)每孔取出50uL上清液，顺序置入洁净的96孔板中，冷冻干燥或冷冻离心后，加入50uL复溶剂，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；

(c)揭去贴膜，每孔移出20μL上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加入180μL稀释剂，贴膜密封后震荡混匀供质谱检测，记录16种胆汁酸和内标的峰面积用于定量。

高效液相色谱采用C18色谱柱，柱温50℃，采用梯度洗脱，洗脱梯度见表1。

质谱条件为：采用ESI离子源，负离子模式，离子源温度为150℃，脱溶剂气温度为450℃，锥孔气流量为150L/h，脱溶剂气流量为1000L/h，喷雾器压力为7bar，毛细管电压为3kV。

采用MRM模式进行检测，各化合物的LC-MS参数见表2。

四、取同一质控样品50uL，分别加入预包被有10uL内标溶液(10ng/mL和100ng/mL两种)的96孔板对应孔中，加入200uL甲醇沉淀蛋白后，贴膜覆盖后放入震荡器中震荡30min，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；每孔取出50uL上清液，顺序置入洁净的96孔板中，冷冻干燥或冷冻离心后，加入50uL80％甲醇水复溶，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；揭去贴膜，每孔移出20μL上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加入180uL80％甲醇水稀释，贴膜密封后震荡混匀供质谱检测，记录16种胆汁酸和内标的峰面积用于定量。

10ng/mL和100ng/mL两种内标溶液均可获得较好的检测结果，质控样品回收率和准确度均满足美国疾病预防控制中心质控要求。

五、沉淀剂的选择

取同一质控样品50uL，加入预包被有10uL内标溶液(10ng/mL)的96孔板对应孔中，按表5配方加入200uL沉淀剂，贴膜覆盖后放入震荡器中震荡30min，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；每孔取出50uL上清液，顺序置入洁净的96孔板中，冷冻干燥或冷冻离心后，加入50uL80％甲醇水复溶，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；揭去贴膜，每孔移出20μL上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加入180μL80％甲醇水稀释，贴膜密封后震荡混匀供质谱检测，记录16种胆汁酸和内标的峰面积用于定量。

表5不同沉淀剂配方

提取液	甲醇(mL)	乙腈(mL)	乙醇(mL)
				配方1	100	0	0
配方2	0	100	0
				配方3	0	0	100
配方4	50	50	0
				配方5	0	50	50
配方6	50	0	50

使用配方1～6的沉淀剂，质控样品回收率和准确度均满足美国疾病预防控制中心质控要求。

六、复溶剂和稀释剂

取同一质控样品50uL，加入预包被有10uL内标溶液(10ng/mL)的96孔板对应孔中，加入200uL甲醇沉淀剂，贴膜覆盖后放入震荡器中震荡30min，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；每孔取出50uL上清液，顺序置入洁净的96孔板中，冷冻干燥或冷冻离心后，按照表6所示配方加入50uL复溶剂复溶后，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；揭去贴膜，每孔移出20μL上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加入180uL稀释剂稀释，稀释剂中组分及各组分的浓度与复溶剂相同，用于稀释样本贴膜密封后震荡混匀供质谱检测，记录16种胆汁酸和内标的峰面积用于定量。

表6不同复溶剂(稀释剂)配方

提取液	水(mL)	甲醇(mL)	乙腈(mL)	乙醇(mL)
					配方1	10	90	0	0
配方2	20	80	0	0
					配方3	50	0	50	0
配方4	20	40	40	0
					配方5	20	40	0	40
配方6	0	0	50	50

使用配方1～6的复溶剂和稀释剂，质控样品回收率和准确度均满足美国疾病预防控制中心质控要求。

七、流动相的选择

取同一质控样品50uL，加入预包被有10uL内标溶液(10ng/mL)的96孔板对应孔中，加入200uL甲醇沉淀剂，贴膜覆盖后放入震荡器中震荡30min，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；每孔取出50uL上清液，顺序置入洁净的96孔板中，冷冻干燥或冷冻离心后，按照表6所示配方加入50uL复溶剂复溶后，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；揭去贴膜，每孔移出20μL上清液，顺序置入洁净的检测板中，每孔加入180uL稀释剂稀释，稀释剂中组分及各组分的浓度与复溶剂相同，用于稀释样本贴膜密封后震荡混匀供质谱检测，记录16种胆汁酸和内标的峰面积用于定量。流动相如表7所示。

表7不同流动相配方

配方1～7的流动相均可获得理想的检测效果，回收率能够达到美国疾病预防控制中心质控要求。

实施例1

检测试剂盒包括：

沉淀剂为甲醇，稀释剂为体积分数80％的甲醇水溶液，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。

实施例2

沉淀剂为乙腈，稀释剂为体积分数50％的乙腈水溶液，流动相A为5mmol/L乙酸铵-0.1％乙酸水溶液，流动相B为乙腈。

实施例3

沉淀剂为乙醇，稀释剂为体积分数80％的甲醇水溶液，流动相A为20mmol/L乙酸铵-1％甲酸水溶液，流动相B为甲醇。

实施例4

沉淀剂为体积比1∶1的甲醇乙腈混合液，稀释剂为甲醇乙腈水溶液，甲醇、乙腈和水的体积比为40∶40∶20，流动相A为5mmol/L甲酸铵-0.2％甲酸水溶液，流动相B为体积比1∶1的甲醇乙腈混合液。

实施例5

沉淀剂为体积比1∶1的乙醇乙腈混合液，稀释剂为乙醇乙腈水溶液，乙醇、乙腈和水的体积比为40∶40∶20，流动相A为2mmol/L甲酸铵-0.5％乙酸水溶液，流动相B为乙腈。

实施例6

沉淀剂为甲醇，稀释剂为体积分数90％的甲醇水溶液，流动相A为2mmol/L甲酸铵-0.5％乙酸水溶液，流动相B为乙腈。

实施例7

使用实施例1的试剂盒检测血清中16种胆汁酸的方法，包括如下步骤：

(1)将50uL待测血清加入到96孔提取板的样品孔中，标准品孔，质控品孔和样品孔中各加入200uL沉淀剂，贴膜覆盖后放入震荡器中震荡30min，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；

(2)每孔取出50uL上清液，顺序置入洁净的96孔检测板中，冷冻干燥或冷冻离心后，加入50uL稀释剂，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；

(3)揭去贴膜，每孔移出20μL上清液，顺序置入洁净的96孔检测板中，每孔加入180μL稀释剂，贴膜密封后震荡混匀供质谱检测，记录16种胆汁酸和内标的峰面积用于定量。

高效液相色谱采用C18色谱柱，规格为1.7um，2.1×50mm，柱温50℃，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。

质谱条件为为ESI离子源，负离子模式，采用MRM模式进行检测，离子源温度150℃，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流量150L/h，脱溶剂气流量1000L/h，喷雾器压力7bar，毛细管电压3kV。

以标准品A～F中的16种胆汁酸浓度为横坐标，以所得16种胆汁酸与相应内标峰面积比值为纵坐标，以加权(W＝1/X)最小二乘法进行回归运算，求得的线性回归方程，如表8所示。根据标准曲线，16种胆汁酸的线性范围为10～10000ng/mL。

表8 16种胆汁酸的标准曲线

该检测方法的回收率在80％～120％之间，符合检测要求，多次测量的RSD小于5％，符合分析测试要求。

对30个预先收集并使用不记名过量血清样品来组织相关性研究，其中健康血清样品3个、病毒性肝炎5个、酒精肝8个、胆结石9个、非酒精性脂肪肝5个，运用本实施例的方法进行检测，检测结果见表9，本方法所得结果与医院检验科检测结果一致。

表9实际样品检测

实施例8

取50uL质控样品溶液，加入预包被有10uL内标溶液(10ng/mL)的96孔板对应孔中，加入200uL甲醇沉淀剂，贴膜覆盖后放入震荡器中震荡30min，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；每孔取出50uL上清液，顺序置入洁净的96孔板中，冷冻干燥或冷冻离心后，加50uL80％甲醇水复溶，再次离心并取上清液20uL，加入180uL80％甲醇水稀释，放入样品盘进行液相色谱串联质谱分析，记录各种胆汁酸和内标的峰面积用于定量。

与实施例7的不同之处在于，液相色谱所用色谱柱为C18柱，规格为1.7um，2.1×50mm，柱温为30℃，流动相流速为0.3mL/min。其他同实施例7。

该实施例中，质控样品回收率和准确度均满足美国疾病预防控制中心质控要求。

实施例9

取50uL质控样品溶液，加入预包被有10uL内标溶液(10ng/mL)的96孔板对应孔中，加入200uL甲醇沉淀剂，贴膜覆盖后放入震荡器中震荡30min，在冷冻离心机上10000rpm离心10分钟；每孔取出50uL上清液，顺序置入洁净的96孔板中，冷冻干燥或冷冻离心后，加50uL80％甲醇水复溶，再次离心并取上清液20uL，加入180uL80％甲醇水稀释，放入样品盘进行液相色谱串联质谱分析，记录各种胆汁酸和内标的峰面积用于定量。

与实施例7的不同之处在于，液相色谱所用色谱柱为C18柱，规格为1.7um，4.6×100mm，柱温为60℃，流动相流速为1mL/min。其他同实施例7。

该实施例中，质控样品回收率和准确度均满足美国疾病预防控制中心质控要求。

以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时测定16种胆汁酸的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，包括：标准品、质控品、内标品、沉淀剂、稀释剂和流动相；

所述的沉淀剂为甲醇、乙醇和乙腈中的至少一种；

所述的稀释剂由水、甲醇、乙醇和乙腈组成；水、甲醇、乙醇和乙腈的体积比为1～50∶0～90∶0～50∶0～50，其中甲醇、乙醇和乙腈不同时为0；

所述的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸铵或乙酸铵-甲酸或乙酸的水溶液，所述流动相B为甲醇和/或乙腈。

2.根据权利要求1所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，所述标准品的浓度为1～10000ng/mL。

3.根据权利要求1或2所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，标准品的制备方法包括：

(a)配置16种胆汁酸的混合标准溶液，再用空白基质将混合标准溶液分别稀释至所需浓度；

(b)将稀释至所需浓度的标准品溶液经冷冻干燥预包被于孔板孔中；

或，将稀释至所需浓度的标准品溶液点渍以滤纸上，于室温下自然晾干。

4.根据权利要求3所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，所述的空白基质包括空白血清、空白血浆、空白胆汁和空白全血；

空白血清、血浆或胆汁的获取方法为：向血清、血浆或胆汁中加入活性炭，进行吸附后分离出活性炭，重复多次即可；血清、血浆或胆汁与活性炭的体积质量比为1mL∶80～150mg；

空白全血的获取方法为：将全血的血浆和血细胞分离，血细胞用生理盐水洗涤多次，再将空白血浆与处理好的血细胞以55∶45的体积比进行混合即可。

5.根据权利要求2所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，将16种胆汁酸标准品分为三组：

第一组包括牛磺熊脱氧胆酸，牛磺胆酸，牛磺鹅脱氧胆酸，牛磺脱氧胆酸，甘氨鹅脱氧胆酸，甘氨熊脱氧胆酸，甘氨脱氧胆酸，甘氨胆酸，鹅脱氧胆酸；

第二组包括胆酸，熊脱氧胆酸，猪脱氧胆酸，牛磺石胆酸，脱氧胆酸，石胆酸；

第三组包括甘氨石胆酸；

第一组胆汁酸标准品中各胆汁酸的浓度为10～10000ng/mL；第二组胆汁酸标准品中各胆汁酸的浓度为5～5000ng/mL；第三组胆汁酸标准品中各胆汁酸的浓度为1～1000ng/mL。

6.根据权利要求1所述的串联质谱检测试剂盒，其特征在于，所述的流动相A中，甲酸铵或乙酸铵浓度为0～20mmol/L，甲酸或乙酸浓度为0.1～1％。

7.一种使用权利要求1～6任一项所述的串联质谱检测试剂盒同时测定16种胆汁酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将标准品和内标品加入到孔板孔中混匀，将待测样品和内标品加入到孔板孔中混匀；

(2)向标准品和待测样品的孔中加入沉淀剂，震荡沉淀后冷冻离心，得上清液I；

(3)取上清液I顺序置入洁净的孔板中，冷冻干燥后，分别加入稀释剂，再冷冻离心，得上清液II；

(4)取上清液II顺序置入洁净的孔板中，每孔加入稀释剂，混匀后进行串联质谱检测，记录16种胆汁酸和相应内标的峰面积用于定量分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，液相色谱条件为：色谱柱为C18柱，柱温箱温度为30～60℃；流动相流速为0.3～1mL/min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用梯度洗脱，梯度洗脱参数如表1所示。

表1流动相洗脱梯度

时间(min) 流速(mL/min) 流动相A百分比(％) 流动相B百分比(％) 0.00 0.8 80 20 0.3 0.8 80 20 5.3 0.8 70 30 11 0.8 36 64 11.2 0.8 80 20 12 0.8 80 20

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，质谱条件为：ESI离子源，负离子模式，离子源温度150℃，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流量150L/h，脱溶剂气流量1000L/h，喷雾器压力7bar，毛细管电压3kV。