CN115901987A - 一种蛋白沉淀剂、检测心衰及冠心病标志物的试剂盒和方法 - Google Patents
一种蛋白沉淀剂、检测心衰及冠心病标志物的试剂盒和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于化学检测技术领域，公开了一种蛋白沉淀剂、检测心衰及冠心病标志物的试剂盒和方法。所述蛋白沉淀剂包括以下组分：甲醇、乙腈、甲酸铵和水，所述蛋白沉淀剂的pH值为8.4‑8.7。该蛋白沉淀剂可显著提高样本的提取效率并减少机器检测的杂峰和基质效应，因而在色谱检测中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种蛋白沉淀剂、检测心衰及冠心病标志物的试剂盒和方法。
背景技术
唾液酸(Sialic acid，SA)，又叫作“N-乙酰基神经氨酸”，是九碳糖神经氨酸复合物，存在于人体各种组织(主要是在细胞膜内)，是真核细胞膜上糖蛋白、糖脂的重要组成部分，直接或间接参与多个不同的细胞活动。研究表明，唾液酸与动脉粥样硬化等心血管病变的发生和发展也存在密切相关。血浆游离唾液酸能预测冠心病和中风的死亡风险，能反映动脉粥样硬化水平，与冠心病和冠状动脉病变之间呈正相关，可作为心血管危险因素/标记物，也可用于动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。
TMAO(氧化三甲胺)通路是饮食、肠道微生物群、动脉粥样硬化和血栓形成风险之间的一种新的交叉。TMAO循环水平升高被证明可独立预测重大心脏不良事件的风险，包括心肌梗死、中风或经常规心脏危险因素干预后和肾功能衰竭引起的死亡。临床观察研究表明TMAO循环水平与血栓风险密切相关。多项临床研究表明，慢性心衰(HF)中TMAO可能通过部分增加心肌纤维化和伴随心肌舒张功能障碍影响HF易感性和发生风险。
研究还表明，多种氨基酸代谢(Amino acids)均与中老年人心血管疾病的发生密切相关，这些发现拓宽了氨基酸类物质与心血管功能的相关性。例如，苯乙酰谷氨酰胺在驱动心血管疾病中发挥重要作用，在心衰和冠心病人群中有极高的预警作用。
目前国内外有关血中氨基酸和唾液酸的检测方法报道很多，常见的方法有：化学发光法、免疫发光法、气相色谱法、液相色谱法，在众多的方法中，液相色谱法或液相串联质谱法为测定的首选方法，是行业的金标准。但是以往方法存在无法检测大量物质、人员要求高、成本高、干扰因素多、特异性差、分析时间长、灵敏度不高、定性定量准确性差且重现性较差的问题，这主要都是因为样本前处理复杂，人为因素影响过大，稳定性差，灵敏度不高，无法兼容浓度差异大的待测物造成的。
现有的氨基酸样本前处理方法主要使用衍生化方法，需要对人有害的化学试剂，进行长达半小时的孵育，在前处理方法上浪费了大量的时间。而对于唾液酸和胆碱等物质需经稀释、多次萃取、旋转蒸发、氮气吹干、净化等多个步骤，过程繁琐，需大量的人工操作，而且液液提取难以实现高通量和自动化，固液萃取虽然能实现高通量，但其中样品萃取过程主要依靠SLE板来完成，耗材成本高。目前也有一些氨基酸样本前处理方法用的蛋白沉淀法，但是普遍存在回收率偏低，灵敏度低，容易堵塞色谱柱，过程繁琐，人工需求极大，甚至是靠过SPE/SLE的板子进行过滤，极大增加了检测成本。
目前还未有能将氧化三甲胺、唾液酸及多种氨基酸一起检测的方法，这是因为各成分的化学性质差异大，含量不同，前处理和色谱条件难统一。例如，氨基酸在人血浆内含量相对较高甚至高达0.1g/L，反而唾液酸和氧化三甲胺等物质，只有10μg/L，差异巨大，在实际检测过程中难以把握样本量和进样量，在机器检测过程中难以调试成信号低的物质稳定检测，信号高的物质不超过机器检测限。目前已报道的方法均难以实现浓度差异过大的物质稳定的一次性测出结果。
因此，本发明希望提出一种克服上述不足且检测效果良好的心衰及冠心病标志物的检测试剂盒，以满足当今的检测需求。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种蛋白沉淀剂、检测心衰及冠心病标志物的试剂盒和方法。所述蛋白沉淀剂可显著提高样本的提取效率并减少机器检测的杂峰和基质效应，因而在色谱检测中具有广阔的应用前景。
本发明提供了一种蛋白沉淀剂，包括以下组分：甲醇、乙腈、甲酸铵和水，所述蛋白沉淀剂的pH值为8.4-8.7。
优选地，所述蛋白沉淀剂中还包含氨水。氨水的作用在于调节蛋白沉淀剂的pH值。
优选地，所述蛋白沉淀剂中甲酸铵的浓度为1-3mol/L。
优选地，所述蛋白沉淀剂中甲醇、乙腈和水的体积比为(88-92):(3-7):5。
更优选地，所述蛋白沉淀剂中甲醇、乙腈和水的体积比为90：5：5。通过对不同比例的成分进行配比和筛选后，最后证实在上述配比条件下所制得的蛋白沉淀剂无论从提取率还是溶剂效应对结果的影响都显著性的优于其他的配比。
本发明还提供一种检测心衰及冠心病标志物的试剂盒，包括：
上述蛋白沉淀剂；
洗脱液A：甲酸铵水溶液；
洗脱液B：含甲酸铵的甲醇乙腈溶液。
本发明提出在使用上述洗脱液时，能显著提高待测物尤其是唾液酸和氧化三甲胺的定量范围，灵敏度高。
优选地，所述洗脱液A中甲酸铵的浓度为1.5-3mol/L。
优选地，所述洗脱液B中甲醇与乙腈的体积比为(8.5-9.5)：1，甲酸铵的浓度为1.5-3mol/L。
优选地，所述洗脱液A和/或所述洗脱液B中还含有氨水。
更优选地，所述氨水中氨的质量分数为25-40％。
优选地，所述试剂盒还包括内标储存液、质控品溶液、标品混合液、牛血清白蛋白(BSA)中的至少一种。
经测试得出，本发明所提出的蛋白沉淀剂可直接与内标储存液混合成为内标工作液，人员的操作误差小，且内标工作液的稳定性极好，室温下可稳定保存至少一年。此外，所述蛋白沉淀剂对样本中高浓度的物质起到了少许的抑制作用，而对浓度低的物质起到了加强信号的作用，并且显著地降低了基线。
更优选地，所述内标储存液中含有内标，所述内标选自N-乙酰基神经氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、氧化三甲胺(TMAO)、胆碱，甜菜碱中的至少一种的同位素标记物。
更优选地，所述牛血清白蛋白为活性炭吸附的牛血清白蛋白。经筛选后，发现采用活性炭吸附后的牛血清白蛋白用此来配置的标准曲线，既完美模仿了血的基质，又可显著减少了本底浓度的影响。
本发明还提供了一种检测心衰及冠心病标志物的方法，采用上述试剂盒进行液相色谱串联质谱检测。
优选地，所述液相色谱的色谱柱为UPLC ACQUITYTM Amide column。
优选地，所述液相色谱采用梯度洗脱，流动相A为洗脱液A，流动相B为洗脱液B。
更优选地，所述梯度洗脱的条件为：
0-3min，流动相B的体积分数由10％变化至40％，流动相A的体积分数由90％变化至60％；
3-5min，流动相B的体积分数由40％变化至45％，流动相A的体积分数由60％变化至55％；
5-5.01min，流动相B的体积分数由45％变化至10％，流动相A的体积分数由55％变化至90％；
5.01-5.11min，流动相B的体积分数为10％，流动相A的体积分数为90％。
优选地，所述液相色谱的条件还包括：流速为0.4-0.5mL/min；柱温为38-42℃；进样量为2-5μL。
优选地，所述质谱的条件包括：多反应监测扫描模式；喷雾电压：4.0kV；去溶剂温度：500℃；雾化器流速800L/h；离子源温度：150℃；锥孔气流速：65L/hr。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明所提出的蛋白沉淀剂可对样品中蛋白质物质进行沉淀分离，对样品中的待测物溶解性优异，且所制得的内标工作液稳定性好。
(2所述蛋白沉淀剂对于样品中含量过大的物质有抑制作用，避免机器响应太高达到仪器饱和，还可使检测仪器和色谱柱得到良好的保护，大大了延长色谱柱寿命。
(3)所述蛋白沉淀剂所用组分的价格低廉，有助于降低检测成本。
(4)本发明所使用的洗脱液能使得待测物在机器中能保持准确，精准的信号，显著提高了稳定性。
(5)本发明指出采用活性炭吸附的牛血清白蛋白模拟血浆基质，还可显著解除本底浓度对实验的影响，显著提高了标准曲线的可靠度和稳定性。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
本实施例提供一种LC-MS/MS检测心衰及冠心病标志物的试剂盒，包括：
标品混合液：将唾液酸(Sialic acid，SA，N-乙酰基神经氨酸)、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、氧化三甲胺(TMAO)，胆碱、乙酰胆碱、甜菜碱混合，溶剂为甲醇和水(体积比为85:15)，得到不同浓度的标品混合液。其中配置浓度如表1所示：
表1标品混合液浓度配置表(ng/mL)
| S1 | S2 | S3 | S4 | S5 | S6 | |
| N-乙酰基神经氨酸 | 1000 | 2000 | 5000 | 10000 | 20000 | 40000 |
| L-苯丙氨酸 | 1000 | 2000 | 5000 | 10000 | 20000 | 40000 |
| L-谷氨酰胺 | 10000 | 20000 | 50000 | 100000 | 200000 | 400000 |
| L-谷氨酸 | 80000 | 160000 | 400000 | 800000 | 1600000 | 3200000 |
| L-亮氨酸 | 20000 | 40000 | 100000 | 200000 | 400000 | 800000 |
| L-缬氨酸 | 20000 | 40000 | 100000 | 200000 | 400000 | 800000 |
| L-异亮氨酸 | 10000 | 20000 | 50000 | 100000 | 200000 | 400000 |
| 苯乙酰谷氨酰胺 | 10000 | 20000 | 50000 | 100000 | 200000 | 400000 |
| 氧化三甲胺 | 2400 | 4800 | 12000 | 24000 | 48000 | 96000 |
| 胆碱 | 10000 | 20000 | 50000 | 100000 | 200000 | 400000 |
| 甜菜碱 | 800 | 1600 | 4000 | 8000 | 16000 | 32000 |
内标储备液：配置含N-乙酰基神经氨酸-d3、L-苯丙氨酸-d10、L-谷氨酰胺-d3、L-谷氨酸-d3、L-亮氨酸-d3、L-缬氨酸-d8、L-异亮氨酸-d3；苯乙酰谷氨酰胺-d5、氧化三甲胺-d9(TMAO)，胆碱-d9，甜菜碱-d3的混合溶液，溶剂为甲醇和水(体积比为85:15)。其中配置浓度如表2所示。
表2内标储备液
质控品溶液：将唾液酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-异亮氨酸、苯乙酰谷氨酰胺、氧化三甲胺(TMAO)，胆碱、乙酰胆碱、甜菜碱混合，得到不同浓度的质控品溶液，溶剂为甲醇和水(体积比为85:15)。其中配置浓度如表3所示：
表3质控品溶液
| QCL | QCM | QCH | |
| N-乙酰基神经氨酸 | 1500 | 7500 | 15000 |
| L-苯丙氨酸 | 1500 | 7500 | 15000 |
| L-谷氨酰胺 | 15000 | 75000 | 150000 |
| L-谷氨酸 | 120000 | 600000 | 1200000 |
| L-亮氨酸 | 30000 | 150000 | 300000 |
| L-缬氨酸 | 30000 | 150000 | 300000 |
| L-异亮氨酸 | 15000 | 75000 | 150000 |
| 苯乙酰谷氨酰胺 | 15000 | 75000 | 150000 |
| 氧化三甲胺 | 3600 | 18000 | 36000 |
| 胆碱 | 15000 | 75000 | 150000 |
| 甜菜碱 | 1200 | 6000 | 12000 |
蛋白沉淀剂：将180mL甲醇、10mL乙腈、10mL甲酸铵(含400mmol的甲酸铵)水溶液和0.1mL的质谱级氨水(氨水中氨的质量分数为30％)混合，得到pH约为8.5的蛋白沉淀剂(即甲醇、乙腈、水和氨水的体积比为90：5：5：0.05；甲酸铵的浓度约为2mol/L。)。
洗脱液A：甲酸铵水溶液(甲酸铵的浓度为2mol/L)+氨水(氨水中氨的质量分数为30％)；甲酸铵水溶液与氨水的体积比为1：0.05。
洗脱液B：甲酸铵的甲醇乙腈溶液(甲酸铵的浓度为2mol/L，且甲醇与乙腈的体积比为9:1)+氨水(氨水中氨的质量分数为30％)；甲酸铵的甲醇乙腈溶液与氨水的体积比为1：0.05。
实施例2
本实施例提供一种LC-MS/MS检测心衰及冠心病标志物的方法，采用实施例1中试剂盒进行检测，包括以下步骤：
1.内标工作液的制作：在10mL内标储备液加入170mL蛋白沉淀剂混匀，制成内标工作液。
2.待测样品的预处理：将20μL的待测样品(一般为血清样品)中加入180μL的内标工作液，涡旋30s；4℃下离心15min，取120μL上清液，装入96孔板，待LC-MS/MS检测。其中BSAWEI1活性炭吸附的5％BSA(质量分数),购于谱芬生物技术公司。
3.标准曲线绘制：将2μL标品混合液加入到18μL的BSA中，再加入180μL的内标工作液，得到校准品溶液。采用与待测样本进行同样的预处理后进行LC-MS/MS检测。检测时，以经预处理制备得到的校准品溶液中待测物与其对应内标物的浓度比为X轴，待测物与其对应内标物的峰面积比为Y轴，建立标准工作曲线，具体结果如表4所示。
表4标准曲线与回归方程
| 简写 | 相关系数 | 标准曲线 | |
| N-乙酰基神经氨酸 | Neu | r＝0.997010，r^2＝0.994029 | Y＝0.00423906*x+0.16194 |
| L-苯丙氨酸 | Phe | r＝0.999672,r^2＝0.999344 | Y＝0.000398602*x+0.00461459 |
| L-谷氨酰胺 | Gln | r＝0.999297,r^2＝0.998595 | Y＝0.000280307*x-0.00704347 |
| L-谷氨酸 | Glu | r＝0.997962,r^2＝0.995927 | Y＝7.04828e-005*x+0.0126148 |
| L-亮氨酸 | Leu | r＝0.996952,r^2＝0.993913 | Y＝0.00138756*x+0.0525563 |
| L-缬氨酸 | Val | r＝0.994853,r^2＝0.989732 | Y＝0.000383712*x+1.72951 |
| L-异亮氨酸 | Ile | r＝0.998559,r^2＝0.997121 | Y＝0.0018759*x-0.018654 |
| 苯乙酰谷氨酰胺 | PAGln | r＝0.991829,r^2＝0.983725 | Y＝0.0265989*x-0.0049653 |
| 氧化三甲胺 | TMAO | r＝0.999437,r^2＝0.998874 | Y＝0.000476029*x-0.00184733 |
| 胆碱 | Choline | r＝0.998439,r^2＝0.996880 | Y＝0.00732361*x+4.21704 |
| 甜菜碱 | Bet | r＝0.999061,r^2＝0.998123 | Y＝0.00021219*x+0.16057 |
根据标准工作曲线以及待测样本的LC-MS/MS检测结果，计算得到待测样品中待测物的浓度。
LC-MS/MS检测的条件为：
超高效液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)仪器为Waters UPLC Xevo TQ-S MicroIVD。
液相条件：色谱柱为UPLC ACQUITYTM Amide column(2.1×100mm,1.7μm,waters)。流速为0.5mL/min；柱温40℃；进样体积2μL。
采用梯度洗脱，流动相A为洗脱液A，流动相B为洗脱液B。
0-3min，流动相B的体积分数由10％变化至40％，流动相A的体积分数由90％变化至60％；
3-5min，流动相B的体积分数由40％变化至45％，流动相A的体积分数由60％变化至55％；
5-5.01min，流动相B的体积分数由45％变化至10％，流动相A的体积分数由55％变化至90％；
5.01-5.11min，流动相B的体积分数为10％，流动相A的体积分数为90％。
质谱条件为：N-乙酰基神经氨酸ESI源负离子模式下，采用多反应监测扫描模式(MRM)；喷雾电压：4.0kV；去溶剂温度：500℃；雾化器流速800L/h；离子源温度：150℃；锥孔气流速：65L/hr。其余目标物质采用正离子模式，其余条件与设置同上；母离子Q1、子离子Q3、去簇电压CV和碰撞能电压CE等参数参见下表4。
表4质谱检测参数
| Q1 | Q3 | CV | CE | |
| N-乙酰基神经氨酸 | 308.1 | 87.1 | 20 | 10 |
| L-苯丙氨酸 | 166.1 | 120.1 | 20 | 15 |
| L-谷氨酰胺 | 147 | 84 | 20 | 10 |
| L-谷氨酸 | 148 | 84 | 20 | 15 |
| L-亮氨酸 | 132.1 | 43.1 | 15 | 20 |
| L-缬氨酸 | 118 | 72 | 20 | 14 |
| L-异亮氨酸 | 132.1 | 69.1 | 25 | 18 |
| 苯乙酰谷氨酰胺 | 265.2 | 130 | 20 | 10 |
| 氧化三甲胺 | 76.1 | 59 | 20 | 10 |
| 胆碱 | 104.1 | 60.1 | 20 | 15 |
| 甜菜碱 | 118.1 | 58.1 | 20 | 16 |
| N-乙酰基神经氨酸-d3 | 311.1 | 90.1 | 20 | 10 |
| L-苯丙氨酸-d10 | 176 | 128.9 | 20 | 15 |
| L-谷氨酰胺-d3 | 149 | 130.9 | 20 | 10 |
| L-谷氨酸-d3 | 153 | 88 | 20 | 15 |
| L-亮氨酸-d3 | 135.1 | 46.1 | 15 | 20 |
| L-缬氨酸-d8 | 126 | 80 | 20 | 14 |
| L-异亮氨酸-d3 | 135.1 | 72.1 | 25 | 18 |
| 苯乙酰谷氨酰胺-d5 | 270 | 251.9 | 20 | 10 |
| 氧化三甲胺-d9 | 85.1 | 68.1 | 20 | 10 |
| 胆碱-d9 | 113.1 | 69.1 | 20 | 15 |
| 甜菜碱-d3 | 121.1 | 62.1 | 20 | 16 |
实施例3
准确度精密度测试
依据ICH M10“生物样品分析方法验证”指导原则和美国FDA“生物分析方法验证指南”对质控品的要求，以空白血浆为基质，加入已知浓度的标准品，更能反映实际临床样本的检测情况。
本实施例采用实施例2中的检测方法，对实施例1中已配置好的已知浓度的质控品溶液(QCL、QCM、QCH)进行检测，每组样6个平行，连续处理三天，带入回归方程计算浓度后再计算出各批次质控品的精密度和准确度，根据国家检测标准准确度在85％-115％之间，精密度≤15％。本方法三个批次，三天的准确度在95.8％-103.5％，精密度在1.15％-5.45％之间，其结果均显著高于临床检测要求。
实施例3
本实施例通过调整蛋白沉淀剂的组成，以比较不同蛋白沉淀剂所起到的检测效果好坏。以实施例1中的最低标曲1(S1)做样本，采用实施例2的检测方法进行检测，各待测物所测得的峰面积如下表5所示。其中，氨水中氨的质量分数为30％。
表5峰面积测试结果
由表5可以看出，采用实施例1中蛋白沉淀剂对于乙酰神经氨酸的峰面积和响应有显著的正向作用，除此之外还可以效果优良地分离同分异构体L-亮氨酸和L-异亮氨酸，而乙酸铵无法达到所需要的效果。
此外，纯有机试剂溶液对N-乙酰神经氨酸的提取率很低，而加入甲酸铵后工作液盐浓度提升，对提取效率有明显影响，并且在20mmol的时候效果最好。进一步的我们尝试了调节不同ph值，加入了甲酸和氨水，明显可以看出，在加入氨水后响应进一步的提升，在弱碱性环境下，N-乙酰神经氨酸能更好的被提取。
考虑到同样浓度甲酸铵溶液和乙酸铵溶液的酸碱度不同，同等浓度的乙酸铵的pH比甲酸铵高，经过计算后，尝试氨水浓度到0.03％，此时沉淀剂1和4的PH值基本相同，但是可以明显看出，沉淀剂1的效果显著好一些。在同样浓度和酸碱度的情况下，甲酸铵的效果也比乙酸铵更好。
由于甲酸铵中含有氨，并且氨水对质谱的响应无影响和明显抑制，质谱中走样需要挥发性强的物质，在普遍的pH调节剂中氨水是质谱的首选。经过对比，同样pH值的情况下，乙酸铵的提取率同样低于甲酸铵。在质谱检测中基质和流动相采用相同的配置，对仪器的信号和基线好。
进一步地我们做了工作液的稳定性，将配好的不同工作液放置在36℃恒温箱中，在第0天、7天、一个月、3个月和6个月时分别进行检测。通过观察液体是否浑浊有异物，再与现场配置的工作液进行对比，考察工作液的提取率和内标响应是否稳定。工作液的提取率结果7天/一个月/3个月/6个月分别是：2.3％-4.5％，3.2％-5.5％，4.8％-6.3％；内标响应7天/一个月/3个月/6个月分别是1.2％-5.2，3.8％-7.6％，3.2％-5.5％。均在规定范围之内，可长期保存。
实施例4
前期试验中发现，已报道的检测氨基酸和乙酰神经氨酸的方法，当实验样品做到50例之后，N-乙酰神经氨酸会出现未知的杂峰，且亮氨酸和异亮氨酸无法分离。本实施例针对内标工作液中蛋白沉淀剂的溶剂组成进行了研究。以实施例1中的最低标曲1(S1)做样本，采用实施例2的检测方法进行检测，测试结果如表6所示。其中，氨水中氨的质量分数为30％。
表6部分待测物的分离情况
由表6可知，单纯使用甲醇的提取效率没有甲醇乙腈混合溶液好，且使用高甲醇比例的比高乙腈比例的效果好。实验还发现使用没有加入水的蛋白沉淀剂均会出现杂峰，研究人员判断是盐含量高，在有机溶剂和血浆下可能过饱和析出，影响实验结果甚至和柱子堵塞在一起。另外本实验所用的柱子对于甲醇基本没保留，高甲醇处理的样本进样后可以拉开有保留物质的时间，使得同分异构体能够完美分开。综上所述，甲醇、乙腈、水和氨水的体积比为90：5：5：0.05，且甲酸铵的浓度为2mol/L的蛋白沉淀剂能够满足了临床样本大批量高通量的需求。
进一步地研究人员做了8千人的大样本测试，机器运行流畅，柱子柱压正常，出峰稳定，历时8个月，均使用一开始配置的内标工作液。色谱柱厂家标注和行业普遍认为的色谱柱本只能走2000-3000例样本，在本发明的方法下却能检测8000-10000例样本，大大了延长色谱柱寿命，降低了检测成本。6个月实验QC稳定性优良，所有质控的RSD均在-7.6％到9.6％之间。
实施例5
由于氨基酸在自然界中广泛存在，难以消除，分别选用牛血清白蛋白，人血清白蛋白，甲醇乙腈水溶液(体积比为90:5:5)，活性炭吸附的牛血清白蛋白作为基质。基质指的是样品中除待测物以外的组分，会对待测物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰统称为基质效应。对比内标和样本内标响应差距，对比内标均一化。表7为采用不同基质所产生的测试结果。
表7变异系数测试结果
由表7可知，普通的BSA和人血清白蛋白对亮氨酸，苯丙氨酸异亮氨酸的CV值(变异系数)超过了规定的15％。由于氨基酸和胆碱在生物体内广泛存在，本底浓度高的基质对实验要求影响很大，特别是低浓度时无法做到较好的定量。而溶剂和血样样本的基质不一样，血浆成分复杂，很多物质相互影响，纯溶剂也不适用，而选择活性炭吸附的BSA，具有成本低且效果好的特点。
进一步的本发明使用活性炭吸附的BSA做了低、中、高三个浓度的滴定内标归一化的基质因子在93％-108％之间，CV值在2％-8％之间，均符合要求，并远超标准。
上面对本申请实施例作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种蛋白沉淀剂，其特征在于，包括以下组分：甲醇、乙腈、甲酸铵和水，所述蛋白沉淀剂的pH值为8.4-8.7。
2.根据权利要求1所述的蛋白沉淀剂，其特征在于，所述蛋白沉淀剂中甲酸铵的浓度为1-3mol/L；所述蛋白沉淀剂中甲醇、乙腈和水的体积比为(88-92):(3-7):5；优选地，所述蛋白沉淀剂中甲醇、乙腈和水的体积比为90：5：5。
3.一种检测心衰及冠心病标志物的试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1或2所述的蛋白沉淀剂；
洗脱液A：甲酸铵水溶液；
洗脱液B：含甲酸铵的甲醇乙腈溶液。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液A中甲酸铵的浓度为1.5-3mol/L。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液B中甲醇与乙腈的体积比为(8.5-9.5):1，甲酸铵的浓度为1.5-3mol/L。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液A和/或所述洗脱液B中还含有氨水；优选地，所述氨水中氨的质量分数为25-40％。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标储存液、质控品溶液、标品混合液、牛血清白蛋白中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述牛血清白蛋白为活性炭吸附的牛血清白蛋白。
9.一种检测心衰及冠心病标志物的方法，其特征在于，采用权利要求3-8中任一项所述的试剂盒进行液相色谱串联质谱检测。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述液相色谱采用梯度洗脱，流动相A为洗脱液A，流动相B为洗脱液B；
优选地，所述梯度洗脱的条件为：
0-3min，流动相B的体积分数由10％变化至40％，流动相A的体积分数由90％变化至60％；3-5min，流动相B的体积分数由40％变化至45％，流动相A的体积分数由60％变化至55％；5-5.01min，流动相B的体积分数由45％变化至10％，流动相A的体积分数由55％变化至90％；5.01-5.11min，流动相B的体积分数为10％，流动相A的体积分数为90％。
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