KR20210117268A - Lc-ms 기초된 hba1c 계측을 위한 고속 표본 작업 흐름 - Google Patents

Lc-ms 기초된 hba1c 계측을 위한 고속 표본 작업 흐름 Download PDF

Info

Publication number
KR20210117268A
KR20210117268A KR1020217022033A KR20217022033A KR20210117268A KR 20210117268 A KR20210117268 A KR 20210117268A KR 1020217022033 A KR1020217022033 A KR 1020217022033A KR 20217022033 A KR20217022033 A KR 20217022033A KR 20210117268 A KR20210117268 A KR 20210117268A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sample
hemoglobin
hba1c
terminal fragment
proteolytic digestion
Prior art date
Application number
KR1020217022033A
Other languages
English (en)
Inventor
우베 코볼트
안드레아스 라이넨바흐
인드라닐 미트라
Original Assignee
에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에프. 호프만-라 로슈 아게 filed Critical 에프. 호프만-라 로슈 아게
Publication of KR20210117268A publication Critical patent/KR20210117268A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본원 발명은 질량 분광분석 (MS)에 의해 당화 헤모글로빈 A (HbA1c) 분자의 펩티드 단편을 결정하기 위한 방법, 시약 키트, 그리고 상기 방법을 수행하는 데 적합된 임상적 진단 시스템에 관계한다.

Description

LC-MS 기초된 HBA1C 계측을 위한 고속 표본 작업 흐름
설명
본원 발명은 질량 분광분석 (MS)에 의해 당화 헤모글로빈 A (HbA1c) 분자의 펩티드 단편을 결정하기 위한 방법, 시약 키트, 그리고 상기 방법을 수행하도록 적합된 임상적 진단 시스템에 관계한다.
발명의 배경
순환 혈액 글루코오스 수준의 손상된 제어는 당뇨병의 지표이다. 혈당은 비효소적 통계학적 과정에서 폴리펩티드의 리신 잔기에 부착하여, 당화된 폴리펩티드를 야기할 수 있다. 헤모글로빈 A (HbA)의 경우에, 반응이 글루코오스 및 β-사슬의 N 말단 사이에서 일어난다. 결과의 당화 헤모글로빈 A β-사슬은 HbA1c로서 지칭되었다.
HbA1c는 인간 혈액에서 주요 당화 헤모글로빈 종류이다. 포괄적인 당뇨병 제어 및 합병증 시험 (DCCT)은 합병증 예컨대 망막병증, 신병증 및 신경병증이 인슐린 의존성 당뇨병 (IDDM)을 앓는 환자에서 과혈당증의 정도에 직접적으로 관련된다는 증거를 제공하였고, 그리고 혈액 내에 HbA1c의 계측이 당뇨병 환자의 혈당 상태의 장기간 모니터링을 위한 탁월한 도구라는 것을 보여주었다 (Nathan et al., N. Engl. J. Med 329 (1993) 977-986; Santiago, J.V., Diabetes 42 (1993) 1549-1554; Benjamin, J. and Sacks, D.B., Clin. Chem. 40 (1994) 683-687; 및 Goldstein D. et al., Clin. Chem 40 (1994) 1637-1640). DCCT 연구는 또한, HbA1c 및 HbA0 - 비-당화 헤모글로빈, 각각의 신뢰성 있고 재현가능한 계측에 대한 필요성을 명백하게 증명하였다.
당화 헤모글로빈을 결정하기 위한 다수의 상이한 방법, 다시 말하면 크로마토그래피 및/또는 질량 분광분석 (MS)을 비롯한 물리화학적 방법, 화학적 방법 및 면역학적 방법이 있다. 국제 임상 화학 및 검사 의학 연맹 (IFCC)에 의해 승인된, 인간 혈액 내에 HbA1c의 계측을 위한 참조 방법은 18-20 시간의 기간 동안 효소 엔도프로테이나아제 Glu-C에 의한 헤모글로빈의 펩티드로의 효소적 개열, 그리고 차후에, HPLC 및 전기분무 이온화 질량 분광분석에 의해 또는 UV-검출을 동반한 HPLC 및 모세관 전기이동을 이용한 2차원 접근법에서 β- 사슬의 당화된 및 비-당화된 N 말단 헥사펩티드의 분리 및 정량을 포함한다 (Jeppsson et al., Clin. Chem. Lab. Med. 40 (2002), 78-89).
이러한 참조 방법의 변형은 Kaiser et al. (Clin. Chem. 54 (2008), 1018-1022; Li et al., J. Chromatogr. B. 776 (2002), 149-160; Jeong (Mass Spectrom. Lett. 5 (2014), 52-56; 및 Zhang et al., Clin. Chem. Lab Med. 54 (2016), 569-576)에 의해 설명되었는데, 이들 모두 적어도 18 시간의 기간 동안 단백질분해성 소화에 관계한다.
따라서, 헤모글로빈 A의 효소적 소화를 수반하는 공지된 방법은 통상적으로, 충분한 양의 개열 산물, 그리고 따라서 안정된 계측 신호를 획득하기 위해 하룻밤 배양을 필요로 한다. 게다가, 표본에 MS 검출을 실행하기 전, 전통적인 크로마토그래피를 이용한, 매트릭스 구성요소를 포함하는 복합 펩티드 혼합물의 분리가 필요하다. 이들 방법은 따라서, 시간 소모적이고 환자 표본의 고처리량 계측에서 이용이 제한된다.
따라서, MS에 의해 HbA1c를 결정하기 위한 신속하고 신뢰성 있는 방법을 제공하는 것이 요구된다.
발명의 요약
본원 발명의 첫 번째 양상은 다음 단계를 포함하는, 표본 내에서 당화 헤모글로빈 A (HbA1c)을 결정하기 위한 방법에 관계한다:
(a) 헤모글로빈 A (HbA) 분자를 포함하는 표본을 제공하는 단계,
(b) (a) 단계로부터 획득된 표본에 부분적인 단백질분해성 소화 단계를 실행하여, 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 산출하는 단계,
(c) (b) 단계에서 산출된 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 임의적으로 농축하는 단계, 그리고
(d) 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 포함하는 표본에 질량 분광분석 (MS)에 의한 분석을 실행하여, 표본 내에 HbA1c의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
본원 발명의 두 번째 양상은 다음을 포함하는 키트에 관계한다:
(i) HbA β-사슬 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 위한 효소, 그리고 임의적으로 상기 효소에 대한 소화 완충액,
(ii) (i)의 효소를 이용한 단백질분해성 소화를 중지시킬 수 있는 중지 매질, 그리고
(iii) 임의적으로, 단백질분해성으로 소화된 HbA1c 분자를 농축하기 위한 농축 수단, 그리고
(iv) 임의적으로, (iii)의 농축 수단으로부터 표본 구성요소를 용리하는 데 이용을 위한 유기 수혼화성 용매를 포함하는 용리 매질.
키트는 전술된 바와 같은 방법에서 이용에 특히 적합하다.
본원 발명의 세 번째 양상에서 전술된 바와 같은 방법을 수행하도록 적합되는 진단 시스템이 제공된다. 상기 진단 시스템은 특히, 전술된 바와 같은 키트와 함께 이용을 위한 것이다.
본원 발명은 표본 내에서 단백질분해성으로 소화된 당화된 HbA1c 분자, 그리고 임의적으로 단백질분해성으로 소화된 비-당화된 HbA0 분자의 MS에 의한 신속하고 신뢰성 있는 결정을 가능하게 한다.
도 1은 Glu-C를 이용한 전혈 표본의 소화에 의해 획득된 HbA1c 및 HbA0 펩티드로부터 MS/MS 피크를 도시한다.
도 2는 추가 정제 없이 (위쪽), 그리고 각각, 자성 비드 상에서 농축에 의한 표본 정제, 그 이후에 세척 및 상이한 농도의 ACN, 다시 말하면 5% (v/v) ACN, 10%(v/v) ACN, 15% (v/v) ACN, 20% (v/v) ACN 및 30% (v/v) ACN을 이용한 용리와 함께, Glu-C를 이용한 전혈 표본의 소화로부터 결과를 도시한다.
상세한 설명
정의
단어 "포함한다", 그리고 변이, 예컨대 "포함한다" 및 "포함하는"은 언급된 완전체 또는 단계, 또는 완전체 또는 단계의 군의 포함, 그러나 임의의 다른 완전체 또는 단계, 또는 완전체 또는 단계의 군의 배제하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 이용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥에서 별도로 지시되지 않으면, 복수에서 개별 용어를 또한 포함한다.
백분율, 농도, 양, 그리고 다른 수치 데이터는 본원에서 "범위" 형식으로 표현되거나 또는 제시될 수 있다. 이런 범위 형식은 단지 편의 및 간결성을 위해 이용되고, 그리고 따라서, 범위의 한계로서 명시적으로 언급된 수치 값을 포함할 뿐만 아니라, 마치 각 수치 값 및 부분범위가 명시적으로 언급되는 것처럼 상기 범위 내에 포괄된 모든 개별 수치 값 또는 부분범위를 포함하는 것으로 유연하게 해석되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 예시로서, "4% 내지 20 %"의 수치 범위는 4 % 내지 20 %의 명시적으로 언급된 값을 포함할 뿐만 아니라, 지정된 범위 내에 개별 값 및 부분범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이러한 수치 범위 내에는 개별 값 예컨대 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, … 18, 19, 20 %, 그리고 부분범위 예컨대 4-10 %, 5-15 %, 10-20% 등이 포함된다. 이러한 동일한 원리는 최소 또는 최대 값을 열거하는 범위에도 적용된다. 게다가, 이런 해석은 범위의 너비 또는 설명되는 특징과 상관없이 적용되어야 한다.
수치 값과 관련하여 이용될 때 용어 "약"은 지시된 수치 값보다 5% 작은 하한선을 갖고, 그리고 지시된 수치 값보다 5% 큰 상한선을 갖는 범위 안에 수치 값을 포괄하는 것으로 의미된다.
용어 "질량 분광분석" ("Mass Spec" 또는 "MS")은 화합물을 그들의 질량에 의해 확인하는 데 이용되는 분석 기술에 관계한다. MS는 이온을 그들의 질량 대 전하 비율, 또는 "m/z"에 기초하여 여과하고, 검출하고, 계측하는 방법이다. MS 기술은 일반적으로, (1) 화합물을 이온화하여 하전된 화합물을 형성하고; 그리고 (2) 하전된 화합물의 분자량을 검출하고 질량 대 전하 비율을 계산하는 것을 포함한다. 화합물은 임의의 적절한 수단에 의해 이온화되고 검출될 수 있다. "질량분광계"는 일반적으로, 이온화 장치 및 이온 검출기를 포함한다. 일반적으로, 하나 또는 그 이상의 관심 분자가 이온화되고, 그리고 이온이 차후에, 질량 분광사진 기기 내로 도입되는데, 여기서 자기장 및 전기장의 조합으로 인해, 이들 이온은 질량 ("m") 및 전하 ("z")에 의존하는 공간 내 경로를 따라간다. 용어 "이온화" 또는 "이온화하는"은 하나 또는 그 이상의 전자 단위와 동등한 순 전기 전하를 갖는 피분석물 이온을 산출하는 과정을 지칭한다. 음이온은 하나 또는 그 이상의 전자 단위의 순 음성 전하를 갖는 것들이고, 반면 양이온은 하나 또는 그 이상의 전자 단위의 순 양성 전하를 갖는 것들이다. MS 방법은 음이온이 산출되고 검출되는 "음이온 방식", 또는 양이온이 산출되고 검출되는 "양이온 방식" 중 어느 한 가지로 수행될 수 있다.
"탠덤 질량 분광분석" 또는 "MS/MS"는 질량 분광분석 선별 및 검출의 복수의 단계를 수반하는데, 여기서 피분석물의 단편화가 이들 단계 중간에 일어난다. 탠덤 질량분광계에서, 이온이 이온 공급원에서 형성되고, 그리고 질량 분광분석의 일차 시기 (MS1)에서 질량 대 전하 비율에 의해 분리된다. 특정 질량 대 전하 비율의 이온 (선구 이온 또는 부모 이온)이 선별되고, 그리고 단편 이온 (또는 딸 이온)이 충돌-유도된 해리, 이온-분자 반응 및/또는 광해리에 의해 창출된다. 결과의 이온은 이후, 분리되고 질량 분광분석의 이차 시기 (MS2)에서 검출된다.
MS에서 대부분의 표본 작업 흐름은 표본 준비 및/또는 농축 단계를 더욱 포함하는데, 여기서 예를 들면 관심되는 피분석물(들)은 예를 들면 가스 또는 액체 크로마토그래피를 이용하여, 매트릭스, 예를 들면 피분석물과 상이한 표본 성분으로부터 분리된다. 전형적으로, 질량 분광분석 계측을 위해, 다음의 3가지 단계가 수행된다:
(1.) 관심되는 피분석물을 포함하는 표본이 통상적으로 양이온과의 부가물 형성에 의해, 종종 양이온으로의 양자화에 의해 이온화된다. 이온화 공급원은 전기분무 이온화 (ESI) 및 대기압 화학적 이온화 (APCI)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
(2.) 이온이 그들의 질량 및 전하에 따라서 분류되고 분리된다. 고장 비대칭 파형 이온 이동성 분광분석 (FAIMS)이 이온 필터로서 이용될 수 있다.
(3.) 분리된 이온이 이후, 예를 들면 복수의 반응 방식 (MRM)에서 검출되고, 그리고 결과가 차트 상에 나타내진다.
용어 "전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 용액이 짧은 길이의 모세관 튜브를 따라서 통과되고, 상기 튜브의 단부에 높은 양성 또는 음성 전위가 가해지는 방법을 지칭한다. 튜브의 단부에 도달하는 용액은 용매 증기 내에서 용액의 매우 작은 비말의 제트 또는 스프레이로 기화 (분무)된다. 비말의 이러한 미스트는 증발 챔버를 관류하고, 상기 챔버는 응축을 예방하고 용매를 증발시키기 위해 약간 가열된다. 비말이 더욱 작아질수록, 유사한 전하 사이에 자연적 척력이 이온뿐만 아니라 중성 분자가 방출되도록 유발하는 그런 시간 때까지 전기 표면 전하 밀도가 증가한다.
용어 "대기압 화학적 이온화" 또는 "APCI"는 ESI와 유사한 질량 분광분석 방법을 지칭한다; 하지만, APCI는 대기압에서 플라즈마 내에서 일어나는 이온-분자 반응에 의해 이온을 생산한다. 플라즈마는 스프레이 모세관 및 상대 전극 사이에 방전에 의해 유지된다. 이온은 전형적으로, 한 세트의 차별적으로 펌핑된 부유물 제거장치 스테이지의 이용에 의해 질량 분석기 내로 추출된다. 건조하고 예열된 N2 가스의 역류가 용매의 제거를 향상시키는 데 이용될 수 있다. APCI에서 가스상 이온화는 더욱 적은 극성의 실체를 분석하는 데 있어서 ESI보다 효과적일 수 있다.
"복수의 반응 방식" 또는 "MRM"은 선구 이온 및 하나 또는 그 이상의 단편 이온이 선택적으로 검출되는 MS 기기에 대한 검출 방식이다.
질량분광계가 약간 상이한 질량의 이온을 분리하고 검출하기 때문에, 이것은 소정의 원소의 상이한 동위원소를 쉽게 식별한다. 질량 분광분석은 따라서, 저분자량 피분석물, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 피분석물의 정확한 질량 결정 및 특징화를 위한 중요한 방법이다. 이의 적용은 단백질 및 이들의 번역후 변형의 확인, 단백질 복합체, 이들의 아단위 및 기능적 상호작용의 석명뿐만 아니라 단백질체학에서 단백질의 전역 계측을 포함한다. 질량 분광분석에 의한 펩티드 또는 단백질의 데노보 염기서열분석은 전형적으로, 아미노산 서열에 관한 사전 지식 없이 수행될 수 있다.
질량 분광 결정은 크로마토그래피 방법 예컨대 가스 크로마토그래피 (GC), 액체 크로마토그래피 (LC), 특히 HPLC 및/또는 이온 이동성-기초된 분리 기술을 비롯한 추가 분석법과 조합될 수 있다.
본원 발명의 맥락에서, 용어 "피분석물", "피분석물 분자", 또는 "관심되는 피분석물(들)"은 질량 분광분석을 통해 분석되는 화학종을 지칭하기 위해 교체가능하게 이용된다. 질량 분광분석을 통해 분석되는 데 적합한 화학종, 다시 말하면 피분석물은 핵산 (예를 들면 DNA, mRNA, miRNA, rRNA 등), 아미노산, 펩티드, 단백질 (예를 들면 세포 표면 수용체, 세포질 단백질 등), 대사산물 또는 호르몬 (예를 들면 테스토스테론, 에스트로겐, 에스트라디올 등), 지방산, 지질, 탄수화물, 스테로이드, 케토스테로이드, 세코스테로이드 (예를 들면 비타민 D), 다른 분자의 일정한 변형에 특유한 분자 (예를 들면 단백질 상에서 당 모이어티 또는 포스포릴 잔기, 유전체 DNA 상에서 메틸-잔기), 또는 생물체에 의해 내재화된 물질 (예를 들면 치료 약물, 남용 약물, 독소 등) 또는 이런 물질의 대사산물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 살아있는 생물체 내에 존재하는 임의의 종류의 분자일 수 있다. 이런 피분석물은 바이오마커로서 역할을 할 수 있다. 본원 발명의 맥락에서, 용어 "바이오마커"는 생물학적 시스템의 생물학적 상태의 지표로서 이용되는, 상기 시스템 내에 물질을 지칭한다.
피분석물은 관심되는 표본, 예를 들면 생물학적 또는 임상적 표본 내에 존재할 수 있다. 용어 "표본" 또는 "관심되는 표본"은 전체 조직, 장기 또는 개체를 대표하도록 의도되는, 전형적으로 이런 조직, 장기 또는 개체보다 작은 조직, 장기 또는 개체의 부분 또는 조각을 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. 분석 시에 표본은 장기 또는 개체의 조직 상태, 또는 건강 또는 병든 상태에 관한 정보를 제공한다. 표본의 실례는 유체 표본 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 윤활액, 척수액, 소변, 타액 및 림프액, 또는 고체 표본 예컨대 건조된 혈반 및 조직 추출물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 표본의 추가 실례는 세포 배양액 또는 조직 배양액이다.
본원 발명의 맥락에서, 표본은 "개체" 또는 "피험자"로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 개체는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐 및 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
질량 분광분석을 통해 분석되기 전, 표본은 표본- 및/또는 피분석물 특이적 방식으로 전처리될 수 있다. 본원 발명의 맥락에서, 용어 "전처리"는 질량 분광분석을 통한 원하는 피분석물의 차후 분석을 가능하게 하는 데 필요한 임의의 조치를 지칭한다. 전처리 조치는 전형적으로, 고체 표본의 용리 (예를 들면 건조된 혈반의 용리), 전혈 표본에 용혈 시약 (HR)의 첨가, 그리고 소변 표본에 효소 시약의 첨가를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 내부 표준 (ISTD)의 첨가 또한 표본의 전처리로서 고려된다.
용어 "용혈 시약" (HR)은 표본 내에 존재하는 세포를 용해시키는 시약을 지칭한다. 본원 발명의 맥락에서 용혈 시약은 특히, 전혈 표본 내에 존재하는 적혈구를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 혈액 표본 내에 존재하는 세포를 용해시키는 시약을 지칭한다. 널리 알려진 용혈 시약은 물 (H2O), 예를 들면 탈이온수 또는 증류수이다. 용혈 시약의 추가 실례는 높은 오스몰농도를 갖는 액체 (예를 들면 8M 요소), 이온성 액체, 그리고 상이한 세정제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
전형적으로, 내부 표준 (ISTD)은 질량 분광 검출 작업 흐름 (다시 말하면, 임의의 전처리, 농축 및 실제 검출 단계를 포함)이 실행될 때, 관심되는 피분석물과 유사한 특성을 나타내는 공지된 양의 물질이다. 비록 ISTD가 관심되는 피분석물과 유사한 특성을 나타내긴 하지만, 이것은 여전히, 관심되는 피분석물로부터 명백하게 식별가능하다. 예를 들면, 크로마토그래피 분리, 예컨대 가스 또는 액체 크로마토그래피 동안, ISTD는 표본으로부터 획득된 관심되는 피분석물과 거의 동일한 체류 시간을 갖는다. 따라서, 피분석물 및 ISTD 둘 모두 질량분광계에 동시에 들어간다. ISTD는 하지만, 표본으로부터 획득된 관심되는 피분석물과 상이한 분자 질량을 나타낸다. 이것은 ISTD로부터 이온 및 피분석물로부터 이온 사이에, 그들의 상이한 질량/전하 (m/z) 비율에 의한 질량 분광 차이를 가능하게 한다. 둘 모두 단편화가 실행되고 딸 이온을 제공한다. 이들 딸 이온은 그들의 m/z 비율에 의하여, 서로로부터 및 개별 부모 이온으로부터 식별될 수 있다. 결과적으로, ISTD 및 피분석물로부터 신호의 별개의 결정과 정량이 수행될 수 있다. ISTD가 공지된 양으로 첨가되었기 때문에, 표본으로부터 획득된 피분석물의 신호 강도는 피분석물의 특정한 정량적 양에 기인할 수 있다. 따라서, ISTD의 첨가는 검출되는 피분석물의 양의 상대적 비교를 허용하고, 그리고 피분석물(들)이 질량분광계에 도달할 때 표본 내에 존재하는 관심되는 피분석물(들)의 분명한 확인과 정량을 가능하게 한다. 전형적으로, 그러나 반드시 그러한 것은 아니지만, ISTD는 관심되는 피분석물의 동위원소적으로 표지화된 변이체 (예를 들면 적어도 하나의 2H, 13C 및/또는 15N 등의 표지 포함)이다.
전처리에 더하여, 표본은 또한, 하나 또는 그 이상의 농축 단계가 실행될 수 있는데, 여기서 표본은 한 가지 또는 그 이상의 "농축 방법" 또는 "농축 작업 흐름"이 실행된다. 널리 알려진 농축 방법은 화학적 침전, 고체상의 이용, 그리고 크로마토그래피 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
화학적 침전은 표본에 화학적 구성요소의 첨가를 지칭하는데, 이것은 표본의 일정한 성분이 침전되도록 유발한다. 예를 들면, 널리 알려진 침전법은 표본에 아세토니트릴의 첨가이다.
고체상은 고체상 추출 (SPE) 카트리지, 그리고 비드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 용어 "비드"는 비자성, 자성, 또는 상자성 구형 입자를 지칭한다. 비드는 관심되는 피분석물에 대해 특이적이도록 상이하게 코팅될 수 있다. 코팅은 의도된 용도, 다시 말하면 의도된 포획 분자에 따라서 상이할 수 있다. 어떤 코팅이 어떤 피분석물에 적합한 지는 당업자에게 널리 알려져 있다. 비드는 다양한 상이한 물질로 만들어질 수 있다. 비드는 다양한 크기를 가질 수 있고, 그리고 공극이 있거나 또는 없는 표면을 포함할 수 있다.
용어 "크로마토그래피"는 화학적 실체가 정지 액체상 또는 고체상 주변에서 또는 위에서 유동할 때 이들 화학적 실체의 차별적 분포의 결과로서, 액체 또는 가스에 의해 운반된 화학적 혼합물이 구성요소로 분리되는 과정을 지칭한다.
용어 "액체 크로마토그래피" 또는 "LC"는 유체가 미세하게 갈라진 물질의 칼럼을 통해, 또는 모세관 경로를 통해 균일하게 스며들 때 유체 용액의 한 가지 또는 그 이상의 구성요소의 선택적 지연의 과정을 지칭한다. 지연은 이러한 유체가 정지상(들)에 상대적으로 움직임에 따라서, 하나 또는 그 이상의 정지상 및 벌크 유체 (다시 말하면, 이동상) 사이에서 혼합물의 구성요소의 분포로부터 발생한다. 정지상이 이동상보다 더욱 극성인 방법 (예를 들면, 이동상으로서 톨루엔, 정지상으로서 실리카)은 정상 액체 크로마토그래피 (NPLC)로 명명되고, 그리고 정지상이 이동상보다 극성이 적은 방법 (예를 들면, 이동상으로서 물-메탄올 혼합물 및 정지상으로서 C18 (옥타데실실릴))은 역상 액체 크로마토그래피 (RPLC)로 명명된다.
"고성능 액체 크로마토그래피" 또는 "HPLC"는 이동상을 압력 하에 정지상, 전형적으로 조밀하게 패킹된 칼럼을 통해 강제함으로써, 분리의 정도가 증가되는 액체 크로마토그래피의 방법을 지칭한다. 전형적으로, 칼럼은 불규칙적으로 또는 구형으로 성형된 입자, 다공성 모놀리식 층, 또는 다공성 막으로 구성되는 정지상으로 패킹된다. HPLC는 역사적으로, 이동상 및 정지상의 극성에 기초하여 2가지 상이한 하위부류, 다시 말하면 NP-HPLC 및 RP-HPLC로 나눠진다.
마이크로 LC는 좁은 내부 칼럼 직경, 전형적으로 1 mm 미만, 예를 들면 약 0.5 mm를 갖는 칼럼을 이용한 HPLC 방법을 지칭한다. "울트라 고성능 액체 크로마토그래피" 또는 "UHPLC"는 예를 들면 120 MPa (17,405 lbf/in2)의 높은 압력, 또는 약 1200 공기를 이용한 HPLC 방법을 지칭한다.
신속 LC는 <2 cm, 예를 들면 1 cm의 짧은 길이, 앞서 언급된 바와 같은 유동률 적용 및 앞서 언급된 바와 같은 압력 (마이크로 LC, UHPLC)과 함께, 앞서 언급된 바와 같은 내부 직경을 갖는 칼럼을 이용한 LC 방법을 지칭한다. 짧은 신속 LC 프로토콜은 단일 분석 칼럼을 이용한 포획 / 세척 / 용리 단계를 포함하고 <1 분의 매우 짧은 시간 내에 LC를 실현한다.
추가의 널리 알려진 LC 양식은 친수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 크기 배제 LC, 이온 교환 LC, 그리고 친화성 LC를 포함한다.
LC 분리는 단일-통로 LC, 또는 병렬로 배열된 복수의 LC 통로를 포함하는 멀티채널 LC일 수 있다. LC에서 피분석물은 당업자에게 전반적으로 알려진 바와 같이, 그들의 극성 또는 로그 P 값, 크기 또는 친화성에 따라서 분리될 수 있다.
본원 발명의 맥락에서, 용어 "일차 농축 과정", "일차 농축 단계", 또는 "일차 농축 작업 흐름"은 표본의 전처리 다음에 발생하고, 그리고 초기 표본에 비하여 농축된 피분석물을 포함하는 표본을 제공하는 농축 과정을 지칭한다.
본원 발명의 맥락에서 용어 "이차 농축 과정", "이차 농축 단계", 또는 "이차 농축 작업 흐름"은 표본의 전처리 및 일차 농축 과정 다음에 발생하고, 그리고 초기 표본 및 일차 농축 과정 후 표본에 비하여 농축된 피분석물을 포함하는 표본을 제공하는 농축 과정을 지칭한다.
용어 "크로마토그래피"는 화학적 실체가 정지 액체상 또는 고체상 주변에서 또는 위에서 유동할 때 이들 화학적 실체의 차별적 분포의 결과로서, 액체 또는 가스에 의해 운반된 화학적 혼합물이 구성요소로 분리되는 과정을 지칭한다.
"키트"는 적어도 하나의 시약, 예를 들면, 장애의 치료를 위한 약제, 또는 본원 발명의 피분석물을 특이적으로 검출하기 위한 프로브를 포함하는 임의의 제조 물품 (예를 들면, 포장 또는 용기)이다. 키트는 바람직하게는, 본원 발명의 방법을 수행하기 위한 단위로서 홍보되거나, 배포되거나, 또는 판매된다. 전형적으로, 키트는 엄격하게 밀폐된 상태에서 하나 또는 그 이상의 용기 수단 예컨대 바이알, 튜브 등을 받아들이도록 구획화되는 운반체 수단을 더욱 포함할 수 있다. 특히, 용기 수단은 첫 번째 양상의 방법에서 이용되는 별개 원소 중에서 한 가지를 포함할 수 있다. 키트는 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 주입기, 그리고 사용법을 동반한 포장 삽입물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 추가 물질을 포함하는 하나 또는 그 이상의 다른 용기를 더욱 포함할 수 있다. 표지는 조성물이 특정한 적용에 이용된다는 것을 지시하기 위해 용기 상에 존재할 수 있고, 그리고 또한 생체내 또는 시험관내 이용 중에서 어느 한 가지에 대한 방향을 지시할 수 있다. 키트는 또한, 데이터 저장 매체 또는 장치, 예컨대 광학적 저장 매체 (예를 들면, 콤팩트 디스크) 상에서 제공되거나, 또는 컴퓨터 또는 데이터 처리 장치 상에서 직접적으로 제공된 컴퓨터 프로그램 코드를 포함할 수 있다. 게다가, 키트는 보정 목적으로, 본원의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 바이오마커에 대한 기준량을 포함할 수 있다.
"포장 삽입물"은 진단적 산물의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는 데 이용되는데, 이것은 이런 진단적 산물의 이용에 관련된 징후, 용법, 성과 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포한다.
구체예
본원 발명의 첫 번째 양상은 다음을 포함하는, 표본 내에서 당화 헤모글로빈 A (HbA1c)을 결정하기 위한 방법에 관계한다:
(a) 헤모글로빈 A (HbA) 분자를 포함하는 표본을 제공하는 단계,
(b) (a) 단계로부터 획득된 표본에 부분적인 단백질분해성 소화 단계를 실행하여, 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 산출하는 단계,
(c) (b) 단계에서 산출된 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 임의적으로 농축하는 단계, 그리고
(d) 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 포함하는 표본에 질량 분광분석 (MS)에 의한 분석을 실행하여, 표본 내에 HbA1c의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
그것에 의하여, 표본 내에서 HbA1c의 양 또는 농도, 특히 HbA1c의 상대적 양, 다시 말하면 비-당화된 HbA0 분자에 대한 또는 전체 HbA 분자에 대한 당화된 HbA1c 분자의 비율이 결정될 수 있다. 상기 방법은 매우 정확하고, 그리고 소정의 표본 내에 HbA1c의 양, HbA1c/HbA의 비율, 또는 HbA1c/HbA0 비율을 반복해서 결정할 때, 2.5% 또는 그 이하, 특히 2.0% 또는 그 이하, 더욱 특히 1.5% 또는 그 이하의 변동 계수 (CV)를 제공한다.
(a) 단계에 따라서 헤모글로빈 분자를 포함하는 표본이 제공된다. 표본은 바람직하게는, 예를 들면 혈액이 당화 헤모글로빈 A의 양에 대해 검사되는 개체로부터 유래된 용혈된 전혈 표본, 특히 용혈된 인간 전혈 표본이다. 용혈은 특히, 물 (H2O), 예를 들면 탈이온수 또는 증류수를 특히, 약 1:2 내지 약 1:20, 특히 약 1:5 내지 약 1:10, 특히 약 1:9 (v/v)의 표본: 물의 비율에서 이용한 희석에 의해 실행된다. 표본은 약 30 분 이하, 약 10 분 이하, 약 5 분 이하 또는 심지어 약 2 분 이하의 시간 동안 용혈될 수 있다. 특정한 구체예에서, 표본은 약 10 내지 약 60 초의 시간 동안 용혈된다.
특정한 구체예에서, 용혈은 표본 및 물을 혼합함으로써, 특히 표본 및 물을 와동함으로써 실행된다. 특히 표본 및 물은 약 1 내지 약 60 초 동안, 특히 약 5 내지 약 30 초 동안, 특히 약 10 초 동안 혼합된다, 특히 와동된다.
용혈 동안 표본은 20℃ 내지 30℃의 온도에서, 특히 22-25℃에서, 특히 실온에서 유지될 수 있다.
특정한 구체예에서, 표본의 용혈은 실온에서 10 초 동안 와동함으로써, 표본을 물과 1:9의 비율에서 혼합함으로써 실행된다.
본원 발명의 방법의 (b) 단계는 표본 내에 HbA 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 포함한다. 놀랍게도, 표본 내에 존재하는 헤모글로빈 A 분자에 부분적인 단백질분해성 소화를 실행할 때, 소화 산물의 양이 표본 내에서 HbA1c의 정확한 결정을 가능하게 하는 데 충분한 것으로 밝혀졌다. 따라서, HbA1c의 결정을 위한 신속하고 신뢰성 있는 방법이 제공된다. 부분적인 단백질분해성 소화는 무손상 HbA 분자 및 단백질분해성으로 소화된 HbA 분자를 포함하는 혼합물, 특히 무손상 HbA1c β-사슬 분자, 무손상 HbA0 β-사슬 분자, 단백질분해성으로 소화된 HbA1c β-사슬 분자 및 단백질분해성으로 소화된 HbA0 β-사슬 분자의 혼합물을 유발한다. 바람직한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 표본 내에 본래 존재하는 HbA β-사슬 분자의 총량에 기초하여, 표본 내에 존재하는 HbA β-사슬 분자 중에서 약 1% 내지 약 20%, 특히 약 5% 내지 10%가 소화되는 소화를 포함한다.
본원 발명의 방법의 (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 HbA β-사슬 분자의 단백질분해성 개열이 발생하는 조건 하에 단백질분해효소로 실행된다. 바람직하게는, - 개열 특이성에 기초하여 - 4 내지 20개 아미노산의 범위 안에, 특히 5 내지 15개 아미노산의 범위 안에 길이를 갖는 헤모글로빈 A β- 사슬 분자의 N 말단 단편을 산출하는 단백질분해효소가 선별된다. 더욱 바람직하게는, 단백질분해효소는 아미노산 위치 6, 8, 또는 14 뒤에서 서열 번호: 1에서 도시된 바와 같은 인간 HbA β-사슬 분자의 N 말단을 개열한다.
특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 엔도펩티다아제, 특히 Glu-C, 트립신, 펩신 및 서몰리신으로 구성된 군에서 선택되는 엔도펩티다아제를 이용하여 실행된다. Glu-C를 이용한 단백질분해성 소화는 6개 아미노산의 N 말단 단편을 유발하고, 트립신을 이용한 단백질분해성 소화는 8개 아미노산의 N 말단 단편을 유발하고, 그리고 펩신을 이용한 단백질분해성 소화는 14개 아미노산의 N 말단 단편을 유발한다. 특정한 구체예에서, 단백질분해성 소화는 엔도펩티다아제 Glu-C로 실행된다.
본원 발명의 특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 10 분 내지 약 120 분의 기간 동안, 예를 들면 약 60 분 또는 그 이하, 약 45 분 또는 그 이하, 또는 약 30 분 또는 그 이하의 기간 동안 실행된다. 특정한 구체예에서, 부분적인 단백질분해성 소화는 약 15 분 내지 약 45 분 동안 실행된다.
특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 20℃ 내지 약 40℃, 특히 약 25℃ 내지 약 37℃, 특히 약 30℃ 내지 약 37℃의 온도 범위에서 실행된다. 특정한 구체예에서, 부분적인 단백질분해성 소화는 37℃에서 실행된다.
구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화에 이용되는 완충액은 Na+ 및/또는 K+ 이온을 포함하지 않는 완충액, 특히 암모늄 이온을 포함하는 완충액 예컨대 예를 들면 약 20 mM 내지 약 50 mM 아세트산암모늄, 또는 약 30 mM 아세트산암모늄을 포함하는 아세트산암모늄 또는 구연산암모늄 완충액이다.
구체예에서, 소화 완충액의 pH는 특이적 단백질분해효소에 의존할 것이다. Glu-C가 단백질분해효소로서 이용되는 구체예에서, 소화 완충액은 산성 pH, 예를 들면 약 4 내지 약 5의 pH, 특히 약 4.2 내지 약 4.5의 pH, 또는 약 4.3의 pH를 갖는다.
구체예에서, (b) 단계에서 프로테아제는 원하는 정도의 부분적인 소화를 획득하기 위해 임의의 적합한 농도로 존재한다. 구체예에서, 단백질분해효소, 예를 들면 엔도펩티다아제 Glu-C는 약 0.1 내지 약 1 mg/mL, 특히 0.3 mg/ml 내지 0.8 mg/ml, 특히 약 0.6 mg/mL의 농도를 갖는다. Glu-C가 단백질분해효소로서 이용되는 특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화에서 이용되는 농도는 약 0.6 mg/mL이다.
특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 37℃의 온도에서 약 45 분 동안 엔도펩티다아제 Glu-C를 이용하여 실행된다.
특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 37℃의 온도에서 약 45 분 동안 약 0.6 mg/ml의 농도로 엔도펩티다아제 Glu-C를 이용하여 실행된다.
특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 37℃의 온도에서 약 45 분 동안, 30 mM 아세트산암모늄 완충액에서 약 0.6 mg/ml의 농도로 엔도펩티다아제 Glu-C를 이용하여 실행된다.
특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 37℃의 온도에서 약 45 분 동안, 약 4.3의 pH에서 30 mM 아세트산암모늄 완충액에서 0.6 mg/ml의 농도로 엔도펩티다아제 Glu-C를 이용하여 실행된다.
본원 발명의 특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 원하는 정도의 단백질분해성 개열을 달성한 후 중지된다. 예를 들면, 소화는 단백질분해성 소화를 중지시킬 수 있거나 또는 중지시키는 중지 매질을 첨가함으로써 중지될 수 있다. 특정한 구체예에서 중지제는 희석 매질, 예를 들면 산성 용액, 특히 포름산 (FA)을 포함하는 산성 용액이다. 구체예에서, 상기 산성 용액은 물 중 FA를 포함한다. FA가 (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화를 중지시키기 위한 산성 용액에서 이용되는 구체예에서 FA는 0.05% 내지 0.2% (v/v) FA의 농도로, 특히 약 0.1% (v/v) FA의 농도로 존재할 수 있다. 구체예에서, 산, 특히 FA는 pH를 약 1 내지 약 4로 조정한다. 특히 pH는 약 2.7로 조정된다.
특정한 구체예에서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 37℃의 온도에서 약 45 분 동안 약 4.3의 pH에서 약 30 mM 아세트산암모늄 완충액에서 약 0.6 mg/ml의 농도로 엔도펩티다아제 Glu-C를 이용하여 실행되고, 그리고 물 중 약 0.1% (v/v) FA를 포함하는 희석 완충액을 이용하여 약 2.7의 pH를 조정한 후 중지된다.
특정한 구체예에서, (b) 단계의 부분적인 단백질분해성 소화 후 획득된 표본은 피분석물 농축 작업 흐름, 다시 말하면 표본 내에 헤모글로빈 A β-사슬의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편을 농축하는 것을 포함하는 (c)의 농축 단계가 더욱 실행될 수 있다. 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편을 용어 "농축하는"은 표본에 MS에 의한 분석을 실행하기 전 다른 표본 성분과 대비하여 N 말단 단편 분자의 상대적 양을 증가시키는 것으로 이해된다. 특히, 농축 단계는 계측을 잠재적으로 간섭하는 다른 표본 성분이 고갈되거나 또는 제거되는 동안, N 말단 헤모글로빈 A β-사슬 단편의 농축을 포함한다. 특정한 구체예에서, N 말단 헤모글로빈 A β-사슬 단편은 적어도 약 2의 인자로, 적어도 약 5의 인자로, 또는 적어도 약 10의 인자로 농축된다.
(c)의 농축 단계는 한 가지 또는 그 이상의 농축 방법, 특히 일차 및/또는 이차 농축 단계를 포함할 수 있다. 농축 방법은 당해 분야에서 널리 알려져 있고, 그리고 화학적 침전을 포함하지만 이에 한정되지 않는 화학적 농축 방법, 그리고 고체상 추출 방법, 비드 작업 흐름 및 크로마토그래피 방법 (예를 들면 가스 또는 액체 크로마토그래피)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 고체상을 이용한 농축 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 따라서, 특정한 구체예에서, (c)의 농축 단계는 화학적 침전, 고체상 추출 방법을 이용한 방법, 비드 작업 흐름, 그리고 크로마토그래피 방법으로 구성된 군에서 선택되는 한 가지 또는 그 이상의 농축 방법을 포함한다.
구체예에서, (c)의 농축 단계는 1가지 또는 2가지 농축 방법을 포함한다, 다시 말하면, (c)(i)의 농축 단계 및/또는 (c)(ii)의 농축 단계를 포함한다. 상기 방법이 (c)(i)의 농축 단계 및 (c)(ii)의 농축 단계를 포함하는 구체예에서, (c)(i)의 농축 단계는 (c)(ii)의 농축 단계에 앞서 수행된다.
구체예에서, (c)(i)의 일차 농축 단계는 피분석물-선택적 기를 전처리된 표본에 운반하는 고체상의 첨가를 포함하는 속박/자유 분리 단계를 포함한다. 고체상은 용기 또는 웰 내에 고체 입자 또는 비-입자 고체상, 예를 들면 코팅된 표면으로 구성될 수 있다. 특정한 구체예에서, 고체상은 자성 또는 상자성 입자, 특히 자성 또는 상자성 코어를 갖는 입자로 구성된다. 구체예에서, 상기 자성 또는 상자성 코어는 금속 산화물 및/또는 금속 카바이드를 포함한다. 특히 특정한 구체예에서, 코어는 Fe3O4를 포함한다.
고체상, 특히 자성 또는 상자성 비드의 표면은 특히 소수성 유기 기 예컨대 C3-C18 알킬 기, 더욱 특히 C4 알킬 기를 포함하는 소수성 표면일 수 있다. 게다가, 고체상의 소수성 표면, 특히 자성 또는 초상자성 비드의 표면은 공극을 포함한다. 공극 크기는 1 nm 내지 200 nm, 특히 약 100 nm 이하, 특히 약 10 nm 이하의 범위 안에 있을 수 있다. 적합한 소수성 표면은 예를 들면, "The HPLC Expert: Possibilities and Limitations of Modern High Performance Liquid Chromatography" DOI:10.1002/9783527677610에서 발견될 수 있다.
구체예에서, (c)의 농축 단계는 자성 또는 상자성 비드를 이용한 (c)(i)의 일차 농축 단계를 포함한다. 구체예에서, (c) (i)의 일차 농축 단계는 표본 내에 존재하는 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편의 선택적 결합을 위한 기를 운반하는 자성 또는 상자성 비드의 첨가를 포함한다. 구체예에서, 자성 비드의 첨가는 교반 또는 혼합을 포함한다. 비드 상에서 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편을 포획하기 위한 미리 규정된 배양 기간이 뒤따른다. 구체예에서, 상기 작업 흐름은 자성 비드와 함께 배양 후 세척 단계 (W1)를 포함한다. 피분석물(들)에 따라서 하나 또는 그 이상의 추가 세척 단계 (W2)가 수행된다. 하나의 세척 단계 (W1, W2)는 자석 또는 전자석을 포함하는 자성 비드 취급 유닛에 의한 자성 비드 분리, 액체의 흡인, 세척 완충액의 첨가, 자성 비드의 재현탁, 다른 자성 비드 분리 단계 및 액체의 다른 흡인을 비롯한 일련의 단계를 포함한다. 게다가, 세척 단계는 세척 주기의 용적 및 횟수 또는 조합과는 별개로, 용매의 유형 (물/유기/염/pH)의 관점으로부터 상이할 수 있다. 개별 파라미터를 선택하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 세척 단계 (W1, W2)의 마지막에, 용리 시약의 첨가, 그 이후에 자성 비드의 재현탁 및 자성 비드로부터 관심되는 피분석물(들)을 방출하기 위한 미리 규정된 배양 기간이 뒤따른다. 속박-자유 자성 비드가 이후, 분리되고, 그리고 N 말단 헤모글로빈 A β-사슬 단편을 내포하는 상층액이 포획된다.
구체예에서, N 말단 헤모글로빈 A β-사슬 단편을 포함하는 표본의 고체상과의 접촉은 바람직하게는 산성 pH에서, 예를 들면 약 1 내지 약 4의 pH에서, 특히 약 2.7의 pH에서 일어난다. 이러한 목적으로, 표본, 예를 들면 용혈된 전혈 표본은 원하는 pH를 획득하기 위해, 약 0.01 % 내지 약 0.2 % (v/v), 예를 들면 약 0.1 % (v/v)의 농도에서 전술된 바와 같이 산성 매질, 예를 들면 포름산으로, 부분적인 단백질분해성 소화 후 희석될 수 있다.
고체상으로부터 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 결합된 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편의 선택적 용리는 부하된 고체상을, 약 5 내지 약 20% (v/v), 예를 들면 약 10% (v/v)의 양에서 유기 수혼화성 용매, 특히 아세토니트릴 또는 메탄올을 포함하는 수성 용액일 수 있는 용리 매질과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 용리 매질은 바람직하게는 산성 매질, 특히 포름산을 포함하는 산성 매질이다. 용리 매질의 수성 부분은 고체상 결합 매질, 예를 들면 약 1 내지 약 4의 pH, 예를 들면 약 2.7의 pH를 갖는 산성 매질에 대해 설명된 바와 실제적으로 동일할 수 있다.
대안으로 또는 부가적으로, (c)의 농축 단계는 (c)(ii)의 이차 농축 단계를 포함할 수 있다. (c)(ii)의 이차 농축 단계에서, N 말단 헤모글로빈 A β-사슬 단편은 표본에서 더욱 농축된다. 특정한 구체예에서, (c)(ii)의 농축 단계는 크로마토그래피 단계를 포함하는데, 여기서 표본의 개별 성분이 서로로부터 분리된다. 구체예에서, (c)(ii)의 이차 농축 단계는 상기에서 상세하게 설명된 바와 같이 (b) 단계의 부분적인 단백질분해성 소화 다음에 수행될 수 있거나, 또는 상기에서 상세하게 설명된 바와 같이 (c)(i)의 일차 농축 단계 다음에 수행될 수 있다.
(c)(ii)의 이차 농축 단계에서, 크로마토그래피 분리가 표본 내에 관심되는 피분석물을 더욱 농축하는 데 이용된다. 구체예에서, 크로마토그래피 분리는 가스 또는 액체 크로마토그래피이다. 양쪽 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 구체예에서, 액체 크로마토그래피는 HPLC, 신속 LC, 마이크로-LC, 흐름 주입, 그리고 트랩 및 용리로 구성된 군에서 선택된다. 특정한 구체예에서, 크로마토그래피 분리는 단일 색채 칼럼의 이용, 또는 2개 또는 그 이상의 색채 칼럼의 이용을 포함한다. 2개 또는 그 이상의 색채 칼럼이 이용되는 특정한 구체예에서, 이들 칼럼은 서로의 하류에 위치된다, 다시 말하면 두 번째 칼럼이 첫 번째 칼럼의 하류에 위치되고, 그리고 임의적 세 번째 칼럼이 두 번째 칼럼의 하류에 위치되고, 기타 등등이다. 2개 또는 그 이상의 칼럼이 이용되는 구체예에서, 이들 칼럼은 원하는 기능에 따라서 동일할 수 있거나 또는 서로 상이할 수 있다. 정확한 칼럼 및 설정을 선택하는 것은 당업자에게 널리 알려져 있다.
구체예에서, (b)의 단백질분해성 소화 단계 또는 (c)(i)의 일차 농축 단계 후 획득된 표본은 LC 스테이션으로 이전되거나, 또는 희석 액체의 첨가에 의한 희석 단계 후 LC 스테이션으로 이전된다. 예를 들면 용매의 유형 (물/유기/염/pH) 및 용적을 변화시킴으로써, 상이한 용리 절차/시약이 또한 이용될 수 있다. 다양한 파라미터가 당업자에게 널리 알려져 있고 쉽게 선택된다.
특정한 구체예에서, (c)의 농축 단계는 (c)(i)의 일차 농축 단계 및 (c)(ii)의 이차 농축 단계를 포함하는데, 특히 여기서 (c)(ii)의 이차 농축 단계는 (c)(i)의 일차 농축 단계 다음에 수행된다. 특정한 구체예에서, (c)(i)의 일차 농축 단계는 상기에서 상세하게 설명된 바와 같은 비드 작업 흐름을 포함하고, 그리고 (c)(ii)의 이차 농축 단계는 특히 HPLC, 신속 LC, 마이크로-LC, 흐름 주입 및/또는 트랩 및 용리로 구성된 군에서 선택되는 액체 크로마토그래피를 포함한다.
본원 발명에 따라서, 본원 발명의 방법의 (d) 단계는 프로테아제 예컨대 펩신, 트립신 또는 Glu-C로 부분적인 소화에 의해 산출되고, 그리고 MS 분석 전 비-소화된 무손상 헤모글로빈 A β-사슬 분자로부터 분리된, 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편의 분석을 포함한다.
(d) 단계에 따른 분석은 MS에 의해 실행된다. 바람직하게는 MS 분석 절차는 탠덤 MS (MS/MS) 분석, 특히 삼중 4극 (Q) MS/MS 분석을 포함한다.
구체예에서, (d)의 질량 분광 분석 단계는 다음을 포함한다:
(i) 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편의 이온에 질량 분광 분석의 일차 시기를 실행함, 여기서 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편의 부모 이온은 질량/전하 (m/z) 비율에 따라서 특징화되고,
(ii) 부모 이온의 단편화를 유발함, 여기서 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편의 딸 이온은 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편의 부모 이온과 m/z 비율에서 서로 다르고, 그리고
(iii) 딸 이온에 질량 분광 분석의 이차 시기를 실행함, 여기서 딸 이온은 m/z 비율에 따라서 특징화된다.
본원 발명의 방법은 표본 내에 HbA1c의 정량적 결정을 포함한다. 특히, 비-당화된 HbA0 분자에 대한 또는 전체 HbA 분자에 대한 당화된 HbA1c 분자의 상대적 양이 결정된다. 특히 바람직한 구체예에서, 이러한 상대적 양은 2.5% 또는 그 이하, 특히 2.0% 또는 그 이하, 더욱 특히 1.5% 또는 그 이하의 변동 계수 (CV)로 결정된다.
특히 바람직한 구체예에서, 본원 발명의 방법은 하기와 같은 작업 흐름을 포함한다:
(a) 전혈 표본을 예를 들면 H2O로 희석에 의해 용혈시키는 단계,
(b) (a) 단계로부터 획득된 표본에 엔도프로테이나아제 Glu-C를 이용한 부분적인 단백질분해성 소화를 실행하여, 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 산출하고, 그리고 희석된 산, 예를 들면 포름산을 첨가함으로써 소화를 중지시키는 단계,
(c) 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편이 고체상에 결합하는 조건 하에, 표본을 고체상, 특히 자성 또는 상자성 입자로 구성되는 고체상, 특히 소수성으로 변형된 표면을 갖는 고체상과 접촉시킴으로써, (b) 단계에서 산출된 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 농축하고, 그리고 결합된 단편을 부하된 고체상으로부터 선택적으로 용리하는 단계, 그리고
(d) 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 포함하는 (c) 단계로부터 획득된 표본에 MS, 특히 탠덤 질량 분광분석 (MS/MS), 특히 삼중 4극 탠덤 MS에 의한 분석을 실행하여, 표본 내에 HbA1c의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
첫 번째 양상의 추가 구체예에서, 표본 내에 당화 헤모글로빈 A (HbA1c)를 결정하는 방법은 내부 표준 (ISTD)을 표본에 첨가하는 추가 단계를 포함한다. 구체예에서, 내부 표준은 (b)의 부분적인 단백질분해성 소화 단계 전후에 표본에 첨가된다. 내부 표준이 (b)의 부분적인 단백질분해성 소화 단계 전 첨가되는 사례에서, 내부 표준은 바람직하게는 동위원소적으로 표지화된 무손상 헤모글로빈 분자이다. 내부 표준이 (b)의 부분적인 단백질분해성 소화 단계 후 첨가되는 사례에서, 내부 표준은 바람직하게는 동위원소적으로 표지화된 HbA1c 펩티드이다. 구체예에서 동위원소적으로 표지화된 ISTD는 적어도 하나의 2H, 13C 및/또는 15N 표지를 포함한다.
본원 발명의 두 번째 양상은 특히 전술된 바와 같은 방법을 수행하는 데 적합한 키트에 관계하고, 상기 키트는 다음을 포함한다:
(i) HbA β-사슬 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 위한 효소, 그리고 임의적으로 상기 효소에 대한 소화 완충액,
(ii) (i)의 효소를 이용한 단백질분해성 소화를 중지시킬 수 있거나 또는 중지시키는 중지 매질, 그리고
(iii) 임의적으로, 단백질분해성으로 소화된 HbA1c 분자를 농축하기 위한 농축 수단, 그리고
(iv) 임의적으로, (iii)의 농축 수단으로부터 표본 구성요소를 용리하는 데 이용을 위한 유기 수혼화성 용매를 포함하는 용리 매질.
본원 발명의 두 번째 양상의 특정한 구체예에 대하여, 첫 번째 양상의 맥락에서 상기에서 상세하게 설명된 모든 구체예를 참조한다.
본원 발명의 두 번째 양상의 구체예에서, 키트 내에 포함된 효소는 Glu-C, 트립신 및 펩신으로 구성된 군에서 선택된다. 특정한 구체예에서, 포함된 효소는 Glu-C이다.
두 번째 양상의 구체예에서, 효소, 특히 Glu-C는 Na+ 및/또는 K+ 이온을 포함하지 않는 완충액 내에, 특히 암모늄 이온을 포함하는 완충액 예컨대 아세트산암모늄 또는 구연산암모늄 완충액 내에 포함된다. 특정한 구체예에서, Glu-C는 약 20 mM 내지 약 50 mM 아세트산암모늄, 또는 약 30 mM 아세트산암모늄을 포함하는 완충액 내에 포함된다.
구체예에서, 소화 완충액의 pH는 특이적 단백질분해효소에 의존할 것이다. Glu-C가 키트 내에 포함되는 구체예에서, 소화 완충액은 산성 pH, 특히 약 4 내지 약 5의 pH, 특히 약 4.2 내지 약 4.5의 pH, 특히 약 4.3의 pH를 갖는다.
구체예에서, 효소, 특히 Glu-C는 원하는 정도의 부분적인 단백질분해성 소화를 획득하기 위해 임의의 적합한 농도로 존재한다. 구체예에서, 키트 내에 포함된 단백질분해효소, 특히 Glu-C는 약 1 내지 약 5 mg/mL, 특히 2 mg/ml 내지 3 mg/ml, 특히 약 2 mg/mL의 농도를 갖는다. Glu-C가 단백질분해효소로서 이용되는 특정한 구체예에서, 키트 내에 포함된 농도는 약 2 mg/mL이다.
구체예에서, 키트는 단백질분해성 소화를 중지시킬 수 있거나 또는 중지시키는 중지 매질, 예를 들면 희석 매질을 더욱 포함한다. 구체예에서, 희석 매질은 포름산 (FA)을 포함하는 산성 용액이다. 구체예에서, 상기 산성 용액은 물 중 FA를 포함한다. 구체예에서, 희석 매질은 0.05% 내지 0.2% (v/v) 농도, 특히 약 0.1% (v/v) 농도의 물 중 FA를 포함한다. 구체예에서, 산은 분석되는 표본의 pH를 약 1 내지 약 4의 pH로 조정하는 양으로 존재한다, 특히 pH는 약 2.7로 조정된다.
구체예에서, 키트는 적어도 하나의 농축 단계, 특히 속박/자유 분리 단계 및/또는 크로마토그래피 단계를 실행하도록 적합된 농축 수단을 포함한다. 구체예에서, 농축 수단은 고체 입자, 예를 들면 자성 또는 상자성 입자로 구성될 수 있는 고체상, 또는 비-입자 고체상을 포함한다.
특정한 구체예에서 고체상은 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편의 선택적 결합을 위한 기, 예를 들면 소수성 유기 기를 운반한다. 더욱 특정한 구체예에서, 농축 수단은 크로마토그래피 칼럼, 특히 크로마토그래피 단계를 수행하기 위한 크로마토그래피 칼럼을 포함할 수 있다.
구체예에서, 키트 내에 임의적으로 포함된 용리 매질은 유기 수혼화성 용매, 특히 아세토니트릴 (ACN)을 포함하는 수성 용액을 포함한다. 유기 수혼화성 용매, 특히 ACN은 약 5 내지 약 20%, 예를 들면 약 10% (v/v)의 양으로 존재한다.
키트는 개별 구성요소의 용기를 포함하는 단일 패키지로서 또는 개별 구성요소의 용기를 각각 포함하는 여러 패키지의 세트로서 제공될 수 있다.
구체예에서, 키트는 포장 삽입물을 더욱 포함한다. 구체예에서, 포장 삽입물은 키트와 관련된 징후, 용법, 성과 및/또는 주의사항에 관한 정보를 포함한다.
본원 발명의 세 번째 양상은 특히 전술된 바와 같은 방법을 수행함으로써, 표본 내에 당화된 HbA1c를 결정하는 데 적합된 진단 시스템이다.
특정한 구체예에서, 진단 시스템은 다음을 포함한다:
(i) HbA1c 분자의 N 말단 단편을 포함하는 표본의 준비를 위한 적어도 하나의 스테이션, 여기서 상기 준비는 헤모글로빈 A (Hb1) 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 포함하고,
(ii) 임의적으로, 표본으로부터 헤모글로빈 A β-분자의 N 말단 단편을 선택적으로 농축하는 데 적합된 적어도 하나의 농축 스테이션, 그리고
(iii) 질량 분광분석 (MS)에 의해 헤모글로빈 A 분자의 N 말단 단편을 분석하고 표본 내에 HbAc1의 양 또는 농도를 결정하는 데 적합된 적어도 하나의 스테이션.
본원 발명의 세 번째 양상의 특정한 구체예에 대하여, 첫 번째와 두 번째 양상의 맥락에서 상기에서 상세하게 설명된 모든 구체예를 참조한다.
특정한 구체예에서, 진단 시스템은 표본의 고처리량을 가능하게 하도록, 특히 100개 표본/시 또는 그 이상까지의 처리량을 가능하게 하도록 적합된다. 예를 들면, 본원에서 참조로서 편입되는 WO 2017/103180에서 설명된 바와 같은 시스템이 이용될 수 있다.
특정한 구체예에서, 진단 시스템은 무작위 접근 표본 준비를 위한 적어도 하나의 스테이션, 그리고 MS 분석 전 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편의 농축을 위한 적어도 하나의 스테이션을 포함한다.
구체예에서, 이런 진단 시스템은 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 포함하는 표본의 자동화된 준비를 위한 표본 준비 스테이션을 포함한다. 특정한 구체예에서, 상기 스테이션은 하나 또는 그 이상의 표본을 용혈시키기 위한 섹션, 그리고 하나 또는 그 이상의 표본에서 HbA 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 제공하기 위한 섹션을 포함한다.
구체예에서, 상기 진단 시스템은 농축 스테이션을 더욱 포함한다. 상기 농축 스테이션은 부분적인 단백질분해성 소화 후 하나 또는 그 이상의 표본을 농축 수단, 특히 고체상, 특히 자성 또는 상자성 입자와 접촉시키기 위한 섹션을 포함한다. 부가적으로 또는 대안으로, 농축 스테이션은 크로마토그래피 섹션, 특히 LC 섹션을 포함한다. 구체예에서, LC 섹션은 하나 또는 그 이상의 LC 통로를 포함한다. LC 섹션이 하나 이상의 LC 통로를 포함하는 구체예에서, 이들 통로는 병렬적으로 배열될 수 있다.
구체예에서, 진단 시스템은 이전에 준비된 표본을 차후 섹션 또는 스테이션 내로 입력하기 위한, 상이한 섹션 및 스테이션 사이에 적어도 하나의 인터페이스를 포함한다.
구체예에서, 진단 시스템은 각각, 표본 준비 및 농축 단계의 미리 규정된 순서를 포함하고 완료를 위해 미리 규정된 시간을 필요로 하는 미리 규정된 표본 준비 및 농축 작업 흐름에 표본을 배정하도록 프로그램될 수 있는 조절기를 더욱 포함한다.
특정한 구체예에서, 조절기는 예상된 용리 시간에 기초하여, 상이한 농축 스테이션 통로로부터 HbA β-사슬 분자의 N 말단 단편이 비중복 용출물 출력 순서로 용리하도록 허용하는, 준비된 표본을 입력하기 위한 농축 스테이션 통로 입력 순서를 계획한다.
구체예에서, 조절기는 표본의 준비가 완료될 때, 배정된 농축 스테이션 통로 역시 가용하고, 그리고 준비된 표본이 다른 표본의 준비가 완료되기 전 또는 그 다음 준비된 표본이 표본 준비/농축 인터페이스에 도달하기 전, 배정된 농축 스테이션 통로 내로 입력될 수 있도록, 농축 스테이션 통로 입력 순서에 정합하는 표본 준비 스테이션으로부터 준비된 표본 출력 순서를 산출하는 표본 준비 시작 순서를 세팅하고 개시한다.
구체예에서, 조절기는 작업 흐름의 적합한 타이밍을 위한 참조 기간을 세팅한다. 이것은 하기의 처리 단계를 조율하는 것을 가능하게 만든다: (1) 참조 기간마다 기껏해야 하나의 표본의 준비를 시작하는 단계, 여기서 표본 준비 시작 순서 내에 연속 표본 사이에 하나 또는 그 이상의 참조 기간이 가능하고; 및/또는 (2) 참조 기간마다 기껏해야 하나의 표본의 준비를 완료하는 단계, 여기서 준비된 표본 출력 순서의 연속 준비된 표본 사이에 하나 또는 그 이상의 참조 기간이 가능하고; 및/또는 (3) 농축 스테이션 통로 중에서 하나로 참조 기간마다 하나의 준비된 표본을 입력하는 단계, 여기서 연속 농축 스테이션 통로 입력 사이에 하나 또는 그 이상의 참조 기간이 가능하고; 및/또는 (4) 참조 기간마다 하나의 농축 스테이션 용출물을 출력하는 단계, 여기서 연속 농축 스테이션 용출물 사이에 하나 또는 그 이상의 참조 기간이 가능하다.
특히, 본원 발명은 하기의 항목에 관계한다:
1. 다음 단계를 포함하는, 표본 내에서 당화 헤모글로빈 A (HbA1c)를 결정하기 위한 방법:
(a) 헤모글로빈 A (HbA) 분자를 포함하는 표본을 제공하는 단계,
(b) (a) 단계로부터 획득된 표본에 부분적인 단백질분해성 소화 단계를 실행하여, 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 산출하는 단계,
(c) (b) 단계에서 산출된 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 임의적으로 농축하는 단계, 그리고
(d) 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 포함하는 표본에 질량 분광분석 (MS)에 의한 분석을 실행하여, 표본 내에 HbA1c의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
2. 항목 1의 방법, 여기서 (a) 단계에서 표본은 용혈된 전혈 표본, 특히 용혈된 인간 전혈 표본이다.
3. 항목 1 또는 2의 방법, 여기서 (a) 단계에서 표본은 물 (H2O)을 이용하여, 예를 들면 약 1.2 내지 약 1:20의 표본: 물의 비율에서 예컨대 약 1:5, 약 1:10, 또는 약 1: 9 (v/v)의 비율에서 용혈된다.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나의 방법, 여기서 표본은 30 분 이하, 약 10 분 이하, 또는 약 5 분 이하의 기간 동안, 특히 약 10 내지 약 60 초의 기간 동안 용혈된다.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b)의 부분적인 단백질분해성 소화 단계에서, 표본 내에 본래 존재하는 HbA β-사슬 분자의 총량에 기초하여, 표본 내에 존재하는 HbA β-사슬 분자 중에서 약 1% 내지 약 20%, 특히 약 5% 내지 10%가 소화된다.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 4-20개 아미노산의 범위 안에, 특히 5-15개 아미노산의 범위 안에 길이를 갖는 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 산출하는 단백질분해효소로 실행되고, 그리고 더욱 특히 여기서 상기 단백질분해효소는 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치 6, 8 또는 14 뒤에서 헤모글로빈 A β-사슬 분자를 개열한다.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 엔도펩티다아제, 특히 Glu-C, 트립신, 펩신 및 서몰리신으로 구성된 군에서 선택되는 엔도펩티다아제로 실행된다.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 60 분 이하, 특히 약 45 분 이하, 또는 30 분 이하의 기간 동안 실행된다.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 20℃ 내지 약 40℃ 또는 약 25℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서 실행된다.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b) 단계에서 소화 완충액은 암모늄 이온을 포함하는 완충액 예컨대 예를 들면 약 20 내지 약 50 mM 아세트산암모늄, 특히 약 30 mM 아세트산암모늄을 포함하는 아세트산암모늄 또는 구연산암모늄 완충액이다.
11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 방법, 여기서 소화 완충액은 약 4 내지 약 5의 pH, 특히 약 4.3의 pH를 갖는다.
12. 항목 1 내지 11 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b) 단계에서 단백질분해효소는 약 0.1 내지 약 1 mg/mL, 특히 약 0.6 mg/mL의 농도로 존재한다.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 특히 산성 매질 예컨대 물 중 포름산 (FA), 특히 약 0.1% (v/v) FA를 첨가함으로써 중지된다.
14. 항목 1 내지 13 중 어느 하나의 방법, 여기서 (b) 단계에서 단백질분해성 소화는 특히, 암모늄 이온을 포함하는 완충액에서, 약 37℃의 온도에서 약 15 분 내지 약 45 분의 기간 동안 약 0.6 mg/mL의 농도에서 엔도펩티다아제 Glu-C로 실행되고, 그리고 상기 소화는 물 중 포름산, 특히 물 중 0.1% (v/v) FA를 첨가함으로써 중지된다.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나의 방법, 여기서 (c)의 농축 단계는 헤모글로빈 A β-사슬의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편이 고체상에 결합하는 조건 하에, 표본을 헤모글로빈 A β-사슬의 단백질분해성으로 산출된 N 말단 단편의 선택적 결합을 위한 표면을 갖는 고체상과 접촉시키고, 그리고 결합된 단편을 고체상으로부터 선택적으로 용리하는 것을 포함하는 (c) (i)의 속박/자유 분리 단계를 포함한다.
16. 항목 15의 방법, 여기서 고체상은 소수성 표면을 포함한다.
17. 항목 15 또는 16의 방법, 여기서 (c) (i)의 단계에서 표본은 산성 pH에서, 특히 약 1 내지 약 3의 pH에서, 예를 들면 약 2의 pH에서 고체상과 접촉된다.
18. 항목 15 내지 17 중 어느 하나의 방법, 여기서 고체상은 입자, 예를 들면 자성 또는 상자성 입자, 예를 들면 금속 산화물 및/또는 금속 카바이드, 특히 Fe3O4를 포함하는 자성 또는 상자성 코어를 갖는 입자로 구성된다.
19. 항목 15 내지 18 중 어느 하나의 방법, 여기서 고체상의 소수성 표면은 C3-C18 알킬 기, 특히 C4 알킬 기를 포함한다.
20. 항목 15 내지 19 중 어느 하나의 방법, 여기서 고체상의 소수성 표면은 약 100 nm 이하, 특히 약 10 nm 이하의 공극 크기를 갖는 공극을 포함한다.
21. 항목 15 내지 20 중 어느 하나의 방법, 여기서 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편은 특히 약 5 - 20% (v/v) 아세토니트릴의 존재에서, 더욱 특히 약 10% (v/v) 아세토니트릴의 존재에서 고체상으로부터 선택적 용리에 의해 농축된다.
22. 항목 1 내지 21 중 어느 하나의 방법, 여기서 (c) 단계는 표본의 (ii)의 크로마토그래피 단계, 특히 액체 크로마토그래피 예컨대 HPLC, 마이크로 LC, 또는 신속 LC를 포함한다.
23. 항목 15 내지 22 중 어느 하나의 방법, 여기서 농축 단계는 (c) (i)의 속박/자유 분리 단계 및 (c) (ii)의 크로마토그래피 단계를 포함한다.
24. 항목 1 내지 23 중 어느 하나의 방법, 여기서 (d) 단계는 MS/MS 분석, 특히 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편의 MS/MS 분석을 포함한다.
25. 항목 1 내지 24 중 어느 하나의 방법, 여기서 (d) 단계는 삼중 4극-MS/MS 분석을 포함한다.
26. 항목 1 내지 25 중 어느 하나의 방법, 여기서 비-당화 헤모글로빈 A (HbA0)에 대한 또는 총 헤모글로빈 A (HbA)에 대한 당화 헤모글로빈 A (HbA1c)의 비율이 결정된다.
27. 항목 26의 방법, 여기서 비율은 2.5% 또는 그 이하, 특히 2.0% 또는 그 이하, 더욱 특히 1.5% 또는 그 이하의 변동 계수로 결정된다.
28. 다음을 포함하는 키트:
(i) HbA β-사슬 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 위한 효소, 그리고 임의적으로 상기 효소에 대한 소화 완충액,
(ii) (i)의 효소를 이용한 단백질분해성 소화를 중지시킬 수 있는 중지 매질, 그리고
(iii) 임의적으로, 단백질분해성으로 소화된 HbA1c 분자를 농축하기 위한 농축 수단, 그리고
(iv) 임의적으로, (iii)의 농축 수단으로부터 표본 구성요소를 용리하는 데 이용을 위한 유기 수혼화성 용매를 포함하는 용리 매질.
29. 항목 1 내지 27 중 어느 하나의 방법에서 항목 28의 키트의 용도.
30. 항목 1 내지 27 중 어느 하나의 방법을 수행하도록 적합된, 표본 내에 당화 헤모글로빈 A (HbAc1)를 결정하기 위한 진단 시스템.
31. 다음을 포함하는, 표본 내에 당화 헤모글로빈 A (HbAc1)를 결정하기 위한 진단 시스템:
(i) HbA1c 분자의 N 말단 단편을 포함하는 표본의 준비를 위한 적어도 하나의 스테이션, 여기서 상기 준비는 헤모글로빈 A (Hb1) 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 포함하고,
(ii) 임의적으로, 표본으로부터 헤모글로빈 A β-분자의 N 말단 단편을 선택적으로 농축하는 데 적합된 적어도 하나의 농축 스테이션, 그리고
(iii) 질량 분광분석 (MS)에 의해 헤모글로빈 A 분자의 N 말단 단편을 분석하고 표본 내에 HbAc1의 양 또는 농도를 결정하는 데 적합된 적어도 하나의 스테이션.
32. 항목 1 내지 27 중 어느 하나의 방법에서 항목 30 또는 31의 진단 시스템의 용도.
하기에서, 본원 발명은 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명된다.
실시예
실시예 1
전혈에서 HbA1 펩티드 단편의 결정
100 μL의 전혈 표본이 900 μL H2O로 희석되었고, 그리고 투명한 용액이 획득될 때까지 10 s 동안 와동에 의해 혼합되었다. 이후, 5 μL의 용혈된 전혈 표본이 20 μL H2O로 더욱 희석되었다. 5 μL의 희석된 용혈된 혈액 표본, 15 μL 엔도프로테이나아제 Glu-C (2 mg/mL) 및 30 μL 소화 완충액 (50 mM 아세트산암모늄 pH 4.3)이 LoBind 바이알 (Eppendorf)에 첨가되었고, 그리고 표본 내에 존재하는 HbA 분자의 부분적인 소화, 예를 들면 1 내지 20 %의 소화를 제공하기 위해 37℃에서 45 분 동안 배양되었다. 950 μL의 0.1% (v/v) 포름산을 첨가함으로써 효소 반응이 중지되었다.
이후, 100 μL 소수성 자성 비드 (50 mg/mL)의 여러 배치가 제공되었다. 200 μL의 소화된 전혈 표본 및 0.1% (v/v) 포름산을 포함하는 700 μL H2O가 자성 비드의 각 배치에 첨가되었다. 혼합물이 37℃ 및 1200 rpm에서 5 분 동안 진탕되었다.
그 다음, 비드가 900 μL 0.1% (v/v) 수성 포름산을 이용하여 2회 세척되었다. 차후에, 900 μL 용리 매질 (상이한 양의 아세토니트릴 (ACN), 다시 말하면 5% (v/v), 10% (v/v), 15% (v/v), 20% (v/v) 및 30% (v/v)를 내포하는, 0.1% 포름산을 포함하는 물)이 부하된 비드의 각 배치에 첨가되었다. 혼합물이 37℃ 및 1200 rpm에서 1 분 동안 진탕되었고, 그리고 상층액이 수집되었다.
각 배치로부터, 검사를 위해 500 μL 용리 매질이 수집되었다. 1 μL가 역상 칼럼 (Symmetry C18 Sentry Guard Cartridge 300A, 3.5 μm, 2.1 x 10 mm; Waters)에 주입되었다. 이후, 900 μL/분에서 0.1% 포름산과 함께 10% 수성 ACN을 이용한 등용매성 용리가 실행되었다. 총 실행 시간은 12 s이었다.
MS/MS에 대한 파라미터는 하기와 같았다:
이온 공급원 유형: ESI
분무 전압:
- 정적
- 양이온 (V): 350,000
- 음이온 (V): 250,000
- 시스 가스 (Arb): 50
- Aux 가스 (Arb): 25
- 스위프 가스 (Arb): 3
- 이온 전달 튜브 온도 (℃): 350
- 기화기 온도 (℃): 400
표 1에서 HbA0 및 HbA1c에 대한 계측 파라미터가 표시된다:
화합물 시작 시간 (분) 종료 시간 (분) 극성 전구체 (m/z) 산물 (m/z) 충돌 에너지 (V) RF 렌즈 (V)
1 HbA0 0 0.6 양성 348.288 236.968 22.944 47
2 HbA1c 0 0.6 양성 429.342 245.054 16.522 52
도 1은 Glu-C를 이용한 전혈 표본의 소화에 의해 획득된 HbA1c 및 HbA0 펩티드로부터 MS/MS 피크를 도시한다.
표 2에서 용리 매질에서 상이한 양의 아세토니트릴 (ACN)로 획득된 HbA0 및 HbA1c의 양 및 HbA1c/HbA0 비율에 대한 반복 검정 (n=3)의 변동 계수 (CV)에 대한 계측 결과가 표시된다:
%RSD HbA0 HbA1c HbA1c/HbA0
일반 혈액 비드 작업 흐름 5% ACN 0.5 2.7 3.1
일반 혈액 비드 작업 흐름 10% ACN 1.2 2.0 1.0
일반 혈액 비드 작업 흐름 15% ACN 0.7 1.1 0.6
도 2는 추가 정제 없이 (위쪽), 그리고 각각, 자성 비드 상에서 농축에 의한 표본 정제, 그 이후에 세척 및 상이한 농도의 ACN, 다시 말하면 5% (v/v) ACN, 10%(v/v) ACN, 15% (v/v) ACN, 20% (v/v) ACN 및 30% (v/v) ACN을 이용한 용리와 함께, Glu-C를 이용한 전혈 표본의 소화로부터 결과를 도시한다. 특히 5% 또는 10% ACN의 양에서 ACN을 이용한 용리는 HbA1c 및 HbA0의 특이적 용리, 그리고 따라서 LC-MS에 앞서 농축을 가능하게 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> High speed sample workflow for LC-MS based HbA1c measurement <130> 65851P WO <150> EP19152309.1 <151> 2019-01-17 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp Gly 1 5 10 15

Claims (15)

  1. 표본 내의 당화 헤모글로빈 A (HbA1c)를 결정하기 위한 방법에 있어서, 다음 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 헤모글로빈 A (HbA) 분자를 포함하는 표본을 제공하는 단계,
    (b) (a) 단계로부터 획득된 표본에 부분적인 단백질분해성 소화 단계를 실행하여, 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 산출하는 단계,
    (c) (b) 단계에서 산출된 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 임의적으로 농축하는 단계, 그리고
    (d) 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 포함하는 표본에 질량 분광분석 (MS)에 의한 분석을 실행하여, 표본 내의 HbA1c의 양 또는 농도를 결정하는 단계.
  2. 청구항 제1항에 있어서, (a) 단계에서 표본은 용혈된 전혈 표본, 특히 용혈된 인간 전혈 표본인, 결정 방법.
  3. 청구항 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 부분적인 단백질분해성 소화 단계에서, 표본 내에 본래 존재하는 HbA β-사슬 분자의 총량에 기초하여, 표본 내에 존재하는 HbA β-사슬 분자 중에서 약 1% 내지 약 20%, 특히 약 5% 내지 10%가 소화되는, 결정 방법.
  4. 청구항 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 4-20개 아미노산의 범위 안에, 특히 5-15개 아미노산의 범위 안에 길이를 갖는 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편을 산출하는 단백질분해효소로 실행되고, 그리고 더욱 특히 단백질분해효소는 서열 번호: 1에 따른 아미노산 위치 6, 8 또는 14 뒤에서 헤모글로빈 A β-사슬 분자를 개열하는, 결정 방법.
  5. 청구항 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 엔도펩티다아제, 특히 Glu-C, 트립신, 펩신 및 서몰리신으로 구성된 군에서 선택되는 엔도펩티다아제로 실행되는, 결정 방법.
  6. 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 부분적인 단백질분해성 소화는 약 60 분 미만, 특히 약 45 분 미만, 또는 30 분 미만의 기간 동안 실행되는, 결정 방법.
  7. 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계에서 단백질분해성 소화는 특히, 암모늄 이온을 포함하는 완충액에서, 약 37℃의 온도에서 약 15 분 내지 약 45 분의 기간 동안 약 0.6 mg/mL의 농도에서 엔도펩티다아제 Glu-C로 실행되고, 그리고 소화는 물 중 포름산, 특히 물 중 0.1% (v/v) FA를 첨가함으로써 중지되는, 결정 방법.
  8. 청구항 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 농축 단계에서, 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편은 특히, 약 5 - 20% (v/v) 아세토니트릴의 존재에서, 더욱 특히 약 10% (v/v) 아세토니트릴의 존재에서 고체상으로부터 선택적 용리에 의해 농축되는, 결정 방법.
  9. 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 단계는 MS/MS 분석, 특히 헤모글로빈 A β-사슬 분자의 N 말단 단편의 MS/MS 분석을 포함하는, 결정 방법.
  10. 청구항 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 비-당화 헤모글로빈 A (HbA0)에 대한 또는 총 헤모글로빈 A (HbA)에 대한 당화 헤모글로빈 A (HbA1c)의 비율이 결정되는, 결정 방법.
  11. 다음을 포함하는 키트:
    (i) HbA β-사슬 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 위한 효소, 그리고 임의적으로 상기 효소에 대한 소화 완충액,
    (ii) (i)의 효소를 이용한 단백질분해성 소화를 중지시킬 수 있는 중지 매질, 그리고
    (iii) 임의적으로, 단백질분해성으로 소화된 HbA1c 분자를 농축하기 위한 농축 수단, 그리고
    (iv) 임의적으로, (iii)의 농축 수단으로부터 표본 구성요소를 용리하는 데 이용을 위한 유기 수혼화성 용매를 포함하는 용리 매질.
  12. 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에서의 청구항 제11항의 키트의 용도.
  13. 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 데 적합화된, 표본 내의 당화 헤모글로빈 A (HbAc1)를 결정하기 위한 진단 시스템.
  14. 표본 내의 당화 헤모글로빈 A (HbAc1)를 결정하기 위한 진단 시스템에 있어서, 다음을 포함하는, 진단 시스템:
    (i) HbA1c 분자의 N 말단 단편을 포함하는 표본의 준비를 위한 적어도 하나의 스테이션, 여기서 준비는 헤모글로빈 A (Hb1) 분자의 부분적인 단백질분해성 소화를 포함하고,
    (ii) 임의적으로, 표본으로부터 헤모글로빈 A β-분자의 N 말단 단편을 선택적으로 농축하는 데 적합화된 적어도 하나의 농축 스테이션, 그리고
    (iii) 질량 분광분석 (MS)에 의해 헤모글로빈 A 분자의 N 말단 단편을 분석하고 표본 내의 HbAc1의 양 또는 농도를 결정하는 데 적합화된 적어도 하나의 스테이션.
  15. 청구항 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에서의 청구항 제13항 또는 제14항의 진단 시스템의 용도.
KR1020217022033A 2019-01-17 2020-01-16 Lc-ms 기초된 hba1c 계측을 위한 고속 표본 작업 흐름 KR20210117268A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP19152309.1 2019-01-17
EP19152309 2019-01-17
PCT/EP2020/051039 WO2020148394A1 (en) 2019-01-17 2020-01-16 High speed sample workflow for lc-ms based hba1c measurement

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210117268A true KR20210117268A (ko) 2021-09-28

Family

ID=65279390

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217022033A KR20210117268A (ko) 2019-01-17 2020-01-16 Lc-ms 기초된 hba1c 계측을 위한 고속 표본 작업 흐름

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210333290A1 (ko)
EP (1) EP3911959B1 (ko)
JP (1) JP7438224B2 (ko)
KR (1) KR20210117268A (ko)
CN (1) CN113302499A (ko)
BR (1) BR112021014045A2 (ko)
WO (1) WO2020148394A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115951072B (zh) * 2022-12-06 2024-05-14 北京鸿宇泰生物科技有限公司 一种糖化血红蛋白-c肽联合检测试剂盒

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1749197A1 (en) * 2004-05-27 2007-02-07 Monash University A method for the rapid analysis of polypeptides
DE602007007775D1 (de) * 2006-07-21 2010-08-26 Roche Diagnostics Gmbh Reagenz für hämoglobinabbau
JP5563470B2 (ja) * 2007-11-20 2014-07-30 シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド 糖化ヘモグロビン検出法
FI20115785A0 (fi) * 2011-08-08 2011-08-08 Thermo Fisher Scientific Oy Menetelmä ja laite automaattiseen analyysiin
WO2013173756A1 (en) * 2012-05-18 2013-11-21 University Of North Dakota A method for quantifying proteins and isoforms thereof
WO2015112429A1 (en) * 2014-01-23 2015-07-30 Newomics Inc Methods and systems for diagnosing diseases
JP6694509B2 (ja) * 2015-12-18 2020-05-13 エフ ホフマン−ラ ロッシュ アクチェン ゲゼルシャフト 自動化された臨床診断システムおよび方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020148394A1 (en) 2020-07-23
JP2022517413A (ja) 2022-03-08
EP3911959A1 (en) 2021-11-24
BR112021014045A2 (pt) 2021-09-21
EP3911959B1 (en) 2024-07-03
CN113302499A (zh) 2021-08-24
US20210333290A1 (en) 2021-10-28
JP7438224B2 (ja) 2024-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11953507B2 (en) Quantitation of insulin-like growth factor-I and insulin-like growth factor-II with high-resolution mass spectrometry
US20220349897A1 (en) Amyloid beta detection by mass spectrometry
JP2024113021A (ja) 無傷のタンパク質レベルでのＬＣ－ＭＳに基づくＨｂＡ１ｃ測定の自動化試料ワークフロー
CN110073210B (zh) 用于在分析系统中的过程期间追踪样本标识的方法
US20210333290A1 (en) High speed sample workflow for lc-ms based hba1c measurement
EP3557605A1 (en) Kisspeptin-54 detection by tandem mass spectrometry
US20230251277A1 (en) Method for determining the level of vitamin d and metabolites thereof
US20230273217A1 (en) Derivatization of at least one analyte of interest for mass spec measurements in patient samples
WO2023089533A1 (en) Tandem triple quadrupole mass spectrometer-based screening and confirmation method for analyzing protein and its variants