BR112021014045A2 - Método para determinar hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra, kit, uso do kit, sistemas de diagnóstico para determinar hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra e uso do sistema de diagnóstico - Google Patents
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Abstract
método para determinar hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra, kit, uso do kit, sistemas de diagnóstico para determinar hemoglobina a glicada (hba1c) em uma amostra e uso do sistema de diagnóstico. a presente invenção refere-se a um método para determinar fragmentos de peptídeo de moléculas de hemoglobina a glicada (hba1c) por espectrometria de massa (ms), um kit de reagentes e um sistema de diagnóstico clínico adaptado para realizar o método.
Description
“MÉTODO PARA DETERMINAR HEMOGLOBINA A GLICADA (HBA1C) EM UMA AMOSTRA, KIT, USO DO KIT, SISTEMAS DE DIAGNÓSTICO PARA DETERMINAR HEMOGLOBINA A GLICADA (HBA1C) EM UMA AMOSTRA E USO DO SISTEMA DE DIAGNÓSTICO”
[0001] A presente invenção refere-se a um método para determinar fragmentos de peptídeo de moléculas de hemoglobina A glicada (HbA1c) por espectrometria de massa (MS), um kit de reagentes e um sistema de diagnóstico clínico adaptado para realizar o método.
[0002] O controle deficiente dos níveis circulantes de glicose no sangue é um indicador de diabetes. A glicose no sangue pode se ligar em um processo estatístico não enzimático aos resíduos de lisina de polipeptídeos, levando assim a polipeptídeos glicados. No caso da hemoglobina A (HbA), ocorre uma reação entre a glicose e o N-terminal da cadeia β. A cadeia β da hemoglobina A glicada resultante foi designada como HbA1c.
[0003] HbA1c é a principal espécie de hemoglobina glicada no sangue humano. O abrangente Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) forneceu evidências de que complicações, tais como retinopatia, nefropatia e neuropatia estão diretamente relacionadas ao grau de hiperglicemia em pacientes com diabetes insulinodependente (IDDM) e mostrou que a medição de HbA1c no sangue é uma excelente ferramenta para monitoramento a longo prazo do estado glicêmico de pacientes com diabetes (Nathan et al., N. Engl. J. Med 329 (1993) 977-986; Santiago, JV, Diabetes 42 (1993) 1549-1554; Benjamin, J. e Sacks, DB, Clin. Chem. 40 (1994) 683-687; e Goldstein D. et al., Clin. Chem 40 (1994) 1637-1640). O estudo DCCT também demonstrou claramente a necessidade de medição confiável e reprodutível de HbA1c e HbA0 – a hemoglobina não glicada, respectivamente.
[0004] Existem vários métodos diferentes para determinar a hemoglobina glicada, nomeadamente métodos físico-químicos, incluindo cromatografia e/ou espectrometria de massa (MS), métodos químicos e métodos imunológicos. Um método de referência para a medição de HbA1c no sangue humano que foi aprovado pela Federação Internacional de Química Clínica e Medicina Laboratorial (IFCC) compreende a clivagem enzimática da hemoglobina em peptídeos pela enzima endoproteinase Glu-C por um período de 18-20 h e, subsequentemente, separar e quantificar hexapeptídeos N- terminais glicados e não glicados da cadeia β por HPLC e espectrometria de massa de ionização por electrospray ou em uma abordagem bidimensional usando HPLC e eletroforese capilar com detecção de UV (Jeppsson et al., Clin.
Chem. Lab. Med. 40 (2002), 78-89).
[0005] As modificações deste método de referência foram descritas por Kaiser et al. (Clin. Chem. 54 (2008), 1018-1022; Li et al., J.
Chromatogr. B. 776 (2002), 149-160; Jeong (Mass Spectrom. Lett. 5 (2014), 52-56; e Zhang et al., Clin. Chem. Lab Med. 54 (2016), 569-576), todos referindo-se a uma digestão proteolítica por um período de tempo de pelo menos 18 h.
[0006] Assim, os métodos conhecidos que envolvem a digestão enzimática da hemoglobina A geralmente requerem uma incubação durante a noite a fim de obter uma quantidade suficiente de produtos de clivagem e, portanto, sinais de medição estáveis. Além disso, uma separação de misturas de peptídeos complexos, incluindo componentes de matriz com cromatografia convencional, é necessária antes de submeter a amostra à detecção de MS.
Esses métodos são, portanto, demorados e de uso limitado para medições de alto rendimento de amostras de pacientes.
[0007] Assim, há uma necessidade de fornecer um método rápido e confiável para determinar HbA1c por MS.
[0008] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para determinar a hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra, compreendendo: (a) fornecer uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A (HbA), (b) submeter a amostra da etapa (a) a uma etapa de digestão proteolítica parcial em que fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A são gerados, (c) enriquecer opcionalmente os fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A geradas na etapa (b), e (d) submeter a amostra compreendendo fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A a uma análise por espectrometria de massa (MS) em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada.
[0009] Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um kit, compreendendo: (i) uma enzima para a digestão proteolítica parcial de moléculas da cadeia β de HbA e, opcionalmente, um tampão de digestão para a referida enzima, (ii) um meio de interrupção, que é capaz de interromper uma digestão proteolítica com a enzima de (i), e (iii) opcionalmente, um meio de enriquecimento para enriquecer as moléculas de HbA1c digeridas proteoliticamente, e (iv) opcionalmente, um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água para uso na eluição de componentes de amostra a partir do meio de enriquecimento de (iii).
[00010] O kit é particularmente adequado para uso em um método conforme descrito acima.
[00011] Em um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um sistema de diagnóstico que é adaptado para realizar o método descrito acima.
O sistema de diagnóstico deve ser usado principalmente em conjunto com o kit descrito acima.
[00012] A presente invenção permite a determinação rápida e confiável de moléculas de HbA1c glicadas digeridas proteoliticamente e, opcionalmente, moléculas de HbA0 não glicadas digeridas proteoliticamente em uma amostra por MS.
[00013] A palavra "compreender" e variações como "compreende" e "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou etapa ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou etapa ou grupo de inteiros ou etapas.
[00014] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um(a)" e "o(a)" incluem os respectivos termos também no plural, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário.
[00015] Porcentagens, concentrações, quantidades e outros dados numéricos podem ser expressos ou apresentados neste documento em um formato de "faixa". Deve ser entendido que tal formato de faixa é usado meramente por conveniência e brevidade e, portanto, deve ser interpretado de forma flexível para incluir não somente os valores numéricos explicitamente recitados como os limites da faixa, mas também para incluir todos os valores numéricos individuais ou subfaixas abrangidos dentro dessa faixa, como se cada valor numérico e subfaixa fosse explicitamente recitado. Como ilustração,
uma faixa numérico de "4% a 20%" deve ser interpretada para incluir não apenas os valores explicitamente recitados de 4% a 20%, mas para incluir também valores individuais e subfaixas dentro da faixa indicada. Assim, incluídos nesta faixa numérica estão valores individuais, tais como 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, (...),18, 19, 20% e subfaixas, tais como de 4-10%, 5-15%, 10-20%, etc.
Este mesmo princípio se aplica a faixas que recitam valores mínimos ou máximos. Além disso, tal interpretação deve ser aplicada independentemente da amplitude da faixa ou das características sendo descritas.
[00016] O termo "cerca de", quando usado em conexão com um valor numérico, pretende abranger valores numéricos dentro de uma faixa tendo um limite inferior que é 5% menor do que o valor numérico indicado e tendo um limite superior que é 5% maior do que o valor numérico indicado.
[00017] O termo “Espectrometria de Massa” (“Mass Spec” ou “MS”) refere-se a uma tecnologia analítica usada para identificar compostos por sua massa. A MS é um método de filtragem, detecção e medição de íons com base em sua razão massa-carga, ou "m/z". A tecnologia MS geralmente inclui (1) compostos ionizantes para formar compostos carregados; e (2) detectar o peso molecular dos compostos carregados e calcular uma razão massa-carga.
Os compostos podem ser ionizados e detectados por qualquer meio adequado.
Um "espectrômetro de massa" geralmente inclui um ionizador e um detector de íons. Em geral, uma ou mais moléculas de interesse são ionizadas e os íons são subsequentemente introduzidos em um instrumento espectrográfico de massa onde, devido a uma combinação de campos magnéticos e elétricos, os íons seguem um caminho no espaço que depende da massa ("m") e carga ("z"). O termo "ionização" ou "ionizar" refere-se ao processo de gerar um íon analito que tem uma carga elétrica líquida igual a uma ou mais unidades de elétrons. Os íons negativos são aqueles que têm uma carga líquida negativa de uma ou mais unidades de elétrons, enquanto os íons positivos são aqueles que têm uma carga líquida positiva de uma ou mais unidades de elétrons. O método MS pode ser realizado em "modo de íon negativo", no qual íons negativos são gerados e detectados, ou em "modo de íon positivo", no qual íons positivos são gerados e detectados.
[00018] "Espectrometria de massa em tandem" ou "MS/MS" envolve várias etapas de seleção e detecção de espectrometria de massa, em que a fragmentação do analito ocorre entre as etapas. Em um espectrômetro de massa em tandem, os íons são formados na fonte de íons e separados pela razão massa-carga no primeiro estágio da espectrometria de massa (MS1).
Íons de uma razão massa-carga particular (íons precursores ou íons parentais) são selecionados e íons de fragmento (ou íons filhos) são criados por dissociação induzida por colisão, reação íon-molécula e/ou fotodissociação. Os íons resultantes são então separados e detectados em um segundo estágio da espectrometria de massa (MS2).
[00019] A maioria dos fluxos de trabalho de amostra em MS inclui ainda a preparação de amostra e/ou etapas de enriquecimento, em que, por exemplo, o(s) analito(s) de interesse são separados da matriz, por exemplo, constituintes da amostra diferentes do analito, usando, por exemplo, cromatografia gasosa ou líquida. Normalmente, para a medição de espectrometria de massa, as três etapas a seguir são realizadas: (1.) uma amostra compreendendo um analito de interesse é ionizada, geralmente por formação de aduto com cátions, muitas vezes por protonação para cátions. As fontes de ionização incluem, mas não estão limitadas a, ionização por eletropulverização (ESI) e ionização química a pressão atmosférica (APCI); (2.) os íons são classificados e separados de acordo com sua massa e carga. A espectrometria de mobilidade iônica de forma de onda assimétrica de alto campo (FAIMS) pode ser usada como filtro de íons; e
(3.) os íons separados são então detectados, por exemplo, no monitoramento de reações múltiplas (MRM), e os resultados são exibidos em um gráfico.
[00020] O termo "ionização por eletropulverização" ou "ESI" refere-se a métodos em que uma solução é passada ao longo de um pequeno tubo capilar, ao final do qual é aplicado um alto potencial elétrico positivo ou negativo. Uma solução que chega ao fim do tubo é vaporizada (nebulizada) em um jato ou spray de gotículas muito pequenas de solução em vapor de solvente. Esta névoa de gotículas flui através de uma câmara de evaporação, que é ligeiramente aquecida para evitar a condensação e evaporar o solvente.
À medida que as gotículas ficam menores, a densidade de carga da superfície elétrica aumenta até o momento em que a repulsão natural entre cargas semelhantes faz com que íons e também moléculas neutras sejam liberados.
[00021] O termo "ionização química a pressão atmosférica" ou "APCI" refere-se a métodos de espectrometria de massa que são semelhantes a ESI; no entanto, APCI produz íons por reações íon-molécula que ocorrem dentro de um plasma a pressão atmosférica. O plasma é mantido por uma descarga elétrica entre o capilar de pulverização e um contra-eletrodo. Os íons são normalmente extraídos para o analisador de massa pelo uso de um conjunto de estágios de skimmer com bombeamento diferencial. Um contrafluxo de gás N2 seco e pré-aquecido pode ser usado para melhorar a remoção do solvente. A ionização de fase gasosa em APCI pode ser mais eficaz do que ESI para analisar entidades menos polares.
[00022] "Monitoramento de reações múltiplas" ou "MRM" é um modo de detecção para um instrumento MS no qual um íon precursor e um ou mais íons de fragmento são seletivamente detectados.
[00023] Uma vez que um espectrômetro de massa separa e detecta íons de massas ligeiramente diferentes, ele facilmente distingue diferentes isótopos de um determinado elemento. A espectrometria de massa é, portanto, um método importante para a determinação precisa da massa e caracterização de analitos, incluindo, mas não se limitando a, analitos de baixo peso molecular, peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Suas aplicações incluem a identificação de proteínas e suas modificações pós-traducionais, a elucidação de complexos protéicos, suas subunidades e interações funcionais, bem como a medição global de proteínas em proteômica. A sequenciação de novo de peptídeos ou proteínas por espectrometria de massa pode normalmente ser realizada sem conhecimento prévio da sequência de aminoácidos.
[00024] A determinação de espectrometria de massa pode ser combinada com métodos analíticos adicionais, incluindo métodos cromatográficos, tais como cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida (LC), particularmente HPLC, e/ou técnicas de separação baseadas em mobilidade iônica.
[00025] No contexto da presente divulgação, os termos "analito", "molécula de analito" ou "analito(s) de interesse" são usados indistintamente, referindo-se às espécies químicas a serem analisadas por meio de espectrometria de massa. As espécies químicas adequadas para serem analisadas por meio de espectrometria de massa, ou seja, analitos, podem ser qualquer tipo de molécula presente em um organismo vivo, incluindo, mas não limitadas a, ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, mRNA, miRNA, rRNA etc.), aminoácidos, peptídeos, proteínas (por exemplo, receptor de superfície celular, proteína citosólica etc.), metabólitos ou hormônios (por exemplo, testosterona, estrogênio, estradiol, etc.), ácidos graxos, lipídios, carboidratos, esteróides, cetosteroides, secosteroides (por exemplo, vitamina D), moléculas características de uma certa modificação de outra molécula (por exemplo, frações de açúcar ou resíduos de fosforila em proteínas, resíduos de metila no
DNA genômico) ou uma substância que foi internalizada pelo organismo (por exemplo, fármacos terapêuticos, fármacos de abuso, toxina, etc.) ou um metabólito de tal substância. Tal analito pode servir como um biomarcador. No contexto da presente invenção, o termo "biomarcador" refere-se a uma substância dentro de um sistema biológico que é usado como um indicador de um estado biológico do referido sistema.
[00026] Os analitos podem estar presentes em uma amostra de interesse, por exemplo, uma amostra biológica ou clínica. Os termos "amostra" ou "amostra de interesse" são usados indistintamente neste documento, referindo-se a uma parte ou pedaço de um tecido, órgão ou indivíduo, sendo normalmente menor do que tal tecido, órgão ou indivíduo, destinado a representar a totalidade do tecido, órgão ou indivíduo. Após a análise, uma amostra fornece informações sobre o estado do tecido ou o estado de saúde ou doença de um órgão ou indivíduo. Exemplos de amostras incluem, mas não estão limitados a, amostras de fluidos, tais como sangue, soro, plasma, fluido sinovial, fluido espinhal, urina, saliva e fluido linfático, ou amostras sólidas, tais como manchas de sangue secas e extratos de tecido. Outros exemplos de amostras são culturas de células ou culturas de tecidos.
[00027] No contexto da presente divulgação, a amostra pode ser derivada de um "indivíduo" ou "sujeito". Normalmente, o sujeito é um mamífero.
Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos).
[00028] Antes de ser analisada por espectrometria de massa, uma amostra pode ser pré-tratada de maneira específica para amostra e/ou analito. No contexto da presente divulgação, o termo "pré-tratamento" refere-se a quaisquer medidas necessárias para permitir a análise subsequente de um analito desejado por meio de espectrometria de massa. As medidas de pré- tratamento normalmente incluem, mas não estão limitadas a, eluição de amostras sólidas (por exemplo, eluição de manchas de sangue seco), a adição de um reagente hemolisante (HR) às amostras de sangue total e a adição de um reagente enzimático às amostras de urina. Também a adição de padrões internos (ISTD) é considerada como pré-tratamento da amostra.
[00029] O termo “reagente de hemólise” (HR) refere-se a reagentes que lisam as células presentes em uma amostra. No contexto desta invenção, os reagentes de hemólise referem-se, em particular, a reagentes que lisam as células presentes em uma amostra de sangue, incluindo, mas não se limitando a, eritrócitos presentes nas amostras de sangue total. Um reagente de hemólise bem conhecido é a água (H2O), por exemplo, água desionizada ou destilada. Outros exemplos de reagentes de hemólise incluem, mas não estão limitados a, líquidos com alta osmolaridade (por exemplo, uréia a 8M), líquidos iônicos e diferentes detergentes.
[00030] Normalmente, um padrão interno (ISTD) é uma quantidade conhecida de uma substância que exibe propriedades semelhantes às do analito de interesse quando submetida ao fluxo de trabalho de detecção por espectrometria de massa (ou seja, incluindo qualquer pré-tratamento, enriquecimento e etapa de detecção real). Embora o ISTD exiba propriedades semelhantes às do analito de interesse, ainda é claramente distinguível do analito de interesse. Exemplificado, durante a separação cromatográfica, tal como cromatografia gasosa ou líquida, o ISTD tem aproximadamente o mesmo tempo de retenção que o analito de interesse da amostra. Assim, tanto o analito quanto o ISTD entram no espectrômetro de massa ao mesmo tempo. O ISTD, no entanto, exibe uma massa molecular diferente do analito de interesse da amostra. Isso permite uma distinção espectrométrica de massa entre íons do ISTD e íons do analito por meio de suas diferentes razões massa/carga
(m/z). Ambos estão sujeitos à fragmentação e fornecem íons filhos. Esses íons filhos podem ser distinguidos por meio de suas razões m/z entre si e dos respectivos íons parentais. Consequentemente, uma determinação separada e quantificação dos sinais do ISTD e do analito podem ser realizadas. Uma vez que o ISTD foi adicionado em quantidades conhecidas, a intensidade do sinal do analito da amostra pode ser atribuída a uma quantidade quantitativa específica do analito. Assim, a adição de um ISTD permite uma comparação relativa da quantidade de analito detectado e permite a identificação e quantificação inequívoca do(s) analito(s) de interesse presente(s) na amostra quando o(s) analito(s) atinge(m) o espectrômetro de massa. Normalmente, mas não necessariamente, o ISTD é uma variante marcada isotopicamente (compreendendo, por exemplo, pelo menos um marcador 2H, 13C e/ou 15N etc.) do analito de interesse.
[00031] Além do pré-tratamento, a amostra também pode ser submetida a uma ou mais etapas de enriquecimento, em que a amostra é submetida a um ou mais "métodos de enriquecimento" ou "fluxos de trabalho de enriquecimento". Métodos de enriquecimento bem conhecidos incluem, mas não estão limitados a, precipitação química, o uso de uma fase sólida e métodos cromatográficos.
[00032] A precipitação química refere-se à adição de componentes químicos à amostra, o que faz com que certos constituintes da amostra participem. Exemplificado, um método de precipitação bem conhecido é a adição de acetonitrila à amostra.
[00033] As fases sólidas incluem, mas não estão limitadas a, cartuchos de extração de fase sólida (SPE) e esferas. O termo "esfera" refere- se a partículas esféricas não magnéticas, magnéticas ou paramagnéticas. As esferas podem ser revestidas de forma diferente para serem específicas para um analito de interesse. O revestimento pode ser diferente dependendo do uso pretendido, ou seja, da molécula de captura pretendida. É bem conhecido pelo técnico no assunto qual revestimento é adequado para qual analito. As esferas podem ser feitas de vários materiais diferentes. As esferas podem ter vários tamanhos e compreender uma superfície com ou sem poros.
[00034] O termo "cromatografia" refere-se a um processo no qual uma mistura química transportada por um líquido ou gás é separada em componentes como resultado da distribuição diferencial das entidades químicas conforme elas fluem ao redor ou sobre uma fase líquida ou sólida estacionária.
[00035] O termo "cromatografia líquida" ou "LC" refere-se a um processo de retardo seletivo de um ou mais componentes de uma solução de fluido à medida que o fluido se infiltra uniformemente através de uma coluna de uma substância finamente dividida, ou através de passagens capilares. O retardo resulta da distribuição dos componentes da mistura entre uma ou mais fases estacionárias e o fluido bruto, (ou seja, fase móvel), conforme este fluido se move em relação à(s) fase(s) estacionária(s). Métodos nos quais a fase estacionária é mais polar do que a fase móvel (por exemplo, tolueno como a fase móvel, sílica como a fase estacionária) são denominados cromatografia líquida de fase normal (NPLC), e métodos nos quais a fase estacionária é menos polar do que a fase móvel (por exemplo, mistura de água-metanol como a fase móvel e C18 (octadecilsilila) como a fase estacionária) são denominados cromatografia líquida de fase reversa (RPLC).
[00036] "Cromatografia líquida de alta eficiência" ou "HPLC" refere-se a um método de cromatografia líquida em que o grau de separação é aumentado forçando a fase móvel sob pressão através de uma fase estacionária, normalmente uma coluna densamente compactada. Normalmente, a coluna é preenchida com uma fase estacionária composta de partículas de formato irregular ou esférico, uma camada monolítica porosa ou uma membrana porosa. A HPLC é historicamente dividida em duas subclasses diferentes com base nas polaridades das fases móvel e estacionária, ou seja, NP-HPLC e RP-HPLC.
[00037] Micro LC refere-se a um método de HPLC usando uma coluna com um diâmetro de coluna interno estreito, normalmente abaixo de 1 mm, por exemplo, cerca de 0,5 mm. "Cromatografia líquida de ultra alta eficiência" ou "UHPLC" refere-se a um método de HPLC usando uma alta pressão de, por exemplo, 120 MPa (17,405 lbf/in2), ou cerca de 1200 atmosferas.
[00038] LC rápida se refere a um método LC usando uma coluna com um diâmetro interno conforme mencionado acima, com um comprimento curto <2 cm, por exemplo, 1 cm, aplicando uma taxa de fluxo, conforme mencionado acima, e com uma pressão, conforme mencionado acima (Micro LC, UHPLC). O protocolo curto de LC rápido inclui uma etapa de captura/lavagem/eluição usando uma única coluna analítica e realiza LC em um tempo muito curto de <1 min.
[00039] Outros modi LC bem conhecidos incluem cromatografia de interação hidrofílica (HIC), LC por exclusão de tamanho, LC de troca iônica e LC de afinidade.
[00040] A separação de LC pode ser LC de canal único ou LC de múltiplos canais, compreendendo uma pluralidade de canais de LC dispostos em paralelo. Em LC, os analitos podem ser separados de acordo com a sua polaridade ou valor log P, tamanho ou afinidade, como é geralmente conhecido pelo técnico no assunto.
[00041] No contexto da presente divulgação, o termo "primeiro processo de enriquecimento", "primeira etapa de enriquecimento" ou "primeiro fluxo de trabalho de enriquecimento" refere-se a um processo de enriquecimento que ocorre após o pré-tratamento da amostra e fornece uma amostra que compreende um analito enriquecido em relação à amostra inicial.
[00042] No contexto da presente divulgação, o termo "segundo processo de enriquecimento", "segunda etapa de enriquecimento" ou "segundo fluxo de trabalho de enriquecimento" refere-se a um processo de enriquecimento que ocorre após o pré-tratamento e o primeiro processo de enriquecimento da amostra e fornece uma amostra compreendendo um analito enriquecido em relação à amostra inicial e à amostra após o primeiro processo de enriquecimento.
[00043] O termo "cromatografia" refere-se a um processo no qual uma mistura química transportada por um líquido ou gás é separada em componentes como resultado da distribuição diferencial das entidades químicas conforme elas fluem ao redor ou sobre uma fase líquida ou sólida estacionária.
[00044] Um "kit" é qualquer artigo de manufatura (por exemplo, uma embalagem ou recipiente) compreendendo pelo menos um reagente, por exemplo, um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou uma sonda para detectar especificamente um analito da presente invenção. O kit é preferencialmente promovido, distribuído ou vendido como uma unidade para realizar o método da presente invenção. Normalmente, um kit pode compreender ainda meios de transporte sendo compartimentados para receber em confinamento fechado um ou mais meios de recipientes, tais como frascos, tubos e similares. Em particular, um recipiente pode compreender um dos elementos separados a serem usados no método do primeiro aspecto. Os kits podem compreender ainda um ou mais outros recipientes compreendendo outros materiais, incluindo, mas não se limitando a, tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso. Um rótulo pode estar presente no recipiente para indicar que a composição é usada para uma aplicação específica e também pode indicar instruções para uso in vivo ou in vitro. O kit também pode incluir um código de programa de computador fornecido em um meio de armazenamento de dados ou dispositivo, tal como um meio de armazenamento óptico (por exemplo, um CD) ou diretamente em um computador ou dispositivo de processamento de dados. Além disso, o kit pode compreender quantidades padrão para os biomarcadores, conforme descrito em outro lugar neste documento, para fins de calibração.
[00045] Uma “bula” é usada para referir-se às instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos de diagnóstico, que contêm informações sobre as indicações, uso, desempenho e/ou avisos relativos ao uso de tal produto de diagnóstico.
[00046] Um primeiro aspecto da presente invenção refere-se a um método para determinar a hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra, compreendendo: (a) fornecer uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A (HbA), (b) submeter a amostra da etapa (a) a uma etapa de digestão proteolítica parcial em que fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A são gerados, (c) enriquecer opcionalmente os fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A geradas na etapa (b), e (d) submeter a amostra compreendendo fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A a uma análise por espectrometria de massa (MS) em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada.
[00047] Desse modo, a quantidade ou concentração de HbA1c, em particular, a quantidade relativa de HbA1c, ou seja, a razão de moléculas de HbA1c glicadas para moléculas de HbA0 não glicadas ou para moléculas de
HbA no total, em uma amostra, pode ser determinada. O método é altamente preciso e dá um coeficiente de variação (CV) de 2,5% ou menos, particularmente de 2,0% ou menos, mais particularmente 1,5% ou menos, ao determinar repetidamente a quantidade de HbA1c, a razão de HbA1c/HbA ou a razão de HbA1c/HbA0 em uma determinada amostra.
[00048] De acordo com a etapa (a), é fornecida uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina. A amostra é, de preferência, uma amostra de sangue total hemolisado, particularmente uma amostra de sangue total humano hemolisado, por exemplo, derivado a partir de um sujeito cujo sangue precisa ser testado para a quantidade de hemoglobina glicosilada A. A hemólise é particularmente realizada através da diluição com água (H 2O), por exemplo, água desionizada ou destilada, em particular, em uma razão de amostra:água de cerca de 1:2 a cerca de 1:20, em particular cerca de 1:5 a cerca de 1:10, em particular cerca de 1:9 (v / v). A amostra pode ser hemolisada por um período de tempo inferior a cerca de 30 min, inferior a cerca de 10 min, inferior a cerca de 5 min ou mesmo inferior a cerca de 2 min. Em modalidades particulares, a amostra é hemolisada por um tempo de cerca de 10 a cerca de 60 segundos.
[00049] Em modalidades particulares, a hemólise é realizada misturando amostra e água, em particular, por vórtice da amostra e água. Em particular, a amostra e a água são misturadas, em particular, agitadas em vórtice, durante cerca de 1 a cerca de 60 s, em particular, durante cerca de 5 a cerca de 30 s, em particular, durante cerca de 10 s.
[00050] Durante a hemólise, a amostra pode ser mantida a uma temperatura de 20 °C a 30 °C, em particular, a 22-25 °C, em particular, à temperatura ambiente.
[00051] Em modalidades particulares, a hemólise da amostra é realizada misturando a amostra com água em uma razão de 1:9 por vórtice por
10 segundos à temperatura ambiente.
[00052] A etapa (b) do método da invenção compreende uma digestão proteolítica parcial de moléculas de HbA na amostra.
Surpreendentemente, foi descoberto que, ao submeter as moléculas de hemoglobina A presentes em uma amostra a uma digestão proteolítica parcial, a quantidade de produtos da digestão é suficiente para permitir uma determinação precisa de HbA1c na amostra. Assim, um método rápido e confiável para a determinação de HbA1c é fornecido. A digestão proteolítica parcial resulta em uma mistura compreendendo moléculas de HbA intactas e moléculas de HbA digeridas proteoliticamente, em particular, uma mistura de moléculas da cadeia ß de HbA1c intactas, moléculas da cadeia β de HbA0 intactas, moléculas da cadeia β de HbA1c digeridas proteoliticamente e moléculas da cadeia β de HbA0 digeridas proteoliticamente. Em modalidades preferidas, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) compreende uma digestão na qual cerca de 1% a cerca de 20%, particularmente cerca de 5% a 10% das moléculas da cadeia β de HbA presentes na amostra são digeridas com base na quantidade total de moléculas da cadeia β de HbA originalmente presentes na amostra.
[00053] A digestão proteolítica parcial na etapa (b) do método da invenção é realizada com uma enzima proteolítica sob condições nas quais ocorre a clivagem proteolítica de moléculas da cadeia β de HbA. De preferência, é selecionada uma enzima proteolítica que – com base na sua especificidade de clivagem – gera um fragmento N-terminal da molécula da cadeia β de hemoglobina A com um comprimento na faixa de 4 a 20 aminoácidos, particularmente na faixa de 5 a 15 aminoácidos. Mais preferencialmente, a enzima proteolítica cliva o N-terminal da molécula da cadeia β de HbA humana conforme mostrado na SEQ ID No: 1 após a posição de aminoácido 6, 8 ou 14.
[00054] Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é realizada usando uma endopeptidase, particularmente uma endopeptidase selecionada a partir do grupo que consiste em Glu-C, tripsina, pepsina e termolisina. Digestão proteolítica com Glu-C resulta em um fragmento N-terminal de 6 aminoácidos, a digestão proteolítica com tripsina resulta em um fragmento N-terminal de 8 aminoácidos e a digestão proteolítica com pepsina resulta em um fragmento N-terminal de 14 aminoácidos. Em uma modalidade particular, a digestão proteolítica é realizada com a endopeptidase Glu-C.
[00055] Em modalidades particulares da presente invenção, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é realizada por um período de cerca de 10 min a cerca de 120 min, por exemplo, por um período de tempo de cerca de 60 min ou menos, cerca de 45 min ou menos ou cerca de 30 min ou menos.
Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial é realizada durante cerca de 15 min a cerca de 45 min.
[00056] Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é realizada em uma faixa de temperatura de cerca de 20 °C a cerca de 40 °C, em particular de cerca de 25 °C a cerca de 37 °C, em particular de cerca de 30 °C a cerca de 37 °C. Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial é realizada a 37 °C.
[00057] Em modalidades, o tampão usado para a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é um tampão que não compreende íons Na + e/ou K+, em particular um tampão que compreende íons de amônio, tais como um tampão acetato de amônio ou citrato de amônio, por exemplo, compreendendo acetato de amônio de cerca de 20 mM a cerca de 50 mM, ou acetato de amônio de cerca de 30 mM.
[00058] Nas modalidades, o pH do tampão de digestão dependerá da enzima proteolítica específica. Em modalidades, em que Glu-C é usada como enzima proteolítica, o tampão de digestão tem um pH ácido, por exemplo, um pH de cerca de 4 a cerca de 5, em particular, um pH de cerca de 4,2 a cerca de 4,5, ou um pH de cerca de 4,3.
[00059] Em modalidades, a protease na etapa (b) está presente em qualquer concentração adequada a fim de obter o grau desejado de digestão parcial. Em modalidades, a enzima proteolítica, por exemplo, a endopeptidase Glu-C tem uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 1 mg/mL, em particular, de 0,3 mg/mL a 0,8 mg/mL, particularmente, de cerca de 0,6 mg/mL. Em modalidades particulares, em que Glu-C é usada como a enzima proteolítica, a concentração usada na digestão proteolítica parcial na etapa (b) é de cerca de 0,6 mg/mL.
[00060] Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é realizada usando a endopeptidase Glu-C por cerca de 45 min a uma temperatura de cerca de 37 °C.
[00061] Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é realizada usando a endopeptidase Glu-C a uma concentração de cerca de 0,6 mg/ml por cerca de 45 min a uma temperatura de cerca de 37 °C.
[00062] Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é realizada usando a endopeptidase Glu-C a uma concentração de cerca de 0,6 mg/ml em tampão acetato de amônio de 30 mM, por cerca de 45 min a uma temperatura de cerca de 37 °C.
[00063] Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é realizada usando a endopeptidase Glu-C a uma concentração de 0,6 mg/ml em tampão acetato de amônio de 30 mM a um pH de cerca de 4,3, por cerca de 45 min a uma temperatura de cerca de 37 °C.
[00064] Em modalidades particulares da invenção, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é interrompida após ter alcançado o grau desejado de clivagem proteolítica. Por exemplo, a digestão pode ser interrompida adicionando um meio de interrupção que seja capaz de interromper a digestão proteolítica. Em modalidades particulares, o agente de interrupção é um meio de diluição, por exemplo, uma solução ácida, em particular uma solução ácida compreendendo ácido fórmico (AF). Em modalidades, a referida solução ácida compreende AF em água. Em modalidades nas quais o AF é usado na solução ácida para interromper a digestão proteolítica parcial na etapa (b), o AF pode estar presente em uma concentração de 0,05% a 0,2% (v/v) de AF, em particular em uma concentração de cerca de 0,1% (v/v) de AF. Em modalidades, o ácido, em particular, o AF, ajusta o pH para cerca de 1 a cerca de 4. Em particular, o pH é ajustado para cerca de 2,7.
[00065] Em modalidades particulares, a digestão proteolítica parcial na etapa (b) é realizada usando a endopeptidase Glu-C a uma concentração de cerca de 0,6 mg/ml em tampão acetato de amônio de cerca de 30 mM a um pH de cerca de 4,3, por cerca de 45 min a uma temperatura de cerca de 37 °C, e é interrompida após o uso de um tampão de diluição compreendendo cerca de 0,1% (v/v) de AF em água para ajustar um pH de cerca de 2,7.
[00066] Em modalidades particulares, a amostra obtida após a digestão proteolítica parcial da etapa (b) pode ser ainda submetida a um fluxo de trabalho de enriquecimento de analito, ou seja, a etapa de enriquecimento (c) que compreende enriquecer fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente da cadeia β de hemoglobina A na amostra. O termo "enriquecimento" de fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente é entendido como o aumento da quantidade relativa de moléculas de fragmentos N-terminais em relação a outros constituintes da amostra antes de submeter a amostra à análise por MS. Em particular, a etapa de enriquecimento compreende um enriquecimento de fragmentos N-terminais da cadeia β de hemoglobina A, enquanto outros constituintes de amostra, potencialmente interferindo com a medição, são depletados ou removidos. Em modalidades particulares, os fragmentos N-terminais da cadeia β de hemoglobina A são enriquecidos por pelo menos um fator de cerca de 2, por pelo menos um fator de cerca de 5, ou por pelo menos um fator de cerca de 10.
[00067] A etapa de enriquecimento (c) pode incluir um ou mais métodos de enriquecimento, em particular uma primeira e/ou uma segunda etapa de enriquecimento. Os métodos de enriquecimento são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, métodos de enriquecimento químico, incluindo, mas não se limitando a, precipitação química, e métodos de enriquecimento usando fases sólidas, incluindo, mas não se limitando a, métodos por extração de fase sólida, fluxos de trabalho de esferas, e métodos cromatográficos (por exemplo, cromatografia gasosa ou líquida). Por conseguinte, em modalidades particulares, a etapa de enriquecimento (c) compreende um ou mais métodos de enriquecimento selecionados a partir do grupo que consiste em precipitação química, métodos que usam métodos por extração de fase sólida, fluxos de trabalho de esferas e métodos cromatográficos.
[00068] Nas modalidades, a etapa de enriquecimento (c) compreende um ou dois métodos de enriquecimento, ou seja, compreende a etapa de enriquecimento (c) (i) e/ou etapa de enriquecimento (c) (ii). Em modalidades, nas quais o método compreende a etapa de enriquecimento (c) (i) e a etapa de enriquecimento (c) (ii), a etapa de enriquecimento (c) (i) é realizada antes da etapa de enriquecimento (c) (ii).
[00069] Em modalidades, uma primeira etapa de enriquecimento (c) (i) compreende uma etapa de separação ligada/livre que compreende a adição de uma fase sólida carregando grupos seletivos de analito à amostra pré-tratada. A fase sólida pode ser composta por partículas sólidas ou por uma fase sólida não particular, por exemplo, uma superfície revestida dentro de um recipiente ou poço. Em modalidades particulares, a fase sólida é composta por partículas magnéticas ou paramagnéticas, em particular partículas com um núcleo magnético ou paramagnético. Em modalidades, o referido núcleo magnético ou paramagnético compreende um óxido de metal e/ou um carboneto de metal. Em uma modalidade especialmente particular, o núcleo compreende Fe3O4.
[00070] A superfície da fase sólida, em particular, as esferas magnéticas ou paramagnéticas, pode ser uma superfície hidrofóbica, em particular, compreendendo grupos orgânicos hidrofóbicos, tais como grupos C3- C18 alquila, mais particularmente grupos C4 alquila. Além disso, a superfície hidrofóbica da fase sólida, em particular, a superfície das esferas magnéticas ou superparamagnéticas, compreende poros. O tamanho do poro pode estar na faixa de 1 nm a 200 nm, em particular, menos do que cerca de 100 nm, em particular, menos do que cerca de 10 nm. Superfícies hidrofóbicas adequadas podem ser encontradas, por exemplo, em "The HPLC Expert: Possibilities and Limitations of Modern High Performance Liquid Chromatography” DOI:10.1002/9783527677610.
[00071] Em modalidades, a etapa de enriquecimento (c) compreende uma primeira etapa de enriquecimento (c) (i), usando esferas magnéticas ou paramagnéticas. Em modalidades, uma primeira etapa de enriquecimento (c) (i) compreende a adição de esferas magnéticas ou paramagnéticas carregando grupos para a ligação seletiva de fragmentos N- terminais gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A presentes na amostra. Em modalidades, a adição das esferas magnéticas compreende agitação ou mistura. Segue-se um período de incubação predefinido para capturar os fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A na esfera. Em modalidades, o fluxo de trabalho compreende uma etapa de lavagem (W1) após a incubação com as esferas magnéticas. Dependendo do(s) analito(s), uma ou mais etapas de lavagem adicionais (W2) são realizadas. Uma etapa de lavagem (W1, W2) compreende uma série de etapas incluindo separação de esfera magnética por uma unidade de manipulação de esfera magnética compreendendo ímãs ou eletroímãs, aspiração de líquido, adição de um tampão de lavagem, ressuspensão das esferas magnéticas, outra etapa de separação de esfera magnética e outra aspiração do líquido. Além disso, as etapas de lavagem podem diferir em termos do tipo de solvente (água/orgânico/sal/pH), além do volume e número ou combinação de ciclos de lavagem. É bem conhecido pelo técnico no assunto como escolher os respectivos parâmetros. A última das etapas de lavagem (W1, W2) é seguida pela adição de um reagente de eluição seguido pela ressuspensão das esferas magnéticas e um período de incubação predefinido para liberar o(s) analito(s) de interesse das esferas magnéticas. As esferas magnéticas livres de ligação são então separadas e o sobrenadante contendo fragmentos N-terminais da cadeia β de hemoglobina A é capturado.
[00072] Em modalidades, o contato da amostra compreendendo fragmentos N-terminais da cadeia β de hemoglobina A com a fase sólida ocorre, de preferência, em um pH ácido, por exemplo, em um pH de cerca de 1 a cerca de 4, particularmente em um pH de cerca de 2,7. Para este propósito, uma amostra, por exemplo, uma amostra de sangue total hemolisado, pode ser diluída após digestão proteolítica parcial com um meio ácido, por exemplo, ácido fórmico conforme descrito acima em uma concentração de cerca de 0,01% a cerca de 0,2% (v/v), por exemplo cerca de 0,1% (v/v), para obter o pH desejado.
[00073] A eluição seletiva de fragmentos N-terminais ligados gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A da fase sólida pode ser realizada pelo contato da fase sólida carregada com um meio de eluição, que pode ser uma solução aquosa compreendendo um solvente orgânico miscível em água, em acetonitrila particular, ou metanol, em uma quantidade de cerca de 5 a cerca de 20% (v/v), por exemplo, cerca de 10% (v/v). O meio de eluição é, de preferência, um meio ácido, em particular compreendendo ácido fórmico. A porção aquosa do meio de eluição pode ser substancialmente a mesma que a descrita para o meio de ligação da fase sólida, por exemplo, um meio ácido com um pH de cerca de 1 a cerca de 4, por exemplo, um pH de cerca de 2,7.
[00074] Alternativamente ou adicionalmente, a etapa de enriquecimento (c) pode compreender uma segunda etapa de enriquecimento (c) (ii). Na segunda etapa de enriquecimento (c) (ii), os fragmentos N-terminais da cadeia β de hemoglobina A são ainda enriquecidos na amostra. Em modalidades particulares, a etapa de enriquecimento (c) (ii) compreende uma etapa cromatográfica, na qual os constituintes individuais da amostra são separados uns dos outros. Nas modalidades, a segunda etapa de enriquecimento (c) (ii) pode ser realizada posteriormente à digestão proteolítica parcial da etapa (b), conforme descrito em detalhes acima, ou pode ser realizada após a primeira etapa de enriquecimento (c) (i), como descrito em detalhes acima.
[00075] Na segunda etapa de enriquecimento (c) (ii), a separação cromatográfica é usada para enriquecer ainda mais o analito de interesse na amostra. Em modalidades, a separação cromatográfica é cromatografia gasosa ou líquida. Ambos os métodos são bem conhecidos pelo técnico no assunto.
Nas modalidades, a cromatografia líquida é selecionada a partir do grupo que consiste em HPLC, LC rápida, micro-LC, injeção em fluxo e captura e eluição. Em modalidades particulares, a separação cromatográfica compreende o uso de uma única coluna cromática ou o uso de duas ou mais colunas cromáticas.
Em modalidades particulares, nas quais duas ou mais colunas cromáticas são usadas, as colunas são posicionadas a jusante uma da outra, ou seja, uma segunda coluna é posicionada a jusante de uma primeira coluna, e uma terceira coluna opcional é posicionada a jusante da segunda coluna, etc. Em modalidades nas quais duas ou mais colunas são usadas, essas colunas podem ser idênticas ou podem diferir umas das outras, dependendo da função desejada. É bem conhecido pelo técnico no assunto escolher as colunas corretas e configurá-las.
[00076] Nas modalidades, a amostra obtida após a etapa de digestão proteolítica (b) ou a primeira etapa de enriquecimento (c) (i) é transferida para uma estação de LC ou é transferida para a estação de LC após uma etapa de diluição pela adição de um líquido de diluição. Também podem ser usados diferentes procedimentos/reagentes de eluição, alterando, por exemplo, o tipo de solvente (água/orgânico/sal/pH) e o volume. Os vários parâmetros são bem conhecidos pelo técnico no assunto e facilmente escolhidos.
[00077] Em modalidades particulares, a etapa de enriquecimento (c) compreende uma primeira etapa de enriquecimento (c) (i) e uma segunda etapa de enriquecimento (c) (ii), em particular, em que a segunda etapa de enriquecimento (c) (ii) é realizada subsequentemente à primeira etapa de enriquecimento (c) (i). Em modalidades particulares, a primeira etapa de enriquecimento (c) (i) compreende fluxo de trabalho de esferas, como descrito em detalhes acima, e a segunda etapa de enriquecimento (c) (ii) compreende cromatografia líquida, em particular, selecionada a partir do grupo que consiste em HPLC, LC rápida, micro-LC, injeção de fluxo e/ou captura e eluição.
[00078] De acordo com a presente invenção, a etapa (d) do método da presente invenção compreende uma análise de fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A, que foram geradas por digestão parcial com uma protease, tal como pepsina, tripsina ou Glu-C, e que foram separadas das moléculas da cadeia β de hemoglobina A intactas não digeridas antes da análise por MS.
[00079] A análise de acordo com a etapa (d) é realizada por MS.
De preferência, o procedimento da análise por MS compreende uma análise em tandem por MS (MS/MS), particularmente uma análise por MS/MS (Q) triplo quadrupolo.
[00080] Em modalidades, a etapa de análise por espectrometria de massa (d) compreende: (i) submeter um íon dos fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A a um primeiro estágio de análise por espectrometria de massa, em que o íon parental dos fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A é caracterizado de acordo com sua razão massa/carga (m/z), (ii) causar fragmentação do íon parental, em que o íon filho dos fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente das moléculas da cadeia β de hemoglobina A difere em sua razão m/z do íon parental dos fragmentos N- terminais gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A, e (iii) submeter o íon filho a um segundo estágio de análise por espectrometria de massa, em que o íon filho é caracterizado de acordo com sua razão m/z.
[00081] O método da invenção compreende uma determinação quantitativa de HbA1c na amostra. Em particular, é determinada a quantidade relativa de moléculas de HbA1c glicadas para moléculas de HbA0 não glicadas ou para moléculas de HbA no total. Em uma modalidade especialmente preferida, esta quantidade relativa é determinada com um coeficiente de variação (CV) de 2,5% ou menos, particularmente de 2,0% ou menos, mais particularmente de 1,5% ou menos.
[00082] Em uma modalidade especialmente preferida, o método da invenção compreende um fluxo de trabalho como segue: (a) hemolisar uma amostra de sangue total, por exemplo, por diluição com H2O, (b) submeter a amostra da etapa (a) a uma digestão proteolítica parcial com a endoproteinase Glu-C, em que fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A são gerados, e interromper a digestão por adição de ácido diluído, por exemplo, ácido fórmico, (c) enriquecer os fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A geradas na etapa (b) pelo contato da amostra com uma fase sólida, particularmente composta por partículas magnéticas ou paramagnéticas, em particular tendo uma superfície hidrofobicamente modificada, sob condições em que os fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A se ligam à fase sólida, e eluir seletivamente os fragmentos ligados da fase sólida carregada, e (d) submeter a amostra da etapa (c) compreendendo fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A a uma análise por MS, em particular espectrometria de massa em tandem (MS/MS), em particular MS em tandem triplo quadrupolo, em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada.
[00083] Em outras modalidades do primeiro aspecto, o método de determinação da hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra compreende a etapa adicional de adicionar um padrão interno (ISTD) à amostra. Nas modalidades, o padrão interno é adicionado à amostra antes ou depois da etapa de digestão proteolítica parcial (b). No caso do padrão interno ser adicionado antes da etapa de digestão proteolítica parcial (b), o padrão interno é, de preferência, uma molécula de hemoglobina intacta marcada isotopicamente. No caso do padrão interno ser adicionado após a etapa de digestão proteolítica parcial (b), o padrão interno é preferencialmente um peptídeo de HbA1c marcado isotopicamente. Em modalidades, o ISTD marcado isotopicamente compreende pelo menos um marcador 2H, 13C e/ou 15N.
[00084] Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a um kit, particularmente adequado para realizar o método descrito acima, compreendendo: (i) uma enzima para a digestão proteolítica parcial de moléculas da cadeia β de HbA e, opcionalmente, um tampão de digestão para a referida enzima, (ii) um meio de interrupção, que é capaz de interromper uma digestão proteolítica com a enzima de (i), e (iii) opcionalmente, um meio de enriquecimento para enriquecer as moléculas de HbA1c digeridas proteoliticamente, e (iv) opcionalmente, um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água para uso na eluição de componentes de amostra a partir do meio de enriquecimento de (iii).
[00085] No que diz respeito a modalidades particulares do segundo aspecto da presente invenção, é feita referência a todas as modalidades descritas acima em detalhes no contexto do primeiro aspecto.
[00086] Em modalidades do segundo aspecto da presente invenção, a enzima incluída no kit é selecionada a partir do grupo que consiste em Glu-C, tripsina e pepsina. Em modalidades particulares, a enzima compreendida é Glu-C.
[00087] Em modalidades do segundo aspecto, a enzima, em particular Glu-C, está compreendida em um tampão que não compreende íons Na+ e/ou K+, em particular em um tampão que compreende íons de amônio, tal como um tampão acetato de amônio ou citrato de amônio. Em modalidades particulares, Glu-C é compreendida em um tampão compreendendo cerca de 20 mM a cerca de 50 mM de acetato de amônio, ou cerca de 30 mM de acetato de amônio.
[00088] Nas modalidades, o pH do tampão de digestão dependerá da enzima proteolítica específica. Em modalidades, nas quais Glu-C está incluída no kit, o tampão de digestão tem um pH ácido, em particular um pH de cerca de 4 a cerca de 5, em particular um pH de cerca de 4,2 a cerca de 4,5, particularmente um pH de cerca de 4,3.
[00089] Em modalidades, a enzima, em particular a Glu-C, está presente em qualquer concentração adequada a fim de obter o grau desejado de digestão proteolítica parcial. Nas modalidades, a enzima proteolítica, em particular a Glu-C, compreendida no kit, tem uma concentração de cerca de 1 a cerca de 5 mg/mL, em particular de 2 mg/mL a 3 mg/mL, particularmente de cerca de 2 mg/mL. Em modalidades particulares, nas quais Glu-C é usada como a enzima proteolítica, a concentração compreendida no kit é de cerca de 2 mg/mL.
[00090] Em modalidades, o kit compreende ainda um meio de interrupção, por exemplo, um meio de diluição, que é capaz de interromper a digestão proteolítica. Nas modalidades, o meio de diluição é uma solução ácida que compreende ácido fórmico (AF). Em modalidades, a referida solução ácida compreende AF em água. Em modalidades, o meio de diluição compreende uma concentração de 0,05% a 0,2% (v/v), em particular, uma concentração de cerca de 0,1% (v/v) de AF em água. Em modalidades, o ácido está presente em uma quantidade para ajustar o pH de uma amostra a ser analisada a um pH de cerca de 1 a cerca de 4, em particular o pH é ajustado para cerca de 2,7.
[00091] Em modalidades, o kit compreende um meio de enriquecimento adaptado para realizar pelo menos uma etapa de enriquecimento, em particular uma etapa de separação ligada/livre e/ou uma etapa cromatográfica. Em modalidades, o meio de enriquecimento compreende uma fase sólida que pode ser composta por partículas sólidas, por exemplo, partículas magnéticas ou paramagnéticas, ou de uma fase sólida não específica.
[00092] Em modalidades particulares, a fase sólida carrega grupos para a ligação seletiva de fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A, por exemplo, grupos orgânicos hidrofóbicos. Em outras modalidades particulares, o meio de enriquecimento pode compreender uma coluna cromatográfica, em particular, uma coluna cromatográfica para realizar uma etapa cromatográfica.
[00093] Em modalidades, o meio de eluição opcionalmente compreendido no kit compreende uma solução aquosa compreendendo um solvente orgânico miscível em água, em particular acetonitrila (ACN). O solvente orgânico miscível em água, em particular, a ACN, está presente em uma quantidade de cerca de 5 a cerca de 20%, por exemplo, de cerca de 10% (v/v).
[00094] O kit pode ser fornecido como um pacote único compreendendo recipientes dos componentes individuais ou como um conjunto de vários pacotes, cada um compreendendo um recipiente dos componentes individuais.
[00095] Em modalidades, o kit compreende ainda uma bula. Nas modalidades, a bula compreende informações sobre as indicações, uso, desempenho e/ou avisos relativos ao kit.
[00096] Um terceiro aspecto da presente invenção é um sistema de diagnóstico adaptado para determinar HbA1c glicada em uma amostra; em particular, realizando o método conforme descrito acima.
[00097] Em modalidades particulares, o sistema de diagnóstico compreende: (i) pelo menos uma estação para a preparação de amostras compreendendo fragmentos N-terminais de moléculas de HbA1c, em que a preparação compreende uma digestão proteolítica parcial de moléculas de hemoglobina A (HbA); (ii) opcionalmente, pelo menos uma estação de enriquecimento adaptada para enriquecer seletivamente fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A da amostra, e (iii) pelo menos uma estação adaptada para a análise de fragmentos N-terminais de moléculas de hemoglobina A por espectrometria de massa (MS) e para determinar a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra.
[00098] No que diz respeito a modalidades particulares do terceiro aspecto da presente invenção, é feita referência a todas as modalidades descritas acima em detalhes no contexto com o primeiro e segundo aspectos.
[00099] Em modalidades particulares, o sistema de diagnóstico é adaptado para permitir um alto rendimento de amostras, em particular, para permitir um rendimento de até 100 amostras/hora ou mais. Por exemplo, um sistema, como descrito em WO 2017/103180, incorporado neste documento por referência, pode ser usado.
[000100] Em modalidades particulares, o sistema de diagnóstico compreende pelo menos uma estação para preparação de amostras de acesso aleatório e pelo menos uma estação para o enriquecimento dos fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia ß de hemoglobina A antes da análise por MS.
[000101] Em modalidades, tal sistema de diagnóstico compreende uma estação de preparação de amostras para a preparação automatizada de amostras compreendendo fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia ß de hemoglobina A. Em modalidades particulares, a referida estação compreende uma seção para hemolisar uma ou mais amostras e uma seção para fornecer uma digestão proteolítica parcial de moléculas de HbA em uma ou mais amostras.
[000102] Em modalidades, o referido sistema de diagnóstico compreende ainda uma estação de enriquecimento. A referida estação de enriquecimento compreende uma seção para o contato de uma ou mais amostras após digestão proteolítica parcial com o meio de enriquecimento, em particular, com uma fase sólida, em particular, partículas magnéticas ou paramagnéticas. Adicionalmente ou alternativamente, a estação de enriquecimento compreende uma seção cromatográfica, em particular, uma seção de LC. Em modalidades, a seção de LC compreende um ou mais canais de LC. Em modalidades, nas quais a seção de LC compreende mais de um canal de LC, os canais podem ser dispostos em paralelo.
[000103] Em modalidades, o sistema de diagnóstico compreende pelo menos uma interface entre as diferentes seções e estações para inserir as amostras previamente preparadas na seção ou estação subsequente.
[000104] Em modalidades, o sistema de diagnóstico compreende ainda um controlador que pode ser programado para atribuir amostras para preparação de amostras predefinidas e fluxos de trabalho de enriquecimento, cada um compreendendo uma sequência predefinida de etapas de preparação e enriquecimento de amostras e requer um tempo predefinido para conclusão.
[000105] Em modalidades particulares, o controlador planeja uma sequência de entrada do canal de estação de enriquecimento para inserir as amostras preparadas que permite que fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia ß de HbA de diferentes canais de estação de enriquecimento eluam em uma sequência de saída de eluato não sobreposta com base nos tempos de eluição esperados.
[000106] Em modalidades, o controlador define e inicia uma sequência de início de preparação de amostras que gera uma sequência de saída de amostras preparadas fora da estação de preparação de amostras que corresponde à sequência de entrada do canal da estação de enriquecimento de modo que, quando a preparação de uma amostra for concluída, o canal da estação de enriquecimento atribuído também esteja disponível e a amostra preparada possa ser inserida no canal da estação de enriquecimento atribuído, antes que a preparação de outra amostra seja concluída ou antes que a próxima amostra preparada chegue à interface de preparação/enriquecimento de amostras.
[000107] Em modalidades, o controlador define um período de referência para o tempo apropriado de fluxos de trabalho. Isso torna possível coordenar as seguintes etapas de processamento: (1) iniciar a preparação de no máximo uma amostra por período de referência com possível um ou mais períodos de referência entre amostras consecutivas na sequência de início de preparação da amostras; e/ou (2) preparação completa de no máximo uma amostra por período de referência com possível um ou mais períodos de referência entre amostras preparadas consecutivas da sequência de saída da amostra preparada; e/ou (3) inserir uma amostra preparada por período de referência em um dos canais da estação de enriquecimento com possível um ou mais períodos de referência entre entradas consecutivas do canal da estação de enriquecimento; e/ou (4) emitir um eluato de estação de enriquecimento por período de referência com possível um ou mais períodos de referência entre eluatos de estação de enriquecimento consecutivos.
[000108] Em particular, a presente invenção refere-se aos seguintes itens:
1. Método para determinar hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A (HbA), (b) submeter a amostra da etapa (a) a uma etapa de digestão proteolítica parcial, em que fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A são gerados, (c) enriquecer opcionalmente os fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A geradas na etapa (b), e (d) submeter a amostra compreendendo fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A a uma análise por espectrometria de massa (MS) em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada;
2. Método, de acordo com o item 1, caracterizado pela amostra na etapa (a) ser uma amostra de sangue total hemolisado, particularmente uma amostra de sangue total humano hemolisado;
3. Método, de acordo com o item 1 ou 2, caracterizado pela amostra na etapa (a) ser hemolisada usando água (H2O), por exemplo, em uma razão de amostra:água de cerca de 1,2 a cerca de 1:20, tal como em uma razão de cerca de 1:5, cerca de 1:10 ou cerca de 1:9 (v/v);
4. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 3, caracterizado pela amostra ser hemolisada por um período de tempo inferior a 30 min, inferior a cerca de 10 min ou inferior a cerca de 5 min, em particular por um período de tempo de cerca de 10 a cerca 60 seg;
5. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4, caracterizado por, na etapa de digestão proteolítica parcial (b), cerca de 1% a cerca de 20%, particularmente cerca de 5% a 10% das moléculas da cadeia β de HbA presentes na amostra serem digeridas com base na quantidade total de moléculas da cadeia β de HbA originalmente presentes na amostra;
6. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5, caracterizado pela digestão proteolítica parcial na etapa (b) ser realizada com uma enzima proteolítica que gera um fragmento N-terminal da molécula da cadeia β de hemoglobina A tendo um comprimento na faixa de 4 a 20 aminoácidos, particularmente na faixa de 5 a 15 aminoácidos, e mais particularmente em que a enzima proteolítica cliva uma molécula da cadeia β de hemoglobina A após a posição de aminoácido 6, 8 ou 14 de acordo com a SEQ ID NO: 1;
7. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6, caracterizado pela digestão proteolítica parcial na etapa (b) ser realizada com uma endopeptidase, particularmente com uma endopeptidase selecionada a partir do grupo que consiste em Glu-C, tripsina, pepsina e termolisina;
8. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 7, caracterizado pela digestão proteolítica parcial na etapa (b) ser realizada por um período de tempo inferior a cerca de 60 min, em particular inferior a cerca de 45 min, ou inferior a 30 min;
9. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 8, caracterizado pela digestão proteolítica parcial na etapa (b) ser realizada em uma faixa de temperatura de cerca de 20 °C a cerca de 40 °C ou de cerca de 25 °C a cerca de 37 °C;
10. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 9, caracterizado pelo tampão de digestão na etapa (b) ser um tampão que compreende íons de amônio, tal como um tampão acetato de amônio ou citrato de amônio, por exemplo, compreendendo cerca de 20 a cerca de 50 mM de acetato de amônio, particularmente cerca 30 mM de acetato de amônio;
11. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a10, caracterizado pelo tampão de digestão ter um pH de cerca de 4 a cerca de 5,
particularmente um pH de cerca de 4,3;
12. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 11, caracterizado pela enzima proteolítica na etapa (b) estar presente em uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 1 mg/mL, particularmente de cerca de 0,6 mg/mL;
13. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 12, caracterizado pela digestão proteolítica parcial na etapa (b) ser interrompida, em particular pela adição de um meio ácido, tal como ácido fórmico (AF), particularmente cerca de 0,1% (v/v) de AF em água;
14. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 13, caracterizado pela digestão proteolítica na etapa (b) ser realizada com a endopeptidase Glu-C, particularmente em uma concentração de cerca de 0,6 mg/mL por um período de tempo de cerca de 15 min a cerca de 45 min a uma temperatura de cerca de 37 °C, em um tampão compreendendo íons amônio, e a digestão é interrompida pela adição de ácido fórmico em água, particularmente 0,1% (v/v) de AF em água;
15. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 14, caracterizado pela etapa de enriquecimento (c) compreender uma etapa de separação ligada/livre (c) (i) compreendendo colocar a amostra em contato com uma fase sólida tendo uma superfície para a ligação seletiva de fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A sob condições nas quais os fragmentos N-terminais gerados proteoliticamente de moléculas da cadeia β de hemoglobina A se ligam à fase sólida e eluem seletivamente os fragmentos ligados da fase sólida;
16. Método, de acordo com o item 15, caracterizado pela fase sólida compreender uma superfície hidrofóbica;
17. Método, de acordo com o item 15 ou 16, caracterizado por, na etapa (c) (i), a amostra ser colocada em contato com a fase sólida a um pH ácido, particularmente a um pH de cerca de 1 a cerca de 3, por exemplo, a um pH de cerca de 2;
18. Método, de acordo com qualquer um dos itens 15 a 17, caracterizado pela fase sólida ser composta por partículas, por exemplo, partículas magnéticas ou paramagnéticas, por exemplo, partículas tendo um núcleo magnético ou paramagnético compreendendo um óxido metálico e/ou carboneto metálico, em particular Fe3O4;
19. Método, de acordo com qualquer um dos itens 15 a 18, caracterizado pela superfície hidrofóbica da fase sólida compreender grupos C3-C18 alquila, particularmente grupos C4 alquila;
20. Método, de acordo com qualquer um dos itens 15 a 19, caracterizado pela superfície hidrofóbica da fase sólida compreender poros com um tamanho de poro inferior a cerca de 100 nm, em particular inferior a cerca de 10 nm;
21. Método, de acordo com qualquer um dos itens 15 a 20, caracterizado pelos fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A serem enriquecidos por eluição seletiva da fase sólida, particularmente na presença de cerca de 5 a 20% (v/v) de acetonitrila, mais particularmente na presença de cerca de 10% (v/v) de acetonitrila;
22. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 21, caracterizado pela etapa (c) compreender uma etapa cromatográfica (ii), em particular cromatografia líquida, tal como HPLC, micro LC ou LC rápida, da amostra;
23. Método, de acordo com qualquer um dos itens 15 a 22, caracterizado pela etapa de enriquecimento compreender uma etapa de separação ligada/livre (c) (i) e uma etapa cromatográfica (c) (ii);
24. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 23, caracterizado pela etapa (d) compreender uma análise por MS/MS,
particularmente uma análise por MS/MS de fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A;
25. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 24, caracterizado pela etapa (d) compreender uma análise por MS/MS triplo quadrupolo;
26. Método, de acordo com qualquer um dos itens 1 a 25, caracterizado pela razão de hemoglobina A glicada (HbA1c) para hemoglobina A não glicada (HbA0) ou para hemoglobina A total (HbA) ser determinada;
27. Método, de acordo com o item 26, caracterizado pela razão ser determinada com um coeficiente de variação de 2,5% ou menos, particularmente de 2,0% ou menos, mais particularmente de 1,5% ou menos;
28. Kit, caracterizado por compreender: (i) uma enzima para a digestão proteolítica parcial de moléculas da cadeia β de HbA e, opcionalmente, um tampão de digestão para a referida enzima, (ii) um meio de interrupção, que é capaz de interromper uma digestão proteolítica com a enzima de (i), e (iii) opcionalmente, um meio de enriquecimento para enriquecer as moléculas de HbA1c digeridas proteoliticamente, e (iv) opcionalmente, um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água para uso na eluição de componentes de amostra a partir do meio de enriquecimento de (iii);
29. Uso do kit, conforme definido no item 28, caracterizado por ser em um método, conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 27;
30. Sistema de diagnóstico para determinar a hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra, caracterizado por ser adaptado para realizar o método, conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 27;
31. Sistema de diagnóstico para determinar a hemoglobina A glicada (HbA1c) em uma amostra, caracterizado por compreender: (i) pelo menos uma estação para a preparação de amostras compreendendo fragmentos N-terminais de moléculas de HbA1c, em que a preparação compreende uma digestão proteolítica parcial de moléculas de hemoglobina A (Hb1), (ii) opcionalmente, pelo menos uma estação de enriquecimento adaptada para enriquecer seletivamente fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A da amostra, e (iii) pelo menos uma estação adaptada para a análise de fragmentos N-terminais de moléculas de hemoglobina A por espectrometria de massa (MS) e para determinar a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra; e
32. Uso do sistema de diagnóstico, conforme definido no item 30 ou 31 caracterizado por ser no método, conforme definido em qualquer um dos itens 1 a 27.
[000109] A seguir, a presente invenção é explicada em mais detalhes pelos Exemplos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 DETERMINAÇÃO DE FRAGMENTOS DE PEPTÍDEO DE HBA1 EM SANGUE TOTAL
[000110] Uma amostra de sangue total de 100 µL foi diluída com 900 µL de H2O e misturada por vórtice por 10 s até que uma solução límpida fosse obtida. Em seguida, 5 µL da amostra de sangue total hemolisada foram posteriormente diluídos com 20 µL de H2O. 5 µL da amostra de sangue hemolisada diluída, 15 µL de endoproteinase Glu-C (2 mg/mL) e 30 µL de tampão de digestão (50 mM de acetato de amônio a pH 4,3) foram adicionados a um frasco LoBind (Eppendorf) e incubados por 45 min a 37 °C para fornecer uma digestão parcial, por exemplo, uma digestão de 1 a 20% das moléculas de
HbA presentes na amostra. A reação enzimática foi interrompida pela adição de 950 µL de ácido fórmico a 0,1% (v/v).
[000111] Em seguida, foram fornecidos vários lotes de 100 µL de esferas magnéticas hidrofóbicas (50 mg/mL). 200 mL da amostra de sangue total digerido e 700 mL de H2O com ácido fórmico a 0,1% (v/v) foram adicionados a cada lote de esferas magnéticas. As misturas foram agitadas a 37 °C e 1200 rpm por 5 min.
[000112] Em seguida, as esferas foram lavadas duas vezes usando 900 µL de ácido fórmico aquoso a 0,1% (v/v). Posteriormente, 900 µL de meio de eluição (água com 0,1% de ácido fórmico contendo diferentes quantidades de acetonitrila (ACN), ou seja, 5% (v/v), 10% (v/v), 15% (v/v), 20% (v/v) e 30% (v/v)) foram adicionados a cada lote de esferas carregadas. As misturas foram agitadas a 37 °C e 1200 rpm durante 1 min e os sobrenadantes foram coletados.
[000113] De cada lote, 500 µL de meio de eluição foram coletados para teste. 1 µL foi injetado em uma coluna de fase reversa (Symmetry C18 Sentry Guard Cartridge 300A, 3,5 µm, 2,1 x 10 mm; Waters).
Em seguida, foi realizada uma eluição isocrática usando ACN aquosa a 10% com ácido fórmico a 0,1% a 900 µL/min. O tempo total de execução foi de 12 s.
[000114] Os parâmetros para MS/MS foram os seguintes: Tipo de fonte de íons: ESI; Tensão de pulverização: - Estático; - Íon positivo (V): 3500,00; - Íon negativo (V): 2500,00; - Gás de impulsão (Arb): 50; - Gás Aux (Arb): 25; - Gás de varredura (Arb): 3;
- Temperatura do tubo de transferência de íons (°C): 350; e - Temperatura do vaporizador (°C): 400.
[000115] Na Tabela 1, os parâmetros de medição para HbA0 e HbA1c são indicados: Composto Tempo Tempo Polaridade Precursor Produto Energia Lente inicial final (m/z) (m/z) de RF (V) (min) (min) colisão (V) 1 HbA0 0 0,6 Positivo 348,288 236,968 22,944 47 2 HbA1c 0 0,6 Positivo 429,342 245,054 16,522 52
[000116] A Figura 1 mostra os picos de MS/MS dos peptídeos de HbA1c e HbA0 obtidos por digestão de uma amostra de sangue total com Glu-C.
[000117] Na Tabela 2, os resultados da medição para o coeficiente de variação (CV) de replicados (n = 3) no que diz respeito às quantidades de HbA0 e HbA1c e a razão de HbA1c/HbA0 obtida com diferentes quantidades de acetonitrila (ACN) no meio de eluição são indicados: % de HbA0 HbA1c HbA1c/HbA0
RSD Fluxo de trabalho de esferas em sangue 0,5 2,7 3,1 total 5% de ACN Fluxo de trabalho de esferas em sangue 1,2 2,0 1,0 total 10% de ACN Fluxo de trabalho de esferas em sangue 0,7 1,1 0,6 total 15% de ACN
[000118] A Figura 2 mostra o resultado da digestão de amostras de sangue total com Glu-C sem purificação adicional (topo) e com purificação de amostra por enriquecimento em esferas magnéticas, seguido por lavagem e eluição com diferentes concentrações de ACN, a saber 5% (v/v) de ACN, 10% (v/v) de ACN, 15% (v/v) de ACN, 20% (v/v) de ACN e 30% (v/v) de ACN, respectivamente. A eluição com ACN, particularmente em quantidades de 5% ou 10% de ACN, permite a eluição específica de HbA1c e HbA0 e, portanto, o enriquecimento antes da LC-MS.
Claims (15)
1. MÉTODO PARA DETERMINAR HEMOGLOBINA A GLICADA (HBA1C) EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender: (a) fornecer uma amostra compreendendo moléculas de hemoglobina A (HbA), (b) submeter a amostra da etapa (a) a uma etapa de digestão proteolítica parcial em que fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A são gerados, (c) enriquecer opcionalmente os fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A geradas na etapa (b), e (d) submeter a amostra compreendendo fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A a uma análise por espectrometria de massa (MS) em que a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra é determinada.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela amostra na etapa (a) ser uma amostra de sangue total hemolisado, particularmente uma amostra de sangue total humano hemolisado.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por, na etapa de digestão proteolítica parcial (b), cerca de 1% a cerca de 20%, particularmente cerca de 5% a 10% das moléculas da cadeia β de HbA presentes na amostra serem digeridas com base na quantidade total de moléculas da cadeia β de HbA originalmente presentes na amostra.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pela digestão proteolítica parcial na etapa (b) ser realizada com uma enzima proteolítica que gera um fragmento N- terminal da molécula da cadeia β de hemoglobina A tendo um comprimento na faixa de 4 a 20 aminoácidos, particularmente na faixa de 5 a 15 aminoácidos, e mais particularmente em que a enzima proteolítica cliva uma molécula da cadeia β de hemoglobina A após a posição de aminoácido 6, 8 ou 14 de acordo com a SEQ ID NO: 1.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela digestão proteolítica parcial na etapa (b) ser realizada com uma endopeptidase, particularmente com uma endopeptidase selecionada a partir do grupo que consiste em Glu-C, tripsina, pepsina e termolisina.
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pela digestão proteolítica parcial na etapa (b) ser realizada por um período de tempo inferior a cerca de 60 min, em particular inferior a cerca de 45 min, ou inferior a 30 min.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela digestão proteolítica na etapa (b) ser realizada com a endopeptidase Glu-C, particularmente em uma concentração de cerca de 0,6 mg/mL por um período de tempo de cerca de 15 min a cerca de 45 min a uma temperatura de cerca de 37 °C, em um tampão compreendendo íons amônio, e a digestão é interrompida pela adição de ácido fórmico em água, particularmente 0,1% (v/v) de AF em água.
8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por, na etapa de enriquecimento c), fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A serem enriquecidos por eluição seletiva da fase sólida, particularmente na presença de cerca de 5 a 20% (v/v) de acetonitrila, mais particularmente na presença de cerca de 10% (v/v) de acetonitrila.
9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela etapa (d) compreender uma análise por MS/MS, particularmente uma análise por MS/MS de fragmentos N-terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A.
10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela razão de hemoglobina A glicada (HbA1c) para hemoglobina A não glicada (HbA0) ou para hemoglobina A total (HbA) ser determinada.
11. KIT, caracterizado por compreender: (i) uma enzima para a digestão proteolítica parcial de moléculas da cadeia β de HbA e, opcionalmente, um tampão de digestão para a referida enzima, (ii) um meio de interrupção, que é capaz de interromper uma digestão proteolítica com a enzima de (i), e (iii) opcionalmente, um meio de enriquecimento para enriquecer as moléculas de HbA1c digeridas proteoliticamente, e (iv) opcionalmente, um meio de eluição compreendendo um solvente orgânico miscível em água para uso na eluição de componentes de amostra a partir do meio de enriquecimento de (iii).
12. USO DO KIT, conforme definido na reivindicação 11, caracterizado por ser para um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
13. SISTEMA DE DIAGNÓSTICO PARA DETERMINAR HEMOGLOBINA A GLICADA (HbA1c) EM UMA AMOSTRA, caracterizado por ser adaptado para realizar o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
14. SISTEMA DE DIAGNÓSTICO PARA DETERMINAR HEMOGLOBINA A GLICADA (HbA1c) EM UMA AMOSTRA, caracterizado por compreender: (i) pelo menos uma estação para a preparação de amostras compreendendo fragmentos N-terminais de moléculas de HbA1c, em que a preparação compreende uma digestão proteolítica parcial de moléculas de hemoglobina A (Hb1), (ii) opcionalmente, pelo menos uma estação de enriquecimento adaptada para enriquecer seletivamente fragmentos N- terminais de moléculas da cadeia β de hemoglobina A da amostra, e (iii) pelo menos uma estação adaptada para a análise de fragmentos N-terminais de moléculas de hemoglobina A por espectrometria de massa (MS) e para determinar a quantidade ou concentração de HbA1c na amostra.
15. USO DO SISTEMA DE DIAGNÓSTICO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 14, caracterizado por ser para o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
Figura 1
Petição 870210064695, de 16/07/2021, pág. 111/114 1/2
Intensidade Rel Intensidade Rel Tempo de execução [min] , Tempo de execução [min] ,
Figura 2
Digestão de sangue total 18h com GluC
Petição 870210064695, de 16/07/2021, pág. 112/114 Eluição de esferas da digestão de sangue total 18h com GluC 5% de ACN
Eluição de esferas da digestão de sangue total 18h com GluC 10% de ACN 2/2
Eluição de esferas da digestão de sangue total 18h com GluC 15% de ACN
Intensidade Rel Eluição de esferas da digestão de sangue total 18h com GluC 20% de ACN
Eluição de esferas da digestão de sangue total 18h com GluC 30% de ACN
Tempo de execução [min]
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