CN116829922A - 用于质谱法的基于蒸发的样品制备工作流程 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物的方法。本发明的所述方法包括：使用固相萃取(SPE)从所述样品中提取所述分析物以获得包含所述分析物的SPE提取物；浓缩所述分析物，所述浓缩包括从所述SPE提取物蒸发溶剂；并且使用质谱法检测和/或定量所述样品中的所述分析物。

Description

用于质谱法的基于蒸发的样品制备工作流程
技术领域
本发明涉及一种使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物的方法。本发明的方法包括：使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物；浓缩分析物，其中所述浓缩包括从SPE提取物中部分蒸发溶剂；并且使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物。
背景技术
用于LC-MS应用的自动样品制备系统以及HPLC系统具有与死体积相关的样品体积和分析物损失，从而导致较低的灵敏度。例如，在将从借由固相萃取(SPE)的分析物富集获得的洗脱样品从主反应容器转移到辅反应容器期间，可能会发生大量样品损失。由于样品或HPLC小瓶以及使用溢出以确保高精度和重现性的满环进样的死体积，在LC进样过程期间，可能会发生进一步的样品损失。
SPE期间分析物的洗脱通常需要有机溶剂(例如80％MeOH)。然而，在LC-MS进样之前，需要尽量减少样品中有机溶剂的含量，以保持可接受的色谱性能，尤其是对于μLC系统。因此，此类洗脱经常被稀释，例如用水1∶1稀释，以降低有机溶剂浓度(例如≤30-40％MeOH)。这种稀释导致分析物检测灵敏度的进一步损失。
因此，非常需要改进质谱法的样品制备工作流程，使得最大限度地减少分析物损失并且可以实现更高的分析物检测灵敏度，尤其是在使用SPE技术(例如基于磁性颗粒的SPE技术)的样品制备过程的背景下。
发明内容
本文提供了一种使用质谱法检测和/或定量样品中目的分析物的方法，所述方法包括：
a)使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物；
b)通过从a)中获得的SPE提取物中部分蒸发溶剂来浓缩分析物；并且
c)使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物。
特别地，本发明也涉及以下项：
1.一种使用质谱法来检测和/或定量样品中的分析物的方法，所述方法包括：
a)使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物；
b)浓缩分析物，所述浓缩包括从a)中获得的SPE提取物中蒸发溶剂；并且
c)使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物，
优选地，一种使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物的方法，所述方法包括：
a)使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物，其中SPE提取物包含50vol％至100vol％的有机溶剂，其中分析物是类固醇，优选地选自由睾酮和雌二醇组成的组；
b)浓缩分析物，所述浓缩包括从a)中获得的SPE提取物中部分蒸发溶剂；其中经受部分蒸发的SPE提取物的体积减少了50％至95％、优选地减少了60％至90％，更优选地减少了70％至80％；
b1)用稀释溶剂来稀释从步骤b)获得的浓缩分析物以获得稀释的分析物，其中稀释的分析物在步骤c)之前包含小于50vol％的有机溶剂或另外的有机溶剂；并且
c)使用质谱法来检测和/或定量样品中的分析物，其中质谱法是与液相色谱法(LC-MS)联用的质谱法。
2.根据项目1所述的方法，其中溶剂从SPE提取物中的所述蒸发是溶剂从SPE提取物中的部分蒸发。
3.根据项目1或2所述的方法，其中经受浓缩的SPE提取物的体积减少了50％至95％、在一个实施例中减少了60％至90％、在一个实施例中减少了70％至80％、在一个实施例中减少了73％到87％。
4.根据项目3所述的方法，其中该方法进一步包括使用稀释溶液将蒸发后的体积调整至对应于a)中经受SPE的样品体积的5％至40％、在一个实施例中为10％至30％、在一个实施例中为13％至27％的最终体积。
5.根据项目4所述的方法，其中稀释溶液是有机溶剂浓度低于10vol％、特别是5vol％、特别是0vol％的水溶液。
6.根据项目4所述的方法，其中稀释溶液是水。
7.根据项目1至6中任一项所述的方法，其中在a)中经受SPE的样品体积为250μl或更少、在一个实施例中为200μl或更少、在一个实施例中为150μl或更少、在一个实施例中为150μl。
8.根据项目1至7中任一项所述的方法，其中经受SPE的样品的体积是150μl，并且其中SPE提取物的体积通过浓缩减少至10μl至60μl、在一个实施例中为20μl至50μl、在一个实施例中为40μl的最终体积。
9.根据项目1至8中任一项所述的方法，其中SPE提取物包含50vol％至100vol％的有机溶剂。
10.根据项目9所述的方法，其中有机溶剂选自由乙腈和甲醇组成的组。
11.根据项目1至10中任一项所述的方法，其中分析物是类固醇。
12.根据项目1至11中任一项所述的方法，其中分析物是类固醇激素，在一个实施例中，类固醇激素选自由雄激素、雌激素、糖皮质激素、盐皮质激素和孕激素组成的组。
13.根据项目1至12中任一项所述的方法，其中分析物是雄激素或雌激素。
14.根据项目13所述的方法，其中雄激素是睾酮。
15.根据项目13所述的方法，其中雌激素是雌二醇。
16.根据项目1至15中任一项所述的方法，其中样品是流体，特别是生物流体。
17.根据项目1至16中任一项所述的方法，其中样品是所获得的体液，在一个实施例中是人体液。
18.根据项目1至17中任一项所述的方法，其中样品是血清或血浆。
19.根据项目1至18中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用于从分析物结合蛋白释放分析物的预处理步骤。
20.根据项目1至19中任一项所述的方法，其中SPE是分批式SPE。
21.根据项目1至20中任一项所述的方法，其中SPE所用的固相由磁性颗粒，特别是磁性微珠形成。
22.根据项目1至21中任一项所述的方法，其中SPE的固相由颗粒(例如磁性颗粒)形成，该颗粒被配置为从样品中捕获分析物并且在用洗脱溶剂处理时释放所述分析物。
23.根据项目1至22中任一项所述的方法，其中SPE的固相由涂覆有特异性结合分析物的抗体的颗粒(例如磁性颗粒)形成。
24.根据项目1至23中任一项所述的方法，其中SPE的固相由能够结合或吸附样品中的分析物并且在用洗脱溶液处理时能够释放分析物的多孔聚合物基质形成。
25.根据项目1至24中任一项所述的方法，其中固相萃取(SPE)包括：
a)将分析物捕获到固相；
b)任选地对固相的一个或多个洗涤步骤；并且
c)从固相中洗脱分析物以获得包含分析物的SPE提取物。
26.根据项目25所述的方法，其中洗脱分析物包括将洗脱溶剂添加至固相并且在添加的洗脱溶剂的存在下培养固相。
27.根据项目25或26所述的方法，其中添加的洗脱溶剂的体积对应于经受SPE的样品体积的50％至150％、在一个实施例中对应于经受SPE的样品体积的90％至120％、在一个实施例中经受SPE的样品体积的100％。
28.根据项目25至27中任一项所述的方法，其中洗脱溶剂包含ACN，特别是处于40vol％至100vol％、特别是处于45vol％至90vol％、特别是处于60vol％至80vol％的浓度。
29.根据项目25至27中任一项所述的方法，其中洗脱溶剂包含MeOH，特别是处于70vol％至100vol％、特别是处于80vol％至90vol％、特别是处于80vol％的浓度。
30.根据项目1至29中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤a)之前向样品添加用于定量的内标(ISTD)。
31.根据项目30所述的方法，其中ISTD是用一种或多种重同位素人工标记的分析物。
32.根据项目1至31中任一项所述的方法，其中质谱法是与液相色谱法联用的质谱法(例如，其中分析是LC-MS分析或更具体地是LC-MS/MS分析)。
33.根据项目32所述的方法，其中液相色谱法(LC)是HPLC或快速LC。
34.根据项目32或33所述的方法，其中LC是微型LC。
35.根据项目32至34中任一项所述的方法，其中LC是超高效液相色谱法(UHPLC)。
36.根据项目1至35中任一项所述的方法，其中质谱法是使用电喷雾电离(ESI)的质谱仪执行的。
37.根据项目1至36中任一项所述的方法，其中质谱法是用质谱仪执行的，该质谱仪是串联质谱仪，特别是三级四极质谱仪。
38.根据项目1至37中任一项所述的方法，其中方法是自动化的。
具体实施方式
本发明涉及一种使用质谱法检测和/或定量样品中目的分析物的方法，所述方法包括：
a)使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物；
b)浓缩分析物，所述浓缩包括从a)中获得的SPE提取物中蒸发溶剂；并且
c)使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物。
在优选的方面，本发明涉及一种使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物的方法，所述方法包括：
a)使用固相萃取(SPE)从所述样品中提取所述分析物以获得包含所述分析物的SPE提取物，其中所述SPE提取物包含50vol％至100vol％的有机溶剂，其中所述分析物是类固醇，优选地选自由睾酮和雌二醇组成的组；
b)浓缩所述分析物，所述浓缩包括从a)中获得的所述SPE提取物中部分蒸发所述溶剂；其中经受所述部分蒸发的所述SPE提取物的体积减少了50％至95％，优选地减少了60％至90％，更优选地减少了70％至80％；
b1)用稀释溶剂来稀释从步骤b)获得的浓缩分析物以获得稀释的分析物，其中所述稀释的分析物在步骤c)之前包含小于50vol％的所述有机溶剂或另外的有机溶剂；并且
c)使用质谱法来检测和/或定量所述样品中的所述分析物，其中所述质谱法是与液相色谱法(LC-MS)联用的质谱法。
在优选的方面，本发明涉及一种使用质谱法检测和/或定量样品中目的分析物的方法，所述方法包括：
a)使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物；
b)通过从a)中获得的SPE提取物中部分蒸发溶剂来浓缩分析物；并且
c)使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物。
如本发明的方法的附加实例所示，发明人惊奇地发现，对包含目的分析物(例如类固醇，特别是雄激素或雌激素)的SPE提取物施加部分蒸发，可相对于先前使用的稀释工作流程增加MS样品制备工作流程中的分析物回收率。此外，发明人证明，与使用完全蒸发至干燥并随后在限定体积中重构相比，SPE提取物的部分蒸发在样品回收率以及由此分析物(例如类固醇，特别是雄激素或雌激素)的检测灵敏度方面出人意料地优越。除了更高分析物回收率和检测灵敏度的优势外，部分蒸发还具有比完全蒸发快得多的优势。因此，缩短溶剂蒸发时间可缩短整个样品制备时间。较短的样品制备时间允许更高的样品周转率，并且在谈论通常需要尽可能高的样品通量的全自动MS样品制备和测量系统时变得尤为重要。
“通过从SPE提取物中部分蒸发溶剂来浓缩分析物”是指SPE提取物经受蒸发，使得体积减小，并且所获得溶液中的分析物的浓度相对于SPE提取物中的分析物的浓度得到增加。
如本文所用，“部分蒸发”是指液体样品(本文中为SPE提取物/洗脱液)的溶剂没有蒸发至完全干燥，而是使得留下一部分溶剂。换句话说，经受蒸发的液体样品(本文为SPE提取物/洗脱液)的溶剂没有完全蒸发。
“蒸发溶剂”是指以分析物不蒸发的方式蒸发液体。优选地，分析物在蒸发期间也不沉淀。
根据本发明的部分蒸发被配置为增加分析物浓度。此外，优选地配置部分蒸发以减少有机溶剂(例如挥发性有机溶剂诸如乙腈或甲醇)的含量。减少SPE提取物中有机溶剂的含量可提高LC-MS中的LC性能。
在实施例中，该方法按以下顺序执行：a)，然后b)，并且然后c)。
在实施例中，该方法按以下顺序执行：a)，然后b)，然后b1)，并且然后c)。
在实施例中，部分蒸发的设置(例如温度和/或真空设置)可以被配置为使得有机溶剂(例如乙腈或甲醇)蒸发。在实施例中，可以选择部分蒸发的设置，使得有机溶剂优先于诸如水的其他溶剂蒸发。含水混合物中蒸气压较高或沸点较低的溶剂(例如乙腈和甲醇)比接近或高于沸点(温度和压力的组合)的水含量蒸发快。由此，通过蒸发有效地降低了相对有机物含量。
浓缩步骤具有针对质谱法分析增加分析物浓度的优点，使得可以提高关于样品中分析物浓度的定量下限。尤其是，通过结合SPE和包括部分蒸发的浓缩，令人惊讶的是可以实现信号增加。通过浓缩步骤增加分析物的浓度也允许针对给定的定量限度使用较低的样品体积，并且增加在限定体积中经受质谱法的分析物的量。此外，使用溶剂的部分蒸发的分析物浓缩具有可以去除挥发性溶剂诸如SPE提取物中包含的有机溶剂(例如，可用于从固相中提取分析物的ACN或甲醇)的优点。此类有机溶剂可能干扰包含质谱工作流程的LC的液相色谱法。
可以用本领域已知的不同蒸发系统或不同蒸发室来实现蒸发或部分蒸发。蒸发系统或蒸发室可以是质谱系统的一部分。蒸发可以完全自动进行，即无需人工处理步骤。在实施例中，可以采用不使用离心的蒸发系统。在优选的实施例中，蒸发系统可以使用真空和加热进行蒸发(例如SpeedVac真空浓缩器，ThermoFisher)。
在实施例中，通过蒸发经受浓缩的SPE提取物的体积减少了50％至95％、特别是60％至90％、特别是70％至80％(相对于经受浓缩/蒸发的SPE提取物体积)。特别地，可以通过使用蒸发将溶剂体积减少73％至87％来浓缩SPE提取物。在附加的实施例1中证明，使用来自SPE提取物的这种程度的溶剂浓缩/蒸发，相对于稀释工作流程和完全蒸发工作流程，可以实现分析物回收率和分析物检测灵敏度的提高。
例如，当进行基于磁性颗粒的SPE并且获得150μl的总SPE提取物时，可以将磁性颗粒制成球形，可以将130μl的SPE提取物转移到单独的管中并进行蒸发。例如，将130μl的SPE提取物的体积减少到20μl的体积，相当于体积减少了84.6％。
在实施例中，经受蒸发的SPE提取物的体积可以通过蒸发减少至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％％、至少85％、至少90％或至少95％。
在实施例中，经受蒸发的SPE提取物的体积可以通过蒸发减少至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多99％。
在实施例中，经受蒸发的SPE提取物的体积通过蒸发减少至5％至50％、特别是10％至40％、特别是20％至30％的最终体积。特别地，SPE提取物可以通过蒸发浓缩，将溶剂体积减少至13％至27％的最终体积。
在实施例中，该方法可以包括使用稀释溶液将蒸发后的体积调整至经受LC-MS的最终体积。用稀释溶液调整后的最终体积可以对应于经受SPE的样品体积的5％至40％、在一个实施例中为10％至30％或在一个实施例中为13％至27％。示例性但非限制性的，130μl的SPE提取物体积可以经受使用蒸发浓缩分析物的步骤，体积可以通过所述浓缩减少到10μl，并且最后体积可以使用稀释溶液调整到40μl。
在实施例中，从SPE提取物中蒸发溶剂后所获得的体积可以通过添加稀释溶液进行调整，使得获得的最终体积对应于到LC的进样体积和任选地反应容器的包含溶液的死体积。例如，从SPE提取物中蒸发溶剂后获得的体积可以通过添加稀释溶液进行调整，使得可以从使用的反应容器中移除15μl至30μl或特别是20μL用于进样到LC。
在本公开的上下文中使用的稀释溶液可以是例如水溶液或水。优选地，用作稀释溶液的水溶液包含20vol％或更低、优选10vol％或更低、甚至更优选5vol％或更低并且最优选0vol％的有机溶剂浓度。在实施例中，稀释溶液可以是水。使用低浓度的有机溶剂甚至不含有机溶剂的优点是有机溶剂含量可以保持在较低水平，这在将浓缩溶液进行LC-MS时是有利的。高浓度的有机溶剂通常会导致LC中的峰加宽，尤其是在使用疏水性LC固定相(诸如C18基质)时。
本发明的方法适用于不同的分析物和样品。该方法可以包括仅检测和/或定量目的分析物或者可以检测目的分析物和，此外，其他分析物。
在实施例中，通过本发明的方法检测和/或定量的目的分析物可以是类固醇，特别是类固醇激素。特别地，分析物可以是选自由雄激素、雌激素、糖皮质激素、盐皮质激素、孕激素组成的组的类固醇。
雄激素的示例性但非限制性实例是睾酮、脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEA-S)、雄烯二酮(A4)、雄烯二醇(A5)、二氢睾酮(DHT)和雄酮。
在具体的实施例中，雄激素是睾酮。
雌激素的示例性但非限制性实例是雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和雌四醇(E4)。
在具体的实施例中，雌激素是雌二醇。
糖皮质激素的示例性但非限制性实例是皮质醇。
盐皮质激素的示例性但非限制性实例是醛固酮。
孕激素的示例性但非限制性实例是黄体酮(P4)、16α-羟基黄体酮、17α-羟基黄体酮、20α-二氢黄体酮、20β-二氢黄体酮、5α-二氢黄体酮、5β-二氢黄体酮、3β-二氢黄体酮、11-脱氧皮质酮和二氢脱氧皮质酮。
在实施例中，分析物是选自由以下项组成的组的类固醇：11脱氧皮质醇、17-α-羟基黄体酮(17OHP)、21-脱氧皮质醇、醛固酮、雄烯二酮(A4)、皮质醇、可的松、脱氢表雄酮(DHEA)、硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)、二氢睾酮(DHT)、雌二醇(E2)、黄体酮、睾酮(T)。在优选的实施例中，分析物选自醛固酮、雄烯二酮(A4)、脱氢表雄酮、二氢睾酮(DHT)、雌二醇(E2)、黄体酮或睾酮(T)。在特别优选的实施例中，分析物是睾酮(T)或雌二醇(E2)。
本发明的方法使用先前获得的样品。因此，本发明的方法是体外方法。样品可以特别是从人类个体获得的样品。
原则上，任何包含或怀疑包含目的分析物的样品都可以进行本发明的方法。虽然经受固相萃取的样品需要是液体，但原则上固体样品(例如干血斑)也可以进行本发明的方法。对于固体样品，包括在SPE之前的额外样品制备步骤，其包括在液体中重构干燥的血斑。用于将固体样品重构为液体使得在液体中回收分析物(例如类固醇)的各种方法和装置在本领域中是已知的(Rossi等人，Clin Chem Lab Med 2011；49(4)：677-684；Kim等人，AnnLab Med 2015；35：578-585)。
在实施例中，样品可以是液体样品，例如生物流体。在特定的实施例中，样品可以是体液。体液的示例性但非限制性实例是全血、血清、血浆、尿液、精液、(女性)卵泡液和唾液。特别地，样品可以是选自全血、血清和血浆的血液样品。在具体的实施例中，样品可以是血清或血浆。根据所使用的样品类型，在对样品进行SPE之前可能需要样品制备步骤，并且可能需要调整样品量。本领域技术人员知道如何进行这样的样品制备。
经受SPE的样品体积可以根据样品类型和样品中待检测分析物的类型和/或浓度而变化。低样品量的优势在于减少分析所需的试剂量和总分析时间(例如，通过减少液相色谱法等的时间)，并且提供机会以对额外的样本材料进行不同的分析。本发明的方法的SPE萃取和浓缩步骤的组合有助于提高灵敏度，并且因此可以保持较低的样品体积。
例如，样品体积可以是250μl或更少、在一个实施例中是200μl或更少、在一个实施例中是150μl或更少、在一个实施例中是150μl。在实施例中，可以使用150μl至250μl或更特别地150μl至200μl的样品体积。在具体的实施例中，样品体积可以是150μl。
根据样品类型和分析物，一部分的分析物可能与一种或多种蛋白质(例如类固醇可能与类固醇结合蛋白和/或性激素结合珠蛋白结合)或其他样品成分(例如血清成分或白蛋白)形成复合物。本发明的方法可以包括从诸如蛋白质(例如性激素结合珠蛋白)的结合伴侣释放待检测和/或定量的分析物的步骤。释放步骤特别地可以在SPE之前进行。执行释放/预处理步骤可以提高一种或多种类固醇用于检测和/或定量的可用性。预处理步骤可以是“脱蛋白”步骤，即将部分或全部的一种或多种类固醇从与其结合的一种或多种蛋白质中释放的步骤。
预处理/释放步骤可以包括向样品中添加释放剂(例如脱蛋白剂)。释放剂(例如脱蛋白剂)是试剂，当添加到样品中时，它会从样品中的结合伴侣(蛋白质，诸如性激素结合珠蛋白和/或样品的其他成分)中释放一种或多种类固醇。在一些实施例中，可以使用释放组合物(例如脱蛋白组合物)。释放组合物(例如脱蛋白组合物)是两种或更多种物质的混合物，其包含至少一种试剂，当添加到样品中时，该试剂触发从其结合伴侣(蛋白质，诸如性激素结合珠蛋白和/或其他样品的成分)中释放一种或多种类固醇。脱蛋白剂和组合物以及使用它们的技术是本领域已知的。在本公开的上下文中，释放剂(例如脱蛋白剂)可以是例如有机溶剂，诸如例如选自乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和二甲亚砜(DMSO)的有机溶剂。示例性但非限制性的释放组合物(例如脱蛋白组合物)包括但不限于包含来自乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)和二甲基亚砜(DMSO)的组的至少两种的混合物。添加到样品的释放剂(例如脱蛋白剂)和/或释放组合物(例如脱蛋白组合物)的体积可以根据释放剂和/或释放剂组合物及其应该干扰的结合类型来调整。例如，可以将ACN添加到样品中，使得最终浓度为1vol％至10vol％、特别是2vol％至5vol％并且特别是约2vol％或恰好2vol％。例如，MeOH可以以2.5vol％至30vol％、特别是5vol％至15vol％、特别是7.5vol％的最终浓度添加到样品中。DMSO可以以2vol％至20vol％、特别是3vol％至10vol％和特别是5vol％的最终浓度添加到样品中。本发明上下文中的预处理步骤可以进一步或备选地涉及降低或增加样品的pH。本领域已知pH值的变化可能干扰类固醇与样品成分的结合。例如，可以将pH酸化至5或更低的pH、特别是4或更低、特别是3或更低并且特别是2或更低。
在优选的实施例中，本发明的方法可以包括在步骤a)之前的预处理步骤，该预处理步骤包括添加有机溶剂作为释放剂(例如，在中性pH下)。例如，有机溶剂乙腈(ACN)可以按上述最终浓度添加到样品中。
在实施例中，还可以采用本领域已知的预处理条件。Gervasoni，J.等人(ClinBiochem，2016.，49(13-14)：p.998-1003)描述了预处理条件的非限制性实例，其全文以引用方式并入本文。
本发明的方法包括“使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物”的步骤。“从样品中提取分析物”意味着降低了样品的复杂性；即分析物与其他样品成分部分或全部分离或纯化。通过萃取降低样品复杂性有助于质谱法分析并且减少背景信号。在实施例中，“从样品中提取分析物”的步骤也可以称为“从样品中富集分析物”。本文中的“富集”是指生成SPE提取物，其中分析物的量相对于其他样品成分有所增加。在实施例中，可以增加分析物相对于至少一种其他样品成分的丰度。
在本发明的上下文中使用的“固相萃取”(SPE)是指将分析物或一组分析物与液体混合物和/或样品中包含的其他成分部分或完全分离的方法。SPE方法依赖于分析物和混合物和/或样品中包含的一种或多种其他化合物的不同固相和液相分布。在根据本公开的固相萃取的第一实施例中，与混合物或样品中的一种或多种其他化合物相比，分析物对固相具有更高的结合亲和力。通过分析物对固相的更高结合亲和力，分析物可以部分或完全分离，即从混合物和/或样品的其他化合物中提取。在第二个备选实施例中，分析物可以具有对固相的结合亲和力，该亲和力低于包含在经受固体SPE的混合物和/或样品中的一种或多种其他化合物的结合亲和力。在该实施例中，一种或多种类固醇保留在液相中，并且一种或多种其他样品成分通过与固相结合而被去除。因此，本文使用的术语固相萃取包括不同的实施例，诸如：(i)将分析物保留在固相上，允许用液相部分或全部去除其他化合物(也可任选地用一个或多个洗涤步骤)以及(ii)将其他化合物保留在固相上，并且萃取液相中的分析物。在实施例(i)中，SPE通常涉及使用合适的洗脱溶液的洗脱以从固相释放可逆地结合的分析物。可以根据固相的结合原理来选择洗脱溶液。
本发明上下文中使用的“固相萃取”包括但不限于诸如使用固相萃取盒/柱或固相尖端的经典固相萃取方法等技术。特别地，本发明上下文中的术语“固相萃取”包括基于颗粒的特别是基于珠状物的工作流程。本公开上下文中的术语“固相萃取”包括不同的分离原理。在实施例中，分析物(即一种或多种类固醇)可以被固相(例如珠状物)阻滞并且一种或多种其他样品成分保留在液相中。在任选的实施例中，分析物(即一种或多种类固醇)可以保留在液相中并且一种或多种其他样品成分结合到固相。
在本发明的上下文中用于固相萃取的“固相”包括但不限于表面或颗粒(例如微粒诸如微珠)。在特定的实施例中，固相可以是珠状物，特别是微珠。珠状物(例如微珠)可以是非磁性的、磁性的或顺磁性的。在特别优选的实施例中，固相可以是磁性微珠。珠状物(例如微珠，特别是磁性微珠)可以由各种不同的材料制成。珠状物(例如磁珠)可以具有各种尺寸(例如在微米范围内)并且包括带有或不带有孔的表面。
在本发明的特定的实施例中，固相可以是可分配的固相；即可以悬浮和分配的固相材料。此类可分配固相的非限制性实例是颗粒，特别是珠状物，更特别是微珠，甚至更特别是磁性微珠。可分配固相的优点是它可以在自动样品制备和质谱分析仪上以随机存取模式有效使用，这可能需要对不同的分析物使用不同的固相。此外，可以更容易地调整可分配的固相材料的量。
可以以允许结合/捕获分析物的方式涂覆固相(例如颗粒，特别是磁性颗粒，特别是磁性微珠)。用于捕获/结合一种或多种类固醇的合适的涂层是本领域已知的。
在实施例中，固相(例如颗粒，特别是磁性颗粒，特别是磁性微珠)可以涂覆有特异性结合分析物的抗体或其片段。在特定的实施例中，结合/捕获分析物的免疫珠(即磁性颗粒，诸如具有附着到表面的抗体或其抗原结合片段的微珠)可以用作SPE的固相。在其他实施例中，固相可以涂覆有允许阻滞分析物的多孔聚合物基质。
在实施例中，如WO2018189286A1或WO2019141779A1中所述的颗粒可用于SPE以从样品中捕获分析物(例如类固醇)。这些文件，特别是其中描述的颗粒或珠状物，以其整体并入本文。
本发明上下文中的固相萃取可以包括基于流通的固相萃取和分批式固相萃取。
基于流通的固相萃取意味着固相保留在容器(例如盒)中并且样品(或预处理样品)在流通过程中应用于固相。任选地，流通可以包括限定的培养时间，在该时间中样品与固相接触而流通被阻断。例如，基于流通的固相萃取可以用固相萃取盒/柱或固相尖端进行。基于流通的固相萃取可以包括一个或多个洗涤步骤，其中去除残余液相。
如本文所用，“基于分批式的固相萃取”是指不包括流通步骤的基于固相的分离方法。“基于分批式的固相萃取”包括：使样品(或预处理样品)与固相接触，并且任选地在固相存在下将样品培养持续规定的时间(根据分离原理，需要分析物结合或一种或多种其他样品成分的结合)；通过不同于流通的方式(例如粒化)将固相与液相分离。特别地，分批式固相萃取包括实施例，其中固相由颗粒(特别是磁性颗粒，诸如珠状物)形成并且其中在SPE期间固相与液相的分离是通过将珠状物粒化来实现的。可以通过离心或其他方式将珠状物粒化。在具体的实施例中，将珠状物粒化可能不涉及离心。在特定的优选的实施例中，珠状物可以是磁性的并且珠状物可以通过磁力被粒化。
在特定的实施例中，SPE中使用的固相可以是分批式SPE，优选地使用(微)珠的分批式SPE，甚至更优选使用磁(微)珠的分批式SPE。分批式SPE可以基于将分析物结合/捕获到SPE中使用的固相。在其他实施例中，其他样品成分可以结合到固相并且分析物可以保留在液相中。
包含通过SPE获得的分析物或其大部分的溶液在本文中称为“SPE提取物”。根据SPE中采用的分离原理(即分析物在固相或液相中的阻滞)，“SPE提取物”可以对应于与固相培养后获得的样品的液相(因为在这些实施例中，分析物不与固相结合)或可以对应于通过使用洗脱溶剂/溶液从固相洗脱获得的洗脱液(在这些实施例中，分析物与固相结合并且随后被洗脱)。在特定的实施例中，分析物可以在固相上被阻滞并且SPE提取物可以对应于通过使用洗脱溶剂从固相洗脱获得的洗脱液。
在实施例中，SPE提取物可以包含50vol％至100vol％的有机溶剂。有机溶剂可以是甲醇或乙腈。
在特定的实施例中，SPE可以包括：
a)将分析物结合/捕获到固相；
b)任选地一个或多个洗涤步骤；并且
c)从固相洗脱分析物，其中获得的洗脱液称为SPE提取物并且包含分析物。
分析物与固相的结合可以涉及在允许捕获待检测分析物的条件下将固相与样品培养持续预定的时间。
在特定的优选的实施例中，SPE可以是基于磁性颗粒的工作流程。基于磁性颗粒的工作流程可以包括：
a)将分析物结合/捕获到磁性颗粒；
b)任选地一个或多个洗涤步骤；并且
c)从固相洗脱分析物，其中获得的洗脱液称为SPE提取物并且包含分析物。
基于磁珠的工作流程可以进一步包括：
d)将SPE提取物与珠状物分离。
这种分离可以通过在第一反应容器中将磁珠粒化(例如通过磁力)并且将洗脱液转移到另一个反应容器来实现。
因此，在特定的方面，本发明提供了一种使用质谱法检测或定量样品中分析物的方法，其中所述方法包括：
a)使用基于磁性颗粒的工作流程(例如，如本文别处所述)从样品中提取分析物，获得包含分析物的洗脱液；
b)浓缩洗脱液中的分析物，所述浓缩包括从a)中获得的洗脱液中部分蒸发溶剂；并且
c)使用质谱法检测和/或定量样品中的分析物。
换言之，“使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物”在本发明的实施例中可以是“使用基于磁性颗粒的工作流程从样品中提取分析物以获得包含分析物的洗脱液”。
“基于磁性颗粒的工作流程”是指使用磁性颗粒(例如磁性微珠)从样品中提取分析物的方法。磁性颗粒可以结合分析物，而其他样品成分部分或完全随液相去除。
在特定的优选的实施例中，本发明采用涂覆有特异性结合分析物的抗体或抗原结合片段(例如一种抗体或抗原片段的多个拷贝)的磁性颗粒。这些磁性颗粒在本文中也称为免疫珠。因此，一方面，本发明涉及一种使用质谱法检测或定量样品中分析物的方法，其中所述方法包括：
a)使用涂覆有分析物特异性抗体的磁性颗粒(即免疫珠)从样品中纯化分析物，以获得包含分析物的洗脱液；
b)浓缩洗脱液中的分析物，所述浓缩包括从a)中获得的洗脱液中部分蒸发溶剂；并且
c)使用质谱法(例如LC-MS)检测和/或定量样品中的分析物。
本发明的方法的SPE可以包括一个或多个使用洗涤溶液的洗涤步骤。该方法可以包括例如使用洗涤溶液的一个或两个洗涤步骤。洗涤步骤可以在将分析物结合/捕获到固相之后并且在从固相洗脱分析物之前进行。
在分析物与固相结合并且需要洗脱以形成SPE提取物的实施例中，这可以用洗脱溶剂实现。可以将洗脱溶剂添加到固相并且可以在洗脱溶剂的存在下培养固相。培养时间可以根据使用的固相和洗脱溶剂的苛刻程度进行调整。
SPE(也包括基于磁性颗粒的工作流程)的洗脱溶剂的组成可以根据固相、分析物以及分析物与固相之间的相互作用原理来选择。
在实施例中，洗脱溶剂可以包含乙腈(ACN)，特别是浓度为40vol％至100vol％、特别是45vol％至90vol％、特别是50vol％至70vol％、特别是60vol％。上述基于ACN的洗脱溶剂尤其是可用于使用颗粒的实施例中，诸如本文别处公开的磁性颗粒。当采用免疫珠时，可以特别使用这些洗脱溶剂。
在实施例中，洗脱溶剂可以包含甲醇，特别是浓度为60vol％至100vol％、特别是70vol％至90vol％、特别是80vol％。洗脱溶剂可以是甲醇和水的混合物。上述基于甲醇的洗脱溶剂尤其是可以用于使用颗粒的实施例中，诸如本文别处公开的磁性颗粒。当采用免疫珠时，可以特别使用这些洗脱溶剂。
本发明的方法可以包括使用一种或多种内标(ISTD)，特别是同位素标记的内标。ISTD可以用于分析物的定量。在SPE和可选的预处理步骤之前，优选地将一种或多种内标以预定的和已知的量添加到样品中。
“内标(ISTD)”通常是指在经受质谱检测工作流程(即包括任何预处理、富集和实际检测步骤)时表现出与目的分析物类似的物理化学性质的化合物。此外，通常选择ISTD，使得其不会自然地大量出现在要测量的样品中(例如，分析物量的1％或更少)。尽管ISTD表现出与目的分析物类似或相同的化学特性，但它仍明显地与通过质谱法的目的分析物区分开来。举例而言，在色谱分离(诸如气相色谱法或液相色谱法)期间，ISTD具有大致与来自样品的目的分析物相同的保留时间。因此，分析物和ISTD两者均同时进入质谱仪中。然而，ISTD表现出与来自样品的目的分析物不同的分子质量。这使得在来自ISTD的离子与来自分析物的离子之间能够通过其不同的质荷(m/z)比进行质谱区分。两者均经历裂解并提供子离子。这些子离子可通过其m/z比而彼此区分并与各自的母离子区分。因此，可以对来自ISTD和分析物的信号执行独立测定和定量。由于ISTD的添加的量是已知的，因此来自样品的分析物的信号强度可归因于该分析物的具体定量性的量。因此，ISTD的添加允许对所检测的分析物的量进行相对比较，并且在样品中存在的目的分析物到达质谱仪时，能够对该分析物进行无歧义的鉴别和定量。通常但并非必须，ISTD为目的分析物的同位素标记的变体(包含例如至少三个2H、13C和/或15N等标记)。
用于定量睾酮的示例性但非限制性的ISTD是13C3-睾酮(例如可从Cerilliant获得)。用于定量雌二醇的示例性但非限制性ISTD是13C3-雌二醇(例如可从Cerilliant获得)。
质谱分析可以涉及液相色谱法(LC)。在特定的优选的实施例中，质谱分析可以是LC-MS或LC-MS-MS。
在实施例中，液相色谱法可以是高压液相色谱法(HPLC)。HPLC可以基于本领域已知的不同柱材料。HPLC的流速可以根据分析物和需要进行调整。在具体的实施例中，HPLC的流速可以是0.20ml/min至1.0ml/min，特别是0.44ml/min。
在一些实施例中，质谱分析的液相色谱法可以是快速LC。
在一些实施例中，质谱分析的液相色谱法可以是微型LC。
在一些实施例中，质谱分析的液相色谱法可以是UHPLC，例如使用微型LC的UHPLC。
在实施例中，HPLC分离原理可以是反相HPLC(RP-HPLC)。RP-HPLC可以是但不限于C18-HPLC。
质谱分析中的电离可以基于如本文别处所述的不同技术。在一个实施例中，电喷雾电离(ESI)。
用于质谱分析的MS设备可以是串联质谱仪，特别是三级四极设备。
在特定的实施例中，本发明的方法可以是自动化的。“自动化”意味着除了将样品和试剂应用于系统的一个或更少的步骤之外，优选地不需要人工处理步骤。人工处理步骤具体包括向样品手动添加试剂以及在处理期间将样品从一个设备转移到另一个设备。
在实施例中，本发明的方法可以不包括离心步骤。特别是，SPE和/或浓缩可以在没有离心的情况下进行。避免离心步骤(例如通过使用基于磁珠的SPE工作流程)的优点是可以更轻松地实现自动化，并且样品制备系统不需要离心机。进一步，可以减少SPE期间用于分离固相的时间。
在实施例中，本发明的方法可以不包括液-液萃取，特别是不在样品制备中。换句话说，SPE和浓缩步骤可能是质谱法(例如LC-MS，特别是LC-MS/MS)之前的唯一的样品制备步骤。液-液萃取步骤通常很麻烦并且会消耗有机溶剂。
本发明的方法可以特别地以随机存取兼容模式并且使用随机存取兼容系统来执行。“随机存取”优选地意味着所描述的发明的试剂和系统设置与针对不同分析物的其他测定兼容，而不需要系统调整或平衡，特别是人工系统调整或平衡(包括改变质谱法和/或LC设置)。
本发明的方法的质谱分析可以使用多反应监测(MRM)模式进行。
在一个方面，本发明还提供了一种用于制备用于质谱分析(例如LC-MS/MS)检测和/或定量分析物的样品的方法，所述方法包括：
a)使用固相萃取(SPE)从样品中提取分析物以获得包含分析物的SPE提取物；
b)浓缩分析物，所述浓缩包括从a)中获得的SPE提取物中蒸发溶剂。
上面所述的关于检测和/或定量分析物的方法在必要的变更之后适用于制备用于检测或定量分析物的质谱分析(例如LC-MS/MS)的样品的方法。
术语“质谱法”(“Mass Spec”或“MS”)涉及用于通过化合物的质量对其进行鉴定的分析技术。MS是基于离子的质荷比或“m/z”对离子进行过滤、检测和测量的方法。MS技术通常包括：(1)电离化合物以形成带电荷的化合物；以及(2)检测质荷比。化合物可通过任何合适的手段来离子化并检测。“质谱仪”通常包括电离器和离子检测器。通常，将一个或多个目的分子离子化，后续将离子引入质谱仪器中，在该仪器中，由于磁场和电场的组合，离子遵循取决于质量(“m”)和电荷(“z”)的空间路径。术语“离子化”或“电离”是指生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。MS方法既可以在其中生成并检测负离子的“负离子模式”下执行，也可以在其中生成并检测正离子的“正离子模式”下执行。
“串联质谱”或“MS/MS”涉及质谱选择和检测的多个步骤，其中分析物裂解发生在步骤之间。在串联质谱仪中，离子在离子源中形成，并在第一级质谱法(MS1)中按质荷比进行分离。选择具有特定质荷比的离子(前体离子或母离子)，并且通过碰撞诱导解离、离子-分子反应和/或光解离形成碎片离子(也称为子离子)。然后，在第二级质谱法(MS2)中分离并检测所得离子。
通常，在质谱测量中执行以下三个步骤：
(1.)将包含目的分析物的样品电离，通常通过与阳离子形成加合物来进行，经常通过质子化为阳离子。电离源包括但不限于电喷雾电离(ESI)和大气压化学电离(APCI)。
(2.)根据离子的质量和电荷对离子进行分选和分离。可以使用高场非对称波形离子迁移谱(FAIMS)作为离子过滤器。
(3.)然后，例如以多反应模式(MRM)检测所分离的离子，并将结果展示在图表上。
术语“电喷雾电离”或“ESI”是指如下方法：在该方法中，溶液沿着短毛细管行进至被施加高正电位或高负电位的末端。到达管末端的溶液被蒸发(雾化)为在溶剂蒸气中非常小的溶液液滴的喷射或喷雾。此液滴雾流经蒸发室，将该蒸发室略微加热以防止冷凝并且蒸发溶剂。随着液滴变得更小，表面电荷密度增加，直到同类电荷之间的天然斥力造成离子以及中性分子得以释放。
术语“大气压化学电离”或“APCI”是指类似于ESI的质谱法；但是，APCI通过离子-分子反应产生离子，这些反应在大气压下发生在等离子体内。通过喷雾毛细管与对电极之间的放电来维持等离子体。通常通过使用一组差分泵送的分级分离器将离子提取到质量分析仪中。可以使用干燥且预热的N2气体逆流以改善溶剂的去除。对于分析极性较低的实体，APCI中的气相离子化可能比ESI更有效。
“多反应模式”或“MRM”是MS仪器的一种检测模式，在该模式下，选择性地检测和/或定量前体离子(也称为母离子)和一种或多种片段离子。
由于质谱仪分离并检测质量略有差异的离子，它容易区分给定元素的不同同位素。因此，质谱法是对包括但不限于低分子量分析物、肽、多肽或蛋白质的分析物进行精确质量测定和表征的重要方法。其应用包括蛋白质及其翻译后修饰的鉴别；蛋白质复合物、其亚基和功能性相互作用的阐明；以及蛋白质组学中蛋白质的全局测量。通常地，可通过质谱法执行对肽或蛋白质的从头测序而无需事先知晓氨基酸序列。
质谱测定可以与额外的分析方法联用，包括色谱方法诸如气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)特别是HPLC和/或基于离子迁移的分离技术。
在本公开的上下文中，样品可以是源自“个体”或“受试者”的样品。通常，受试者为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在优选的实施例中，样品从人获得。
术语“色谱法”是指一种过程，其中由液体或气体携带的化学混合物在与固定液或固相相互作用时的周围或上方流动时，由于化学实体的差异性分布，该化学混合物分离为多种组分。
术语“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地渗透通过细碎物质的柱或通过毛细管通道时，选择性阻滞流体溶液中的一种或多种组分的过程。该阻滞是由于当该流体相对于一种或多种固定相运动时，混合物的组分分布在一种或多种固定相与体相流体(即流动相)之间而导致的。其中固定相的极性高于流动相的方法(例如，以甲苯作为流动相，以硅土作为固定相)称为正相液相色谱法(NPLC)，而其中固定相的极性低于流动相(例如，以水-甲醇混合物作为流动相，并且以C18(十八烷基甲硅烷基)作为固定相)的方法称为反相液相色谱法(RPLC)。
“高效液相色谱法”或“HPLC”是指一种液相色谱方法，在该方法中，通过迫使流动相在压力下经过固定相，通常为密集填充柱，来提高分离程度。通常地，使用由不规则形状或球形的颗粒、多孔整体层或多孔膜构成的固定相来填充柱。基于流动相和固定相的极性，HPLC历来分为两个不同的亚类，即NP-HPLC和RP-HPLC。
微型LC(Micro LC)是指使用具有窄内柱径(通常低于1mm，例如约0.5mm)的柱的HPLC方法。“超高效液相色谱法”或“UHPLC”是指使用例如120MPa(17,405lbf/in2)或约1200个大气高压的HPLC方法。
快速LC是指使用具有如上所述的内径且长度短(＜2cm，例如1cm)的柱的LC方法，其采用如上所述的流速并使用如上所述的压力(微型LC、UHPLC)。短快速LC方案包括使用单个分析柱的捕捉/洗涤/洗脱步骤，并在＜1min的极短时间内实现LC。
其他众所周知的LC模式包括亲水作用色谱(HIC)、体积排阻LC、离子交换LC和亲和LC。
LC分离可为单通道LC或包括多个平行布置的LC通道的多通道LC。在LC中，可以根据分析物的极性或log P值、尺寸或亲和力来分离该分析物，如技术人员通常所知。
如本文所用，“检测(detecting)”或“检测(to detect)”样品中的分析物至少意味着确定分析物存在于样品中或分析物不存在于样品中。检测分析物可以包括也可以不包括定量所述分析物，即确定分析物的绝对量或相对量。
如本文所用，“定量(quantifying)”或“定量(to quantify)”样品中的分析物意味着确定样品中所述分析物的存在和量。该量可以是样品中的分析物的绝对量或相对量。绝对量可以是任何定量测量，诸如，例如浓度或质量。相对量可以是任何相对定量测量。例如，可以相对于另一种样品成分的量、添加到样品中的内标或包含相同的一种或多种分析物的参考样品来检测分析物的量。
如本文在将药剂和/或组合物添加至样品的上下文中使用的“最终浓度”是指通过将所述药剂和/或组合物添加至样品获得的混合物中药剂和/或组合物的浓度。
术语“溶剂”包括使目的分析物(例如一种或多种类固醇)保持在溶液中的任何溶剂或溶剂混合物。溶剂或溶剂混合物组分的示例性但非限制性实例是水、醇类(例如甲醇或乙醇)和乙腈。
“类固醇”是本领域已知的一组分子。类固醇是一种化合物，其核心结构通常为四个环，也称为类固醇环A、B、C和D。类固醇的核心环结构通常由十七个碳原子组成，这些碳原子以四个稠环键合：三个六C原子环己烷环(环A、B和C)和一个五C原子环戊烷环(环D)。类固醇因其四个环上连接的官能团和环的氧化态而异。一些类固醇还包含环结构的变化，因为四个环之一是开放的。
词语“包括”以及变体诸如“包含”和“含有”应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。
如在本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”也包括复数形式的相应术语。
进一步，如下文所使用，术语“特别地”、“更特别地”、“具体地”、“更具体地”或类似的术语(例如优选地或更优选地)与特定的或替代性的实施例的特征结合使用，而不限制替代的可能性。如本领域技术人员将认识到的，本公开方法/系统可以通过使用替代性特征来执行。类似地，由“在所公开的方法/系统的实施例中”，“在实施例中”引入的特征或类似表述旨在成为额外的和/或替代性的特征，而对替代性实施例没有任何限制、对所公开的方法/系统的范围没有任何限制并且对将以这种方式引入的特征与所公开的方法/系统的其他任选或非任选特征相组合的可能性也没有任何限制。
百分比、浓度、量和其他数值数据在本文中均可以以“范围”格式表示或呈现。在本公开的上下文中，应当理解，此类范围格式仅出于方便和简洁而使用，因此应灵活地解释为不仅包括明确列举为范围限值的数值，而且包括该范围所涵盖的所有单独的数值或子范围，就如同明确列举出每个数值和子范围一样。作为例示，数值范围“4％至20％”应解释为不仅包括明确列举出的4％至20％的值，而且包括所示范围内的各个值和子范围。因此，此数值范围中包括个体值诸如4、5、6、7、8、9、10、...18、19、20％和子范围诸如4-10％、5-15％、10-20％等。此相同原则适用于引用最小值或最大值的范围。此外，无论所述范围或特征的广度如何，均适用此类解释。
当与数值相连使用时，术语“约”意为涵盖处于一定范围内的数值，该范围具有比所指示的数值小5％的下限和比所指示的数值大5％的上限。
在本公开中，对溶剂和溶液的引用有时由某种化合物的％、(v/v)％或vol％来表示。只要没有另外说明，溶液或溶剂是水溶液。例如，80％MeOH、80(v/v)％或80vol％MeOH是指包含80体积百分比的MeOH的水性混合物。
提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。
附图说明
图1：使用无蒸发(简单稀释)、完全蒸发和部分蒸发工作流程的分析物睾酮的分析物信号(A)和回收率(B)的比较。将含有60pg/mL睾酮的60％MeOH样品分配到三个40μL等分试样的测试组中。对于第一个测试组，样品用40μL H2O稀释至总最终体积为80μL，以作为对照测试组(100％回收率)。对于第二和第三测试组，将样品蒸发至完全干燥(完全蒸发)，然后用40μL的30％MeOH复溶；或者蒸发至10μL体积(部分蒸发)，然后用30μL的30％MeOH稀释至总最终体积为40μL。所有样品都含有相同量的分析物，并且最终有机物含量为30％MeOH。
图2：标准稀释工作流程(顶部)以及完全和部分蒸发工作流程(底部)的示意图，经过优化以最大限度地提高检测灵敏度和色谱性能。还描绘了图1(中部)中使用的完整蒸发工作流程。所有工作流程都通过混合150μL样品和内标、添加预处理以从结合蛋白中释放分析物、通过抗体涂覆的磁珠富集分析物以及通过用水洗涤两次来最大程度地减少未结合的基质组分来进行。使用60μL或150μL的80％MeOH洗脱缓冲液释放分析物，然后将40μL或130μL洗脱液分别转移到新的反应容器中用于标准和蒸发工作流程。在正常工作流程中，40μL洗脱液用67μL水稀释，而对于蒸发工作流程，样品蒸发至完全干燥(完全蒸发)或蒸发至20至40μL(部分蒸发)，并且样品可选择地用水稀释以提供40μL的最终体积。对于所有工作流程，注入20μL用于LC-MS分析。
图3和图4：UniDil中加标的2pg/mL雌二醇的提取离子色谱图，以比较标准工作流程(图3)和优化的部分蒸发工作流程(图4)。使用蒸发测定可以清楚地检测到分析物色谱峰，但不能使用标准测定。
图5和图6：标准工作流程和优化的蒸发工作流程(A)的分析物/ISTD峰面积比相同，并且分析物峰面积和分析物浓度的线性拟合表明蒸发工作流程对加标到UniDil中的雌二醇(图5)和对加标到Golden West Serum中的睾酮(图6)具有更高的斜率(B)。
实例
材料和方法
分析物特异性磁性免疫珠的生产
为了生产涂覆有分析物特异性抗体的磁珠(免疫珠)，使用了链霉抗生物素蛋白珠悬浮液，并且珠状物涂覆有分析物特异性抗体。对于涂层，使用磁力分离法分离磁珠(1mg/ml)，用PBS缓冲液洗涤珠状物并涡旋。洗涤重复两次。在最后的洗涤步骤之后，去除上清液并将包含针对分析物的生物素标记的抗体的溶液添加到珠状物。以与珠状物体积相等的体积添加相应的抗分析物抗体溶液(50μg/ml)，并将混合物在4℃培养过夜。最后，使用PBS进行三个洗涤步骤以去除未结合的抗体。将洗涤过的珠状物重新悬浮在相当于珠子原始体积的体积中，以确保最终浓度为1mg/mL。
为了生产睾酮特异性磁性免疫珠，将生物素标记的单克隆抗睾酮抗体偶联到珠状物。为了生产雌二醇特异性磁性免疫珠，将生物素标记的单克隆抗雌二醇抗体偶联到珠状物。
样品
在本发明的上下文中，采用了不同的样品。样品特别包括加标有规定量的相应分析物的溶液。在相应的实例中指定了相应分析物被加标的基质。整个实例中使用的基质包括60vol％MeOH溶液、UniDil和Golden West Serum(Golden West Diagnostic LLC；Cat.Numb.MSG4000)。
用于定量质谱的内标
作为内标，使用了各个分析物的重同位素标记同位素。为了检测睾酮，使用了13C3-睾酮(来自Cerilliant)。对于雌二醇的定量，采用了13C3-Estradiol(来自Cerilliant)。如果没有另外说明，在预处理和基于免疫珠的固相萃取之前，将10μl的10ng/ml内标溶液加标到150μl的样品体积中。
样品预处理
以下实例中使用的分析物是类固醇。在诸如血清或血浆样品的环境中，类固醇可能会被结合蛋白结合。因此，在通过基于免疫珠的固相萃取富集分析物之前，进行了预处理以从结合蛋白中释放类固醇。对于预处理，将50μl的30vol％MeOH水溶液添加到150μl样品中，并通过涡旋混合样品。
基于免疫珠的分析物固相萃取
为了提取和/或富集样品中的分析物，执行了基于免疫珠的固相萃取。为此，将分析物特异性磁性免疫珠(见上文)添加到加标有内标的预处理样品中。具体而言，加入40μl1mg/mL溶液。将混合物涡旋并在37℃下培养7.5min，以允许分析物与珠状物结合。随后，将珠状物用200μl水洗涤两次或三次。最后，使用80％甲醇水洗脱液从珠状物洗脱分析物。对于涉及后续蒸发步骤(全部或部分)的实验，使用150μl的洗脱溶液体积。60μl洗脱溶液体积用于无蒸发的工作流程。对于洗脱，在最后一次洗涤步骤后通过磁力分离磁珠，去除上清液，将洗脱溶液加入到珠状物，将珠状物和洗脱溶液的混合物涡旋并在37℃培养2min。最后，通过磁力分离珠状物，将130μl(包括蒸发的工作流程)或40μl(没有蒸发的工作流程)包含分析物的洗脱上清液(也称为固相萃取提取物)去除并用移液器吸取到新容器中。
回收的洗脱液随后经受蒸发(全部或部分；见下文)或在不涉及蒸发的工作流程中，使用LC-DIL将40μl回收的洗脱液稀释至最终体积107μl。
蒸发
基于免疫珠的SPE或加标溶液的洗脱液的蒸发是通过使用定制设备施加真空并在50至100℃下加热来进行的。如果没有另外说明，起始体积为130μl。
为了完全蒸发，将样品蒸发至干燥。随后使用涡旋将剩余的沉淀物溶解在40μlLC-DIL中。
对于部分蒸发，进行蒸发直至剩余20至40μl的最终溶剂体积。使用LC-DIL将样品进行LC-MS之前的最终体积调整为40μl(如果需要)。
与MS联用的高效液相色谱法(HPLC)
使用Agilent 1200 Infinity II LC系统(德国瓦尔德布龙)以及PAL LC进样和自动进样器系统(瑞士茨温根)执行高效液相色谱法(HPLC)。该仪器经由AB Sciex的Analyst设备驱动程序进行控制。使用填充有来自ChromaNik(日本大阪)的SunShell 2.6μm熔融核颗粒的C18 HPLC柱(1.0或2.1mm内径x50mm)执行色谱分离。使用的LC溶剂为(A)水和(B)0.2mM NH4F的甲醇，使用的流速为440μl/min。通过在0.7至1.2min内从39％至60％的溶液B上升至90％至98％的溶液B来建立LC梯度。注入到LC-MS系统的体积为20μl，与样品制备工作流程(有或没有蒸发)无关。
质谱法(MS)
使用来自AB Sciex(德国达姆施塔特)的Triple Quad 6500+LC-MS/MS系统或类似的MS设备实施质谱检测。
用于测量睾酮的MS设置被选择为正模式，并且MS设置针对灵敏度进行了优化。用于测量雌二醇的MS设置被选择为负模式，并且也针对灵敏度进行了优化。
数据分析
MS系统使用优化的分析物设置和用于机器控制和数据分析的相关软件。通过高斯拟合对分析物选择性MRM转换的色谱峰进行积分，以生成分析物和内标的峰面积和信噪比(S/N)，并且直接从不同的工作流程(即稀释、部分蒸发和完全蒸发工作流程)中进行比较，以比较灵敏度增强或回收率。分析物/ISTD比率用于进一步评估LC-MS方法的精度和灵敏度，并比较不同的工作流程。
实例1：使用完全和部分蒸发浓缩纯样品中的睾酮
在这个实例中，比较了三种不同的处理加标样品的工作流程，然后再对它们进行LC-MS：(1)样品的稀释；(2)完全蒸发；和(3)部分蒸发。
具体而言，产生了在60vol％MeOH中含有60pg/ml睾酮的样品。这些样品模拟洗脱液/提取物，如通过从基于珠状物的SPE中洗脱获得，尤其是从基于免疫珠的SPE中获得，如下文所用和上述方法中所述。
对于经受稀释工作流程的样品，该样品用40μL H2O稀释至总最终体积为80μL。对于经受完全蒸发的样品，将样品蒸发至完全干燥，然后用40μL的30％MeOH复溶。对于用于部分蒸发的样品，将样品蒸发至10μL(部分蒸发)，然后用30μL的30％MeOH稀释至总最终体积为40μL。确保所有样品的最终有机物含量为30％MeOH。
最后样品经受了LC-MS并且测量了睾酮的信号强度(见图1A)基于将稀释工作流程的强度设置为100％，以百分比计算两个蒸发工作流程的睾酮回收率(见图1B)。
因为所有样品都含有相同量的分析物，所以完全蒸发和部分蒸发的样品预计都具有200％的分析物回收率。虽然完全蒸发和部分蒸发都实现了回收率的提高，但使用部分蒸发时分析物的回收率出人意料地显著提高。部分蒸发的另一个优点是蒸发过程的持续时间较短。缩短蒸发所需的时间变得很重要，特别是在自动化样品制备和LC-MS分析系统的环境下。
鉴于这些结果，选择部分蒸发用于进一步实例中所示的实验。每当这些实例和涉及它们的附图提及“蒸发”时，这涉及上述方法中描述的“部分蒸发”。
实例2：用于检测雌二醇的MS样品制备工作流程中免疫珠洗脱液的部分蒸发与稀释
诊断MS测量通常不涉及纯样品，而是涉及复杂样品，该样品包含在有其他成分的复杂基质中的分析物，诸如基于血液的样品(例如血清或血浆)。为了测量这些样品，通常使用尽可能多地从剩余成分中纯化分析物的样品制备工作流程。为此，可以采用诸如SPE的方法。在本实例中，使用基于免疫珠的SPE，涉及用包含高有机溶剂(例如MeOH或乙腈)含量的洗脱溶液从珠状物洗脱分析物。这些高浓度的溶剂会干扰LC-MS系统和方法的LC分辨率，例如通过峰加宽。因此，SPE洗脱液通常在LC-MS之前稀释，以降低LC之前有机溶剂的浓度。然而，此类稀释会降低分析物浓度，并使检测初始样品中的低浓度更具挑战性，尤其是在包含复杂基质的样品中，这些样品通常显示出比纯样品更高的背景信号。
为了在整个MS工作流程的背景下比较部分蒸发与样品稀释的性能，执行整个MS工作流程的实验包括：(1)添加内标、(2)分析物的基于免疫珠的SPE、(3)部分蒸发或SPE洗脱液的稀释和(4)如上文材料和方法部分所述进行LC-MS。
经受稀释MS工作流程和蒸发MS工作流程的样品是150μl UniDil(Diluent Universal)，其中分别加标了0.5pg/ml、2pg/ml、5pg/ml、10pg/ml和15pg/ml的雌二醇。图2示意性地描绘了稀释工作流程和使用的部分蒸发。
2pg/ml样品的稀释工作流程和部分蒸发工作流程得到的MS谱图分别如图3和图4所示。
从图3可以明显看出，使用稀释工作流程，在此特定实验中无法检测到雌二醇信号。
相比之下，使用部分蒸发工作流程可以清楚地检测到雌二醇信号(见图4)，表明使用部分蒸发工作流程可提高灵敏度。
因此，该实验表明，即使在更复杂的基质中和在多步骤样品制备工作流程的背景下测量分析物时，部分蒸发也可以提高信噪比和分析物检测灵敏度(定量下限)以提供高度纯化的分析物样品，然后进行高分辨率LC分离。
图5B描绘了针对分析物浓度绘制的部分蒸发工作流程和稀释工作流程的信号强度。该图说明，对于每个分析样品，部分蒸发工作流程的信号(峰面积)在稀释工作流程中有所增加。进一步，对于这两种工作流程，在高于LoQ的分析浓度范围内均实现了线性测量范围。然而，部分蒸发工作流程显示出更高的线性斜率。增加的斜率是一个明显的优势，因为给定浓度差异的信号动态增加，并且因此可以增加精度。
图5A显示了在测量的分析物浓度下分析物信号与内标(ISTD)的比率。对于稀释和部分蒸发工作流程，比率是类似的，并且在测量的浓度范围内以相同的斜率线性增加。
实例3：用于检测睾酮的MS样品制备工作流程中免疫珠洗脱液的部分蒸发与稀释
使用加标有浓度为25pg/ml、150pg/ml和250pg/ml的分析物睾酮的Golden WestSerum样品重复部分蒸发工作流程与稀释工作流程之间的比较。
如上文实例2所示，整个MS工作流程包括：(1)添加内标、(2)分析物的基于免疫珠的SPE、(3)SPE洗脱液的部分蒸发或稀释和(4)按照上述材料和方法部分的规定进行LC-MS。
经受稀释MS工作流程和蒸发MS工作流程的样品是150μl Golden West Serum，分别加标有25pg/ml、150pg/ml和250pg/mL睾酮。图2示意性地描绘了稀释工作流程和使用的部分蒸发。
图6B描绘了针对分析物浓度绘制的部分蒸发工作流程和稀释工作流程的信号强度。该图说明，对于每个分析样品，部分蒸发工作流程的信号(峰面积)在稀释工作流程中有所增加。此外，对于这两种工作流程，在高于定量极限(LOQ)的分析浓度范围内均实现了线性测量范围。然而，部分蒸发工作流程显示出更高的线性斜率。增加的斜率是一个明显的优势，因为给定浓度差异的信号动态增加，并且因此可以增加精度。
图6A显示了在测量的分析物浓度下分析物信号与内标(ISTD)的比率。对于稀释和部分蒸发工作流程，比率是类似的，并且在测量的浓度范围内以相同的斜率线性增加。
该专利申请请求欧洲专利申请20215190.8的优先权，其中该欧洲专利申请的内容通过引用并入本文。

Claims (12)

1.一种使用质谱法来检测和/或定量样品中的分析物的方法，所述方法包括：
a)使用固相萃取(SPE)从所述样品中提取所述分析物以获得包含所述分析物的SPE提取物，其中所述SPE提取物包含50vol％至100vol％的有机溶剂，其中所述分析物是类固醇，优选地选自由睾酮和雌二醇组成的组；
b)浓缩所述分析物，所述浓缩包括从a)中获得的所述SPE提取物中部分蒸发所述溶剂；其中经受所述部分蒸发的所述SPE提取物的体积减少了50％至95％，优选地减少了60％至90％，更优选地减少了70％至80％；
b1)用稀释溶剂来稀释从步骤b)获得的浓缩分析物以获得稀释的分析物，其中所述稀释的分析物在步骤c)之前包含小于50vol％的所述有机溶剂或另外的有机溶剂；并且
c)使用质谱法来检测和/或定量所述样品中的所述分析物，其中所述质谱法是与液相色谱法(LC-MS)联用的质谱法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括使用稀释溶液将部分蒸发后的所述体积调节至对应于a)中经受所述SPE的所述样品的体积的5％至40％、在一个实施例中为10％至30％、在一个实施例中为13％至27％的最终体积。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中在a)中经受所述SPE的样品体积为250μl或更少，在一个实施例中为200μl或更少，在一个实施例中为150μl或更少，在一个实施例中为150μl。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述有机溶剂选自由乙腈和甲醇组成的组。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述样品是流体，特别是生物流体，特别是血清或血浆。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用于从分析物结合蛋白释放所述分析物的预处理步骤。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中用于所述SPE的固相由磁性颗粒，特别是磁性微珠形成。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述SPE的所述固相由包被有特异性结合所述分析物的抗体的颗粒形成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述固相萃取(SPE)包括：
a)将所述分析物捕获到所述固相；
b)任选地对所述固相的一个或多个洗涤步骤；并且
c)从所述固相中洗脱所述分析物以获得包含所述分析物的所述SPE提取物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所添加的洗脱溶剂的体积对应于经受SPE的所述样品体积的50％至150％、在一个实施例中为经受SPE的所述样品体积的90％至120％、在一个实施例中为经受SPE的所述样品体积的100％。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤a)之前向所述样品添加用于定量的内标(ISTD)。
12.根据权利要求1至11所述的方法，其中所述液相色谱法(LC)是HPLC或快速LC，其中在一个实施例中，所述HPLC是微型LC(μLC)和/或超高效液相色谱法(UHPLC)。
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