CN112924569B

CN112924569B - 一种胆南星定量指纹图谱质量监测方法

Info

Publication number: CN112924569B
Application number: CN201911241753.0A
Authority: CN
Inventors: 梁鑫淼; 乔亚丽; 沈爱金; 徐青; 刘艳芳; 郭学东; 陈相银; 张红莲
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2019-12-06
Filing date: 2019-12-06
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2039-12-06
Also published as: CN112924569A

Abstract

本发明涉及一种胆南星定量指纹图谱质量监测方法，属于中药质量分析领域。本发明基于高效液相色谱串联紫外检测器和电雾式检测器(Charged Aerosol Detector,CAD)，同时监测胆南星中天南星来源和胆汁来源的化学成分，并实现胆汁中多指标胆汁酸类成分的定量检测。本发明通过一次分析可同时进行定性定量，从而对胆南星品质高低及所用原料药天南星的真伪做出评价，对胆南星的质量规范及用药安全均具有重大意义。

Description

一种胆南星定量指纹图谱质量监测方法

技术领域

本发明涉及一种胆南星定量指纹谱质量监测方法，属于中药质量分析领域。

技术背景

胆南星为制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成，或为生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成，常用于治疗痰热咳嗽、稠、中风痰迷、癫狂惊痫等症。胆南星的生产过程中，天南星的种类、胆汁的用量及炮制方式均会影响产品的最终质量。就天南星而言，与天南星生源关系相近的虎掌南星(天南星科半夏属)，自明、清以来与“天南星”混用，至今市场上流通的天南星药材多数仍是“虎掌”[汪荣斌,长春中医药大学学报,2010,26(4),590-592]。另外，天南星生品有毒，经胆汁炮制过后毒性下降、药性改变，方有息风定惊、消化热痰之效。经药理学研究，胆汁本身也有镇静、安神、镇咳及抗炎等与胆南星相匹配的功效，且古人认为“胆星，意不重南星而重胆汁，借星以收取汁用，非如他药监制也，故九制则纯。”，故现代工艺普遍认为胆汁比例高者胆南星品质优。另一方面，胆南星的炮制方法直接影响其中胆汁类成分的存在形式，如发酵法制得的胆南星中游离型猪去氧胆酸及鹅去氧胆酸为主要成分，而混合蒸制法制得的胆南星中结合型甘氨猪去氧胆酸和甘氨鹅去氧胆酸为主要成分[陈云,世界中医药,2019,14(2),283-286]。基于以上现状，建立全面有效的质量控制技术，同时实现胆南星中天南星和胆汁类成分的质量监测和评价，对于保障胆南星的药效和安全性具有重大的意义。

《2015版中国药典》对胆南星的质量控制主要通过性状鉴别和糠醛显色反应，难以真实有效地反映胆南星中天南星及胆汁酸类成分的整体质量。《北京市中药饮片炮制规范》通过多次回流提取和萃取，测定胆南星中总胆酸的含量。文献中采用HPLC-CAD或HPLC-ELSD方法对一个或多个胆汁酸类成分进行定量分析[蔡宇忆,广东药学院学报,2016,32,311-314；王光函,亚太传统医药,2014,10,8-9；赵启苗,中国实验方剂学杂志,2017,23,28-31]，陈云等针对胆南星胆汁酸类成分建立了HPLC-ELSD特征指纹谱和薄层鉴别法，为胆南星质量控制提供了一定的依据[陈云,世界中医药,2019,14,283-286+291]。尽管如此，现有研究均集中于胆南星中胆汁来源的化学成分，未涉及天南星来源成分的有效控制。同时，现有检测技术主要采用蒸发光散射检测器，灵敏度较低，检测的胆汁酸类成分十分有限。因此，建立高效的质量监测方法，系统全面地评价胆南星的质量十分重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于胆南星质量监测的定量指纹图谱方法。本发明基于高效液相色谱、紫外检测器、电雾式检测器(Charged Aerosol Detector,CAD)串联技术，建立了胆南星的定量指纹图谱分析方法，同时监测胆南星中天南星和胆汁来源的化学成分，并实现多种胆汁酸类成分的定量检测，从而对不同厂家、不同批次胆南星做出全面评价。

本发明所提供的技术方案其特征在于包括如下步骤：

1.样品供试液制备：取胆南星样品，捣碎打粉，过20～60目筛，称取粉末0.5～2mg，置于125mL具塞锥形瓶，加10～50倍体积提取剂，超声30min～90min，离心5～10min，取上清液过0.45μm孔径的尼龙滤膜，即得。

所用的提取剂为：体积浓度50％～100％甲醇/水或50％～100％乙醇/水。

2.色谱分析条件：色谱柱为Symmetry Shield RP18(4.6×250mm,5μm,

)或XBridge Shield RP18(4.6×250mm,5μm,

)；流速为0.7mL/min～1.3mL/min；柱温为25℃～45℃；流动相A为体积浓度0.2％～0.8％三氟乙酸/水溶液，流动相B为乙腈；梯度洗脱：0～15min，线性10％～36％B；15～50min，线性36％～65％B；50～60min，线性65％～95％B；60～70min，95％B。

3.色谱检测器：紫外检测器与电雾式检测器(Charged Aerosol Detector,CAD)串联，天南星来源成分采用紫外检测器进行检测，胆汁来源成分采用电雾式检测器进行检测；紫外检测采用双波长紫外检测器或多波长阵列式检测器，检测波长为330nm。

4.色谱峰指认：分别称取标准品甘氨胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸甲酯、维采宁-2、夏佛托苷和异夏佛托苷各1mg，体积浓度50～100％甲醇/水溶解稀释各标准品至0.02～5mg/mL浓度即可；相同条件下分别分析混合标准品和胆南星供试液，根据保留时间对各色谱峰进行指认。

5.定量检测环节中，混标液的配制方法为：精密称取约25mg各标准品于同一25mL容量瓶中，采用体积浓度50％～100％甲醇/水或50％～100％乙醇/水充分溶解后定容至刻度，得到对应混标液。

6.定量检测环节中，稀释液的配制方法为：分别取步骤5所述混标液5mL、3mL、2mL、1mL、0.5mL、0.25mL于10mL容量瓶，加体积浓度50％～100％甲醇/水或50％～100％乙醇/水稀释至刻度，得浓度点1、2、3、4、5、6。

7.胆汁酸类成分的定量分析过程为：将步骤6中不同浓度的稀释液按浓度由低到高依次进样分析，以体积浓度(mg/mL)的lg值为横坐标、峰面积(pA*min)的lg值为纵坐标，绘制各标准品的标准曲线；相同色谱条件下分析胆南星样品，将峰面积带入到对应的标准曲线，即得供试品溶液中的体积浓度(mg/mL)，结合样品浓度可计算得到每克胆南星样品中所含胆汁酸类成分的质量，即质量浓度(mg/g)。

8.不同厂家和/或不同批次胆南星样品的质量评价，包括胆南星的品质高低评价及原料药天南星真伪评价。以是否可同时检测到维采宁-2、夏佛托苷、异夏佛托苷三种物质的紫外色谱峰作为评价胆南星所用天南星为正品或伪品的标准，胆南星所用天南星为真品时可以同时检测到维采宁-2、夏佛托苷、异夏佛托苷三种物质的紫外色谱峰，否则为伪品。胆南星品质高低的评价标准为甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的总含量，当四种物质的总含量大于等于8mg/g时品质等级为优质，小于8mg/g时品质等级为统货或普货。

本发明的优点如下：

1.本发明首次建立了胆南星的定量指纹图谱方法。

2.本发明首次利用两种类型检测器串联，同时获得胆汁来源成分及天南星来源成分的指纹图谱，对胆南星质量进行全面的监测。

3.本发明首次采用电雾式检测器实现胆南星中多指标胆汁酸类成分的定量分析。

4.本发明首次对不同来源多批次胆南星做出综合性质量分析，包括胆南星的品质高低评价及原料药天南星真伪评价。

附图说明

图1a为使用实施例1胆南星、伪品胆南星和猪胆汁的CAD对比色谱图。其中，F1：甘氨猪去氧胆酸、F2：胆酸、F3：甘氨鹅去氧胆酸、F4：猪去氧胆酸、F5：鹅去氧胆酸、F6：去氧胆酸、F7：猪去氧胆酸甲酯。

图1b为使用实施例1伪品胆南星、虎掌南星、胆南星及天南星的紫外对比色谱图(330nm)。其中，F1：维采宁-2、F2：夏佛托苷、F3：异夏佛托苷。

图2为使用实施例2胆南星的紫外指纹谱及CAD指纹谱。

图3为使用实施例3胆南星的紫外指纹谱及CAD指纹谱。

图4为使用实施例4胆南星的紫外指纹谱及CAD指纹谱。

图5为使用实施例5胆南星方法学验证的仪器精密度色谱图(CAD)。其中，F1～F14为共有峰。

图6为使用实施例8不同厂家胆南星样本对比紫外色谱图(330nm)。其中，其中，F1：维采宁-2、F2：夏佛托苷、F3：异夏佛托苷。

图7为使用实施例8不同厂家胆南星样本对比CAD色谱图。其中，F1：甘氨猪去氧胆酸、F2：甘氨鹅去氧胆酸、F3：猪去氧胆酸、F4：鹅去氧胆酸

具体实施方式

下面结合实例，对本发明的技术方案作进一步解释和说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

仪器：Thermo Ultimate 3000超高效液相色谱仪(三元梯度泵，真空脱气装置，二极管阵列检测器，电喷雾检测器，自动进样器，柱恒温系统，Chromeleon色谱工作站)

试剂：乙腈(色谱纯，MERYER)，甲醇(色谱纯，MERYER，中国)，三氟乙酸(色谱纯，Sigma-Aldrich)，实验用水为Mill-Q纯水系统生成；其余试剂均为分析纯。

对照品：供含量测定甘氨猪去氧胆酸(含量：97％；批号：Y24O7K23300，上海源叶生物科技有限公司)；甘氨鹅去氧胆酸(含量：98.9％；批号：29837，MedChemExpress)；猪去氧胆酸(含量：99.7％；批号：100087-200610，中国食品药品检定研究院，供含测用)；鹅去氧胆酸(含量：91.7％；批号110806-201708，中国食品药品检定研究院，供含测用)。

色谱峰定性对照品：甘氨胆酸购于上海麦克林生化科技有限公司，去氧胆酸购于中国药品生物制品检定所，猪去氧胆酸甲酯购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。夏佛托苷、异夏佛托苷和维采宁-2均购自成都普瑞法科技开发有限公司。

样品：天南星、虎掌南星均由厂家A提供；胆南星样品来源、品质及所用天南星真伪见表1。实验室自制胆南星及伪品胆南星的炮制工艺，包括胆汁比例、炮制方式，均与厂家A保持一致。

表1胆南星样品统计

样品名称	样品来源	品质等级	天南星真伪
				L1	实验室自制	优质	真
L2	实验室自制	优质	真
				L3	实验室自制	优质	真
L4	实验室自制	优质	真
				L5	实验室自制	伪品	虎掌南星
A1	厂家A	优质	不明
				A2	厂家A	优质	不明
A3	厂家A	优质	不明
				A4	厂家A	优质	不明
B1	厂家B	统货	不明
				B2	厂家B	优质	不明
B3	厂家B	优质	不明
				C1	厂家C	优质	不明
C2	厂家C	统货	不明
				D1	厂家D	未分级	不明
E1	厂家E	未分级	不明
				F1	厂家F	未分级	不明
G1	厂家G	未分级	不明

实施例1

实施方法

1.分析条件：

仪器：Thermo Ultimate 3000

色谱柱：Symmetry Shield RP18(Waters,4.6×250mm,5μm,

)

流速：1.0mL/min

柱温：30℃

进样量：10μL

检测波长：330nm

流动相：A.0.5％三氟乙酸/水B.乙腈

梯度：

2.样品制备

1)胆南星供试品溶液制备：取胆南星样品L1，捣碎打粉，过50目筛，称取粉末1mg，置于125mL具塞锥形瓶，加25mL体积浓度70％甲醇/水，超声30min。5000rmp离心五分钟，取上清液过0.45μm孔径的尼龙滤膜，即得。

2)天南星阴性对照品溶液制备方法同胆南星。

3)虎掌南星阴性对照品溶液制备方法同胆南星。

4)伪品胆南星阴性对照品溶液制备方法同胆南星。

5)猪胆汁阴性对照品溶液制备方法：取猪胆汁1mL，加入9mL体积浓度70％甲醇/水进行稀释，5000rmp离心五分钟，取上清液过0.45μm孔径的尼龙滤膜，即得。

3.混合标准品溶液配制：分别精密称取胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸甲酯、维采宁-2、夏佛托苷和异夏佛托苷约1mg，体积浓度70％甲醇/水稀释至1mg/mL。

4.根据对照品溶液的分析结果对胆南星CAD色谱峰、紫外色谱峰进行峰指认，并分别与猪胆汁、天南星、虎掌南星、伪品胆南星进行对比。

5.胆南星、伪品胆南星及猪胆汁CAD对比色谱图及色谱峰指认结果见图1a，游离型胆汁酸猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸在胆汁中不存在，是结合型胆汁酸经炮制后的产物。值得注意的是，胆南星和伪品胆南星的胆汁酸类成分无差异。

6.胆南星、伪品胆南星、天南星及虎掌南星紫外对比图及其色谱峰指认结果见图1b(330nm)。经过炮制，天南星及虎掌南星中的维采宁-2、夏佛托苷和异夏佛托苷三种成分含量均明显下降，胆南星中但仍可检测到三种成分，伪品胆南星中仅可检测到前一种成分。而且，胆南星指纹谱整体轮廓与伪品胆南星差异性显著。因此，胆南星紫外指纹谱(330nm)可用于其中原药材天南星的真伪鉴别。

实施例2

1.分析条件：

仪器：Thermo Ultimate 3000

色谱柱：Symmetry Shield RP18(Waters,4.6×250mm,5μm,

)

流速：1.1mL/min

柱温：30℃

进样量：10μL

检测波长：330nm

流动相：A.0.5％三氟乙酸/水B.乙腈

梯度：

2.供试品溶液制备：取胆南星样品L1，捣碎打粉，过50目筛，称取粉末1mg，置于125mL具塞锥形瓶，加50mL体积浓度70％乙醇/水，超声30min。5000rmp离心五分钟，取上清液过0.45μm孔径的尼龙滤膜，即得。

3.胆南星紫外指纹谱及CAD指纹谱见图2，与实施例1相比，色谱峰保留时间变短，色谱峰整体轮廓整体不变。

实施例3

胆南星样品分析。流动相A为体积浓度0.4％三氟乙酸/水溶液，其余分析条件同实施例1；供试液制备方法同实施例1，胆南星紫外指纹及CAD指纹谱见图3。

实施例4

胆南星样品分析。柱温为25℃，其余分析条件同实施例1；供试液制备同实施例1，胆南星紫外指纹及CAD指纹谱见图4。

实施例5

实施方法

1、仪器精密度

依照实施例1所述供试品溶液制备方法及分析条件，制备一份胆南星供试品溶液，连续进样6次，记录色谱指纹图，如图5所示。以甘氨鹅去氧胆酸(F11)为参照峰，考察各共有峰(F1～F14)与参照峰(F11)的相对保留时间(RRT)和相对峰面积(RA)。

结果表明，各主要共有峰的相对保留时间无明显变化，其相对标准偏差(RSD)在0.017％～0.042％。相对峰面积的RSD在0.531％～3.790％，表明仪器精密度良好。

表2胆南星指纹峰相对保留时间(RRT)(仪器精密度)

表3胆南星指纹峰相对峰面积(RA)(仪器精密度)

2、日内重复性

依照实施例1所述供试品溶液制备方法及分析条件，制备六份胆南星供试品溶液进行分析，以甘氨鹅去氧胆酸(F11)为参照峰，考察各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积值。

结果表明，各主要共有峰的相对保留时间无明显变化，RSD在0.021％～0.049％，相对峰面积的RSD为0.903％～5.255％，表明该方法日内重复性良好。

表4胆南星指纹峰相对保留时间(RRT)(日内重复性)

表5胆南星指纹峰相对峰面积(RA)(日内重复性)

3、日间重复性

依照实施例1所述供试品溶液制备方法及分析条件，连续三天，每天各制备胆南星供试品溶液2份并进行分析，以甘氨鹅去氧胆酸(F11)为参照峰，考察各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积值。

结果表明，各主要共有峰的相对保留时间无明显变化，RSD在0.02％～0.21％，相对峰面积的RSD为0.56％～3.33％，表明该方法日间重复性良好。

表6胆南星指纹峰相对保留时间(RRT)(日间重复性)

表7胆南星指纹峰相对峰面积(RA)(日间重复性)

4、样品稳定性

依照实施例1所述供试品溶液制备方法及分析条件，制备胆南星供试品溶液，分别于制备后0、2、6、8、10、12、24h进样分析，以甘氨鹅去氧胆酸(F11)为参照峰，考察各共有峰与参照峰的相对保留时间和相对峰面积值。

结果表明，各主要共有峰的相对保留时间无明显变化，RSD在0.00％～0.04％，相对峰面积的RSD为0.85％～4.2％，表明样品在一天之内状态稳定。

表8胆南星指纹峰相对保留时间(RRT)(稳定性)

表9胆南星指纹峰相对峰面积(RA)(稳定性)

实施例6

实施方法

1、标准曲线的建立

1)标准品：鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸。

2)标准溶液的配制

储备液的配制：分别精密称取鹅去氧胆酸(含量：91.7％)和猪去氧胆酸(含量：99.7％)25mg于同一25mL容量瓶中，加入体积浓度70％甲醇/水充分溶解后定容至刻度，即得储备液。

标准溶液的配制：移取上述储备液20mL于25mL容量瓶中，加入体积浓度70％甲醇/水定容至刻度并摇匀，得标准溶液1；分别移取5mL、3mL、2mL、1mL、0.5mL、0.25mL溶液1于10mL容量瓶，体积浓度70％甲醇/水定容至刻度，即得标准溶液2、3、4、5、6、7。

3)标准溶液分析：将标准溶液按浓度由低到高依次进样分析，分析条件同实施例1。

4)标准曲线：以体积浓度为x,峰面积值为y。

表10猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸标准曲线

2、仪器精密度

依照实施例1所述供试品溶液制备方法及分析条件，制备一份胆南星供试品溶液，连续进样6次。结果表明，猪去氧胆酸含量的RSD为1.70％，鹅去氧胆酸的RSD为2.49％，结果显示仪器含量测定的精密度良好。

表11胆南星中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量(精密度)

3、日内重复性

依照实施例1所述供试品溶液制备方法及分析条件，平行制备六份供试品溶液并进样分析。结果表明，猪去氧胆酸含量的RSD为1.07％，鹅去氧胆酸的RSD为3.41％，胆南星供试品含量测定的日内重复性良好。

表12胆南星中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量(日内重复性)

4、日间重复性

依照实施例1所述供试品溶液制备方法及分析条件，连续三天，每天平行制备两份胆南星供试品溶液并进样分析。结果表明，猪去氧胆酸含量的RSD为3.62％，鹅去氧胆酸的RSD为1.68％，胆南星供试品含量测定的日间重复性良好。

表13胆南星中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量(日间重复性)

5、稳定性

依照实施例1所述供试品溶液制备方法及分析条件，制备胆南星供试品溶液，并于制样后0、2、6、8、10、12、24h进样分析。结果表明，猪去氧胆酸含量的RSD为3.62％，鹅去氧胆酸的RSD为1.68％，表明胆南星供试品在24h内的含量测定稳定性良好。

表14胆南中猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸的含量(稳定性)

6、加标回收率

不加标溶液：取胆南星粉末2份，各200mg于10mL容量瓶中，加入5mL体积浓度70％甲醇/水，超声提取0.5小时，取上清液过0.45μm孔径的尼龙滤膜即得未加标供试品，按实施例1分析条件进样分析，记录指纹图谱，记为不加标1，2。

加标溶液：取胆南星粉末6份，各200mg于10mL容量瓶中，分别加入体积浓度70％甲醇/水5mL、混合标准品溶液(猪去氧胆酸2mg/mL、鹅去氧胆酸2mg/mL)100μL，超声提取0.5小时，取上清液过0.45μm孔径的尼龙滤膜即得加标供试品，按实施例1色谱条件进样分析，记录指纹图谱，记为加标1，2，3，4，5，6。

对两次的不加标结果进行平均处理，猪去氧胆酸含量为1.80mg/g，鹅去氧胆酸含量为1.36mg/g。猪去氧胆酸的平均加标回收率为119.63％，RSD为2.42％；鹅去氧胆酸的平均加标回收率为107.98％，RSD为3.82％，加标实验的结果较好。

表15加标回收率统计表

针号	猪去氧胆酸(％)	鹅去氧胆酸(％)
			加标1	114.34	99.91
加标2	122.25	111.14
			加标3	119.17	110.74
加标4	119.58	109.27
			加标5	122.19	108.88
加标6	120.27	107.96
			Average	119.63	107.98
SD	2.899	4.129
			RSD	2.42％	3.82％

实施例7

实施方法

甘氨猪去氧胆酸及甘氨鹅去氧胆酸标准曲线的建立：

1.仪器及色谱条件同实施例1。

2.标准溶液的配制：

储备液：分别精密称取甘氨猪去氧胆酸(含量：97％)、甘氨鹅去氧胆酸(含量：98.9％)25mg于同一25mL容量瓶中，加入体积浓度70％甲醇/水充分溶解后继续定容至刻度，得储备液。

标准溶液：分别移取上述储备液5mL、3mL、2mL、1mL、0.5mL、0.25mL于10mL容量瓶，加入体积浓度70％甲醇/水定容至刻度，即得标准溶液1，2，3，4，5，6。

3.标准溶液分析：将标准溶液按浓度由低到高依次进样分析，分析条件同实施例1。

4.标准曲线：以体积浓度为x,峰面积值为y。

表16甘氨猪去氧胆酸及甘氨鹅去氧胆酸的标准曲线

实施例8

1.依照实施例1所述供试液制备方法分别制备自于7个厂家不同批次的胆南星样品的供试液，并按照实施例1所述分析方式对其进行色谱分析，所得紫外图谱及CAD图谱分别见图6、图7。

2.如图6所示，A1～A4、D1、E1、B2样品所用天南星明显为伪品，B1、B3样品所用天南星为真，C1、C2、F1、G1所用天南星存在掺伪现象。由以上可知，目前市场上胆南星所用生药材天南星掺伪严重，即使同一厂家(C厂家)样品，所用药材的一致性也难以保证。

3.如图7所示，对于样品A1～A4、B1及E1，结合型胆汁酸甘氨猪去氧胆酸及甘氨鹅去氧胆酸含量明显高于游离性猪去氧胆酸及鹅去氧胆酸；对于样品B2、B3、C2、G1、F1及D1，结合型胆汁酸甘氨猪去氧胆酸及甘氨鹅去氧胆酸含量明显低于游离性猪去氧胆酸及鹅去氧胆酸；对于样品C1，结合型胆汁酸甘氨猪去氧胆酸及甘氨鹅去氧胆酸含量与游离性猪去氧胆酸及鹅去氧胆酸含量相近。对于不同厂家的差异性，推测其原因为由炮制方法不同。

4.根据CAD峰面积及相对应的标准曲线计算四种胆汁酸类成分在胆南星中的量，定量结果见表17。可知，当甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸总含量大于8mg/g时，品质等级属于优质，当小于8mg/g时，品质等级属于统货。由此可知市面上许多厂家的胆南星属于统货等级。

表17不同厂家四种胆汁酸类成分定量分析结果

Claims

1.一种胆南星定量指纹图谱质量监测方法，可同时实现胆南星中天南星和胆汁类成分的指纹图谱监测及多指标成分的定量检测，包括以下步骤：

1）胆南星样品供试液制备及色谱分析；

2）混合对照品溶液配制及色谱分析；标准品包括胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸甲酯、维采宁-2、夏佛托苷和异夏佛托苷；制备含有胆酸、甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸、猪去氧胆酸甲酯、维采宁-2、夏佛托苷和异夏佛托苷的混标液；将其色谱图与胆南星样品色谱图对比，对胆南星样品中的上述物质进行定性；

3）胆汁酸类成分的定量分析；配制含有甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸混标液1，取2份以上的部分混标液1并将其稀释成不同浓度的2个以上稀释液，将混标液1和稀释液分别进行色谱分析；配制含有猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的混标液2，取2份以上的部分混标液2并将其稀释成不同浓度的2个以上稀释液，将混标液2和稀释液分别进行色谱分析；分别以甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的峰面积lg值和体积浓度lg值为横纵坐标分别绘制它们的标准曲线；将胆南星样品色谱图中上述对应物质峰面积lg值代入上述标准曲线，获得体积浓度lg值，进一步计算获得其质量浓度；

4）不同厂家和/或不同批次胆南星样品的质量评价，包括胆南星的品质高低评价及原料药天南星真伪评价:

i.以步骤2）中是否可同时检测到维采宁-2、夏佛托苷、异夏佛托苷三种物质的紫外色谱峰作为评价胆南星所用天南星为正品或伪品的标准，胆南星所用天南星为真品时可以同时检测到维采宁-2、夏佛托苷、异夏佛托苷三种物质的紫外色谱峰，否则为伪品；伪品为虎掌南星；

ii.胆南星品质高低的评价标准为甘氨猪去氧胆酸、甘氨鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的总含量，当四种物质的总含量大于等于8 mg/g时品质等级为优质，小于8 mg/g时品质等级为统货或普货；所述胆南星样品供试液制备：取胆南星样品，捣碎打粉，过20~60目筛，称取通过筛子的粉末0.5~2 mg，置于容器中，按1mg粉末：10~50mL体积加入提取剂，超声30 min~90 min，离心5~10 min，取上清液过0.45 μm孔径的尼龙滤膜，即得；胆南星样品处理中用到的提取剂为：体积浓度50%~100%甲醇/水，或50%~100%乙醇/水；

所述色谱分析条件为：色谱柱为Symmetry Shield RP18 ，规格为：4.6×250 mm, 5 μm, 100 Å或XBridge Shield RP18，规格为：4.6×250 mm,5 μm, 100 Å；流速为0.7~1.3mL/min；柱温为25℃~45℃；流动相A为体积浓度0.2％~0.8%三氟乙酸/水溶液，流动相B为乙腈；洗脱梯度：0～15 min，线性10％～36％B；15～50 min，线性36％～65％B；50～60 min，线性65％～95％B；60～70 min，95％B；色谱检测方式为紫外检测器与电雾式检测器串联，天南星来源的化学成分采用紫外检测器进行检测，胆汁来源的化学成分采用电雾式检测器进行检测；紫外检测采用双波长紫外检测器或者多波长阵列式检测器，检测波长为330 nm。

2.如权利要求1所述的胆南星定量指纹图谱质量监测方法，其特征在于，步骤2）混合标准品溶液配制方式为：分别称取所述标准品各1 mg于同一容器中，用体积浓度50~100%甲醇/水溶解稀释各标准品至0.02~5 mg/mL浓度即可；色谱峰指认依据为，相同色谱条件下分析时保留时间一致。

3.如权利要求1所述的胆南星定量指纹图谱质量监测方法，步骤3）混标液的配制方法为：称取约25 mg各标准品于同一25 mL容量瓶中，采用体积浓度50%~100%甲醇/水，或50%~100%乙醇/水充分溶解后定容至刻度，得混标液；稀释液的配制方法为：分别移取所述的混标液5 mL、3 mL、2 mL、1 mL、0.5 mL、0.25 mL于10 mL容量瓶，加体积浓度50%~100%甲醇/水或50%~100%乙醇/水稀释至刻度，得浓度点1、2、3、4、5、6。

4.如权利要求1所述的胆南星定量指纹图谱质量监测方法，胆汁酸类成分的定量分析过程为：步骤3）中，将不同浓度的稀释液按浓度由低到高依次进样分析，以浓度mg/mL的lg值为横坐标、峰面积pA*min的lg值为纵坐标，绘制各标准品的标准曲线；相同色谱条件下分析胆南星样品，将峰面积带入到对应的标准曲线，即得供试品溶液中的体积浓度mg/mL，结合样品浓度可计算得到每克胆南星样品中所含胆汁酸类成分的质量，即质量浓度mg/g。