CN108717096A - 一种鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星的方法 - Google Patents

一种鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星的方法 Download PDF

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Abstract

一种鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星的方法，通过猪胆酸（HCA）、猪去氧胆酸（HDCA）和鹅去氧胆酸（CDCA）作为一组标志物，以及甘氨猪去氧胆酸（GHDCA）和甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）作为另一组标志物，在鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星中的应用。该方法提供了利用薄层色谱法及高效液相色谱法鉴别猪胆汁炮制的胆南星中的胆汁酸类成分，两种方法均可简单、快捷的鉴别猪胆汁炮制的胆南星的不同炮制品，且能更好地控制胆南星的质量。本发明的鉴别方法，具有较强的专属性和良好的重现性。

Description

一种鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星的 方法
技术领域
本发明属于中药饮片质量评价领域，具体涉及一种鉴别猪胆汁炮制的发酵制和混合蒸制胆南星的方法。
背景技术
胆南星是一味应用历史悠久的传统发酵制剂，通过一定的工序加工制成，历代一直沿用至今，是临床上常用药之一。《中国药典》(2015版)记载的“胆南星”为制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成，或为生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成。具有清热化痰，息风定惊的功能，用于痰热咳嗽，咯痰黄稠，中风痰迷，癫狂惊痫。现代药理研究表明胆南星具有镇静催眠作用，可抗戊四氮引起的小鼠惊厥；有报道称其具有抗氧化活性、抗炎活性。临床应用多见入复方，少见有单味药应用。成方抱龙丸、琥珠抱龙丸、牛黄镇惊丸、小儿太极丸、清气化痰丸、小儿保元丹、至宝锭等配方中，均配有胆南星。
由于胆南星的药用物质基础研究很少，与传统理论相对应的有效成分又尚不明确。胆南星的炮制品主要有两种，即发酵制品和混合蒸制品，现市场上流通的这两种炮制品均作为胆南星使用。由于目前全国各地胆南星的炮制方法均不统一，炮制过程的操作差异不大，主要差异在于炮制过程中原药材与胆汁的比例和炮制时间的长短，例如：《浙江省中药炮制规范》(2005版)中每100kg制天南星用胆汁250kg，蒸30分钟或发酵3～4天；《四川中药饮片炮制规范》(2002版)中每100kg制天南星用胆汁600kg，未规定炮制时间。可见全国各地的炮制规范存在一定的差异，药典中对胆南星的两种炮制方法仅有简单描述，并未规定具体的炮制工艺参数。因此，导致市场上胆南星的炮制品质量参差不齐。在《全国中药炮制规范》(1988版)中规定：发酵胆南星：取适量天南星及猪胆汁，以1：4比例混合后置于烧杯中，35℃±2℃水浴放置，每天早晚搅拌，10天后烧杯置沸水浴加热，再连续隔水炖9天，每隔2小时搅拌一次，去除腥臭气，水浴挥发至干后，置60℃干燥。混合蒸制胆南星：以制天南星与胆汁1:4的比例混合拌匀，蒸60分钟至透。取出放凉。制成小块，干燥。
古代文献《药品化义》：“胆星，意不重南星而重胆汁，借星以收取汁用，非如他药监制也，故九制则纯。《本草》言其功如牛黄者，即胆汁之精华耳。”可见胆南星的炮制与胆汁密切相关。猪胆汁中含有丰富的猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)、甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)。迄今，未见有利用不同胆汁酸类成分来鉴别胆南星的不同炮制品的相关研究。因此选择胆汁酸类成分猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)、甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)作为胆南星的指标成分，通过这五种胆汁酸类成分的薄层鉴别及高效液相色谱法来鉴别猪胆汁炮制的胆南星的不同炮制品。
本发明将对以猪胆汁炮制的发酵胆南星和混合蒸制胆南星进行鉴别，采用薄层色谱法及高效液相色谱法通过与胆汁酸类成分的对照品比对，可以在胆南星的发酵品中同时检测到猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)三种胆汁酸类成分，在胆南星的混合蒸制品中检测不明显；通过与胆汁酸类成分的对照品比对，可以在混合蒸制品中同时检测到甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)两种胆汁酸类成分，在胆南星的发酵品未检测到。利用以上两种方法可以有效的鉴别猪胆汁炮制的发酵制和混合蒸制胆南星。
发明内容
解决的技术问题：就目前的研究而言，仅仅对市售胆南星样品中单个或两个胆汁酸类成分作了简单的鉴别，并未有区别鉴别胆南星的是采用发酵法还是混合蒸制法炮制，胆南星中专属性成分不明，导致胆南星质量控制水平低。因此，针对以猪胆汁为炮制辅料用不同炮制方法炮制的胆南星，本发明提供一种简单、快捷的鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星的方法，为控制胆南星的质量提供依据。
技术方案：猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)作为一组标志物，以及甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)作为另一组标志物在鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星中的应用。上述应用具体方法为：a、对照品溶液的制备：取甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、猪胆酸(HCA)，加乙醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得对照品溶液；b、供试品溶液的制备：取过四号筛的供试品粉末0.5g，用乙醇2mL超声处理30min，滤过，取滤液即得；c、检测：采用薄层色谱法吸取对照品溶液与供试品溶液各4μL，依次点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为20:25:2:3的正己烷-醋酸乙酯-醋酸-甲醇为展开剂展开，取出晾干，喷以10wt.％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；d、结果分析：胆南星发酵制品的供试品色谱中，在和猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)的相应位置上，在日光下显相同颜色的斑点，紫外光下显相同颜色的荧光斑点，胆南星的混合蒸制品在日光下斑点不明显，紫外光下荧光斑点不明显；胆南星混合蒸制品的供试品色谱中，在和甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的相应位置上，胆南星混合蒸制品在日光下显相同颜色的斑点，胆南星的发酵制品在日光下不显斑点，紫外光下不显荧光斑点。
猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)作为一组标志物，以及甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)作为另一组标志物在鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星中的应用。上述应用具体方法为：色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈(A)-0.1％乙酸(B)；流速：1.0mL/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0～2min，25wt.％乙腈；2～5min，25wt.％～33wt.％乙腈；5～10min，33wt.％～33wt.％乙腈；10～25min，33wt.％～62wt.％乙腈；25～26min，62wt.％～25wt.％乙腈；26～31min，25wt.％～25wt.％乙腈；31～35min，25wt.％～25wt.％乙腈；ELSD条件：载气流速2.2L/min，漂移管温度：90℃；不分流；对照品溶液的制备：取甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)，加乙醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得对照品溶液；供试品溶液的制备：取过四号筛供试品粉末0.1g，置25mL量瓶中，加入80wt.％乙醇20mL，功率250W频率40KHz超声处理30分钟，放冷，加80wt.％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；检测：精密吸取对照品溶液5μL、10μL，精密吸取供试品溶液5μL，注入液相色谱仪，测定；结果分析：在胆南星的发酵制品供试品溶液中，在和猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)的相应保留时间可检测到相应色谱峰，而在胆南星的混合蒸制制品中检测不到相应色谱峰；在胆南星的混合蒸制品供试品溶液中，在和甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的相应保留时间可检测到相应色谱峰，而在胆南星发酵制品中未检测到相应色谱峰。
有益效果:通过比较以猪胆汁为炮制辅料自制的胆南星发酵制品和混合制品与新鲜猪胆汁进行胆汁酸类成分炮制前后比较，并与胆汁酸成分混标对比，发现胆南星的混合蒸制品在炮制前后胆汁酸类成分基本未发生变化，并以甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)为主；而胆南星的发酵制品与新鲜猪胆汁比较，发现胆南星发酵制品以猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)为主。因此，可以将猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)及甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)作为鉴别以猪胆汁为炮制辅料的发酵和混合蒸制胆南星的指标成分。该方法提供了利用薄层色谱法及高效液相色谱法鉴别猪胆汁炮制的胆南星中的胆汁酸类成分，两种方法均可简单、快捷的鉴别猪胆汁炮制的胆南星的不同炮制品，且能更好地控制胆南星的质量。本发明的鉴别方法，具有较强的专属性和良好的重现性。
附图说明
图1自制胆南星不同炮制品、市售胆南星样品、胆汁酸类成分混标薄层色谱图。其中1.三种胆汁酸成分混标；2.发酵法制胆南星(自制)；3.QY(发酵制)；4.QF(发酵制)；5.FZ(发酵制)；6.TL(混合制)；7.BS(混合制)；8.YF(混合制)；9.WSC(混合制)；10.混合法制胆南星(自制)；11两种胆汁酸成分混标。(3～9为市售胆南星样品)a.甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)；b.甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)；c.猪胆酸(HCA)；d.猪去氧胆酸(HDCA)；e.鹅去氧胆酸(CDCA)；
图2新鲜猪胆汁自制胆南星不同炮制品、胆汁酸类成分HPLC-ELSD色谱图。其中1.甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)；2.甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)；3.猪胆酸(HCA)；4.猪去氧胆酸(HDCA)；5.鹅去氧胆酸(CDCA)；
图3自制胆南星不同炮制品HPLC-ELSD图。其中A对照品(Standard)；B混合法胆南星样品(自制)；C发酵法胆南星样品(自制)；1甘氨酸猪去氧胆酸(GHDCA)；2甘氨酸鹅去氧胆酸(GCDCA)；3猪去氧胆酸(HDCA)；4鹅去氧胆酸(CDCA)；
图4自制胆南星不同炮制品、市售胆南星样品、胆汁酸类成分混标HPLC-ELSD色谱图。其中1.甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)；2甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)；3.猪胆酸(HCA)；4.猪去氧胆酸(HDCA)；5.鹅去氧胆酸(CDCA)；QY(发酵制)；QF(发酵制)；FZ(发酵制)；WSC(混合制)；YF(混合制)；BS(混合制)；TL(混合制)。
具体实施方式
结合具体实施方式，本发明的具体实施方式包括薄层色谱鉴别法和和高效液色谱法相对本发明进一步说明如下：
实施例1
1仪器与试药
硅胶G薄层板购自青岛海洋化工工厂；Milli-Q纯水仪；BP211D电子天平(德国Sartorius公司)；KQ-500DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
Waters Alliance 2695HPLC(美国Waters公司)，配蒸发光散射检测器(ELSD2000ES，Alltech公司)，Empower色谱工作站。
对照品：猪胆酸(HCA)购自甄准生物；猪去氧胆酸对照品(Hyodeoxycholic acid，HDCA，大于98％)、鹅去氧胆酸(Chenodeoxycholic acid，CDCA，大于98％)、甘氨猪去氧胆酸(Glycohyodeoxycholic acid，GHDCA，大于97％)、甘氨鹅去氧胆酸(Glycochenodeoxycholic acid，GCDCA，大于97％)纯度均大于98％，购自上海源叶生物科技有限公司；牛磺胆酸(TCA)、牛磺猪去氧胆酸(THDCA)购自中国药品检定研究院；牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)购自Solarbio；乙腈，色谱纯，购自德国Merck公司；猪胆汁购自南京市栖霞区农贸市场的新鲜胆囊，取汁，去絮状物，－20℃保存，备用。浓硫酸购自江苏永峰化学试剂有限公司；正己烷、乙酸乙酯均购自南京化学试剂有限公司；其余试剂均为分析纯。
按照《全国中药炮制规范》(1988版)分别炮制胆南星的发酵制品与混合蒸制品。发酵法自制的胆南星：取适量天南星及猪胆汁，以1：4比例混合后置于烧杯中，35℃±2℃水浴放置，每天早晚搅拌，10天后烧杯置沸水浴加热，再连续隔水炖9天，每隔2小时搅拌一次，去除腥臭气，水浴挥发至干后，置60℃干燥。制备6份，获得的样品名分别为DF1～6。混合蒸制法自制胆南星：以制天南星与胆汁1:4的比例混合拌匀，蒸60分钟至透。取出放凉。制成小块，干燥。制备6份，获得的样品名分别DM1～6。市售胆南星分别购自苏州天灵中药饮片有限公司(TL)、重庆亚锋药业有限公司(YF)、购自上海万仕诚国药制品有限公司(WSC)、四川百胜药业有限公司(BS)、四川千方中药饮片有限公司(QF)、四川辅正药业股份有限公司(FZ)、四川仟源中药饮片有限公司(QY)。
2薄层色谱法鉴别不同胆南星炮制品：
对照品溶液的制备：取猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)对照品适量，精密称定，加80％乙醇分别制成每1mL含猪胆酸(HCA)0.44mg、猪去氧胆酸(HDCA)1.894mg、鹅去氧胆酸(CDCA)1.026mg、甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨猪去氧胆酸(GCDCA)均为1mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备：取饮片粉末0.5g，加乙醇2mL超声处理30min，滤过，取滤液，即得。
吸取对照品溶液与供试品溶液4μL，依次点于同一硅胶G薄层板上；
以正己烷-醋酸乙酯-醋酸-甲醇(体积比20:25:2:3)为展开剂，展开，取出，晾干；
喷以10wt.％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯下(365nm)检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
结果分析：将以猪胆汁为炮制辅料炮制的发酵胆南星和混合蒸制胆南星与胆汁酸类成分的混合对照品比对。胆南星发酵制品的供试品色谱中，在和猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)的相应位置上，在日光下显相同颜色的斑点，紫外光下显相同颜色的荧光斑点，胆南星的混合蒸制品在日光下斑点不明显，紫外光下荧光斑点不明显。胆南星混合制品的供试品色谱中，在和甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的相应位置上，胆南星混合制品在日光下显相同颜色的斑点。胆南星的发酵制品在日光下不显斑点，紫外光下不显荧光斑点，见图1。
3高效液相色谱法鉴别不同胆南星炮制品
本发明提供的鉴别猪胆汁炮制的发酵制和混合蒸制胆南星的高效液相色谱检测方法，具体是：先对供试样品进行打粉过筛，然后加80wt.％乙醇超声提取，提取物经微孔膜过滤后，再利用已建立的高效液相色谱测定方法进行分离，得供试样品色谱图，最后用供试样品色谱图与胆汁酸类成分混标的色谱图相比较，以此作为供试样品为发酵制和混合蒸制胆南星的鉴别。
本发明鉴别猪胆汁炮制的发酵胆南星和混合蒸制胆南星的高效液相色谱检测方法，可采用包括以下步骤的方法：
(1)对照品溶液的制备：
精密称取置干燥器48小时以上的对照品，甘氨猪去氧胆酸(Ⅰ)10.03mg、甘氨鹅去氧胆酸(Ⅱ)9.95mg、猪去氧胆酸(Ⅲ)10.01mg和鹅去氧胆酸(Ⅳ)10.14mg分别置于5mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，得对照品贮备液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)。
(2)供试品溶液的制备：
取饮片粉末(过四号筛)约0.1g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入80wt.％乙醇至于容量瓶刻度，超声(工作频率40KHz，功率250W)处理30min，取出，放至室温，用80wt.％乙醇定容，摇匀，取适量高速离心，取上清液，即得。
(3)色谱条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈(A)-0.1％乙酸(B)；流速：1.0mL/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0～2min，25wt.％乙腈；2～5min，25wt.％～33％wt.乙腈；5～10min，33wt.％～33wt.％乙腈；10～25min，33wt.％～62wt.％乙腈；25～26min，62wt.％～25wt.％乙腈；26～31min，25wt.％～25wt.％乙腈；31～35min，25wt.％～25wt.％乙腈。
ELSD条件：载气流速2.2L/min，漂移管温度：90℃；不分流。
(4)供试样品与对照品溶液色谱图的建立：
将处理后的供试品溶液进行高效液相色谱分析，每个样品重复3次；在所选定的色谱条件下，供试样品及对照品均得到满意的分离见图3。
(5)结果分析：
将以猪胆汁炮制的发酵胆南星和混合蒸制胆南星供试品色谱图与胆汁酸类成分对照品色谱图进行对比。在胆南星的发酵制品供试品溶液中，在和混合对照品猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)的相应保留时间可检测到相应色谱峰，而在胆南星的混合制品中未检测到相应色谱峰；在胆南星的混合蒸制品供试品溶液中，在和混合对照品甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的相应保留时间可检测到相应色谱峰，而在胆南星发酵制品中未检测到相应色谱峰，见图2、图3。
实施例2
本发明提供的鉴别猪胆汁炮制的发酵制和混合蒸制胆南星的高效液相色谱鉴别方法，其在鉴别胆南星不同炮制品的应用。所述胆南星的炮制方法有两种，即发酵法和混合蒸制法，炮制品分别为发酵制和混合蒸制胆南星。
采用高效液相色谱(HPLC)法，建立了胆汁酸类成分猪去氧胆酸(HDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)与甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)定性分析方法。结果：5种胆汁酸类成分标准品均能得到完全分离见图2，在同样条件下QY、FZ、QF这三个厂家生产的胆南星样品供试品的色谱图中均有与胆汁酸类成分猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)相同保留时间的峰见图3，而TL、BS、YF、WSC这四个厂家的胆南星样品供试品的色谱图中均有与甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)相同保留时间的峰见图3。因此可以用此方法鉴别胆南星的发酵制品与混合蒸制品，并验证炮制辅料是否为猪胆汁。
发酵制和混合蒸制胆南星的鉴别方法。具体如下:
(1)材料与方法
同实施例1
(2)对照品溶液的制备：
精密称取置干燥器48小时以上的对照品，甘氨猪去氧胆酸(Ⅰ)10.03mg、甘氨鹅去氧胆酸(Ⅱ)9.95mg、猪去氧胆酸(Ⅲ)10.01mg和鹅去氧胆酸(Ⅳ)10.14mg分别置于5mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容，摇匀，得对照品溶液(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)。
(3)供试品溶液的制备：
取自制发酵制和混合蒸制胆南星粉末(过四号筛)约0.1g，精密称定，置25mL容量瓶中，加入80wt.％乙醇置容量瓶刻度，超声(工作频率40KHz，功率250W)处理30min，取出，放至室温，用80wt.％乙醇定容，摇匀，高速离心，取上清液，即得供试品溶液。
(4)色谱条件：
色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈(A)-0.1％乙酸(B)；流速：1.0mL/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0～2min，25wt.％乙腈；2～5min，25wt.％～33％wt.乙腈；5～10min，33wt.％～33wt.％乙腈；10～25min，33wt.％～62wt.％乙腈；25～26min，62wt.％～25wt.％乙腈；26～31min，25wt.％～25wt.％乙腈；31～35min，25wt.％～25wt.％乙腈；
ELSD条件：载气流速2.2L/min，漂移管温度：90℃；不分流。
(5)精密度试验
取混合对照品溶液10μL，连续进样6次进行仪器精密量试验，结果显示测得对照品对应的色谱峰峰面积对数的RSD均小于0.2％，表明仪器精密性良好。
(6)重复性试验
同时分别取同一发酵制胆南星和混合制胆南星饮片6份，按建立方法分别进行供试品制备，经高效液相仪分析，以回归方程计算含量，测得混合制样品中GHDCA与GCDCA的平均含量分别为11.62％和5.74％，RSD依次为1.50％和1.49％；测得发酵制样品中HDCA与CDCA的平均含量分别为8.99％和6.58％，RSD依次为0.96％和0.97％，均符合含量测定方法建立验证要求。
(7)稳定性试验
分别精密量取同一供试品溶液(DM、DF)5μL，在0，2，4，8，16，24小时分别测定，以峰面积对数统计，结果显示，4个胆酸类成分RSD均小于0.5％，表明供试品溶液在24小时内稳定。
表1胆南星样品重复性、稳定性、精密度的测定结果
(8)结果分析：
将以猪胆汁炮制的发酵胆南星和混合蒸制胆南星供试品色谱图与胆汁酸类成分对照品色谱图进行对比。在自制的发酵制的发酵制品供试品溶液中，在与混合对照品猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)的相应保留时间可检测到相应色谱峰，而在自制的混合蒸制胆南星的供试品溶液中未检测到相应色谱峰；在混合蒸制胆南星供试品溶液中，在与混合对照品甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的相应保留时间可检测到相应色谱峰，而在自制的发酵制供试品溶液中未检测到相应色谱峰。图4。QY、FZ、QF这三个厂家的胆南星样品是猪胆汁发酵法炮制，发现其胆南星样品HPLC图与自制的发酵胆南星谱图一致，均检测到了猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)，未检测到甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)；而TL、BS、YF、WSC这四个厂家的胆南星样品是混合蒸制，发现其样品HPLC图与自制混合蒸制胆南星的色谱图一致，均检测到了甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)和甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)，未检到明显的猪胆酸(HCA)、猪去氧胆酸(HDCA)和鹅去氧胆酸(CDCA)色谱峰，到与本发明的预期结果一致。

Claims (4)

1.猪胆酸（HCA）、猪去氧胆酸（HDCA）和鹅去氧胆酸（CDCA）作为一组标志物，以及甘氨猪去氧胆酸（GHDCA）和甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）作为另一组标志物在鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星中的应用。
2.猪去氧胆酸（HDCA）和鹅去氧胆酸（CDCA）作为一组标志物，以及甘氨猪去氧胆酸（GHDCA）和甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）作为另一组标志物在鉴别猪胆汁炮制的发酵制胆南星和混合蒸制胆南星中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
a、对照品溶液的制备： 取甘氨猪去氧胆酸（GHDCA）、甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）、猪去氧胆酸（HDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）、猪胆酸（HCA），加乙醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得对照品溶液；
b、供试品溶液的制备：取过四号筛的供试品粉末0.5 g，用乙醇2 mL超声处理30 min，滤过，取滤液即得；
c、检测：采用薄层色谱法吸取对照品溶液与供试品溶液各4μL，依次点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为20:25:2:3的正己烷-醋酸乙酯-醋酸-甲醇为展开剂展开，取出晾干，喷以10wt.%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；
d、结果分析：胆南星发酵制品的供试品色谱中，在和猪胆酸（HCA）、猪去氧胆酸（HDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）的相应位置上，在日光下显相同颜色的斑点，紫外光下显相同颜色的荧光斑点，胆南星的混合蒸制品在日光下斑点不明显，紫外光下荧光斑点不明显；胆南星混合蒸制品的供试品色谱中，在和甘氨猪去氧胆酸(GHDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(GCDCA)的相应位置上，胆南星混合蒸制品在日光下显相同颜色的斑点，胆南星的发酵制品在日光下不显斑点，紫外光下不显荧光斑点。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
色谱条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈（A）-0.1%乙酸（B）；流速：1.0mL/min；柱温30℃；梯度洗脱程序：0~2min，25wt.%乙腈；2~5min，25wt.%~33wt.%乙腈；5~10min，33wt.%~33wt.%乙腈；10~25min，33wt.%~62wt.%乙腈；25~26min，62wt.%~25wt.%乙腈；26~31min，25wt.% ~25wt.%乙腈；31~35min，25wt.% ~25wt.% 乙腈；ELSD条件：载气流速2.2L/min，漂移管温度：90℃；不分流；
对照品溶液的制备： 取甘氨猪去氧胆酸（GHDCA）、甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）、猪去氧胆酸（HDCA）、鹅去氧胆酸（CDCA），加乙醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得对照品溶液；
供试品溶液的制备：取过四号筛供试品粉末0.1 g，置25 mL量瓶中，加入80wt.%乙醇20mL，功率250W频率40KHz超声处理30 分钟，放冷，加80wt.%乙醇至刻度，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液；
检测：精密吸取对照品溶液5μL、10μL，精密吸取供试品溶液5μL，注入液相色谱仪，测定；
结果分析：在胆南星的发酵制品供试品溶液中，在对照品猪去氧胆酸（HDCA）和鹅去氧胆酸（CDCA）的相应保留时间可检测到相应色谱峰，而在胆南星的混合蒸制制品中未见相应色谱峰；在胆南星的混合蒸制品供试品溶液中，在对照品甘氨猪去氧胆酸（GHDCA）和甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）的相应保留时间可检测到相应色谱峰，而在胆南星发酵制品中未见相应色谱峰或未见明显的相应色谱峰。
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