CN114002368A

CN114002368A - 超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法测定保健食品中非法添加成分的方法

Info

Publication number: CN114002368A
Application number: CN202111641499.0A
Authority: CN
Inventors: 李莹; 李伟; 柳溪; 杨栩; 刘莹; 翟雨佳
Original assignee: Tianjin Food Safety Testing Technology Research Institute
Current assignee: Tianjin Food Safety Testing Technology Research Institute
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-02-01
Also published as: CN114814014A

Abstract

本发明涉及超高效液相色谱‑四级杆‑飞行时间高分辨质谱法测定保健食品中非法添加成分的方法，包括如下步骤：(1)配制221种对照品单标储备溶液，按照浓度梯度配制混合标准工作溶液和多份标准系列溶液；(2)建立色谱分离条件和质谱条件；(3)建立一级谱库；(4)建立二级高分辨质谱数据库。本发明的有益效果是：运用超高效液相色谱‑四级杆‑飞行时间高分辨质谱法建立保健食品中221种非法添加化学成分的检测方法，并建立相应非法添加化学物质的高分辨质谱数据库。对比高分辨质谱数据库中相应的特征碎片离子，能够对保健食品监督抽检和风险监测的221种非法添加化学物质进行定性和定量风险筛查和测定。能够更有针对性，更快速有效地对保健品非法添加成分进行准确的分析检测，使得成分检测分析更快速。过程简单，检测精度高，检测灵敏。

Description

超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法测定保健食品中非法添加成分的方法

技术领域

本发明属于保健品非法添加检测技术领域，对食品中非法添加化学成分的检测方法的开发。

背景技术

保健食品是由天然营养成分和特殊活性物质所构成的，它区别于药品的最大一个特点是：它不含有任何药物成分, 不具备治疗的功用, 不能对人体造成任何伤害和副作用。我国GB16740-2014《食品安全国家标准保健食品》中第2.1 条将保健食品定义为: 声称并具有特定保健功能或者以补充维生素、矿物质为目的的食品。由于保健食品属性的特殊性, 某些商家受利益驱使, 选择在保健食品中添加违禁药物来达到提高其产品功能性的目的。随着我国人民生活水平的提高，保健意识愈发强烈，保健品成为当今社会流行的保持身体健康的产品,得到大众的喜爱。同时近些年跨境电商零售进口商品中保健食品比例逐年攀升。但保健食品虚假宣传，滥用西药成分等问题层出不穷，致使部分我国国内市场的保健食品在安全性、质量可控性上存在一定的风险，甚至在配方的科学性和保健功能上可能缺乏一定的临床验证，为人民健康生活带来安全隐患。

国家食品药品监督管理局在2009年颁布了药品补充检验标准, 规定了非法添加的11种补肾壮阳类化学药检测方法。2018年颁布了《食品中那非类物质的测定》（BJS201805）包含了90种那非类非法添加物质。出口保健食品检验标准、国家批准的文件及国家补充检验标准采用的检测方法主要为高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法，这些方法通常适合在有对照品或标准物质的情况下，对已知目标物的检测，分析成本高、研究扩展性不强。保健食品种类繁多，而且还处于增长的态势，标准中涉及到的非法添加物质的主要包括：减肥类、降糖类、降血压类、降血脂类、安神类以及壮阳类。涉及到的类别只是其中一类中的部分非法添加物，对于日益繁杂的保健品市场，添加的非法添加物类别出现多种的态势，尤其针对不法分子在保健食品中添加其他化合物的衍生物或相似物的情况，往往会因现有检测方法的局限性而导致监管困难。但高通量识别和非目标成份激素类的检测鉴定方法尚没有建立。因此迫切需要建立非法添加化学物质多剂型、多指标的定量检测方法。

发明内容

为了能够快速检测多种保健食品中的非法添加物，本发明提供了一种超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法测定保健食品中非法添加成分的方法，本发明优化样品前处理、色谱、质谱等条件，完成方法学验证，并建立相应非法添加化学物质的高分辨质谱数据库。对比高分辨质谱数据库中相应的特征碎片离子，能够对保健食品监督抽检和风险监测221种非法添加化学物质进行定性和定量风险筛查和测定。这221种非法添加物均是实际检测工作中被检测或剖析出来的成分，如西布曲明和西地那非的被检出频率最高；氟米松等激素类检测方法尚无标准。保健食品中最常见的添加物，其中包括降血糖类27种、降血脂类6种、降血压类12种，安神类22种，减肥类30种，激素类40种，壮阳类84种。不同功能种类的221种非法添加物质能一种方法一次检测,既方便又利于操作。

本发明的具体技术方案是：一种超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法测定保健食品中非法添加成分的方法，包括如下步骤：

(1)标物配置分别称取 221种对照品 10.0 mg，用甲醇定容至 10 mL，配制成单标贮备液；以甲醇为溶剂，将221种单标贮备液稀释为100倍，即得10 μg /mL 的混合标准工作溶液；

(2) 建立色谱分离条件、质谱条件: 仪器名称：Agilent 1290 InfinityIILC-6545Q-TOF/MS 液相色谱-质谱联用仪，配有双喷射电喷雾电离源；

色谱分离条件: 流动相: A 相为体积分数 0.1% 甲酸水溶液+2mmol甲酸铵，B 甲醇；流速0.4 mL /min；色谱柱: Zorbax Eclipse Plus RRHD C₁₈（3.0 x 150 mm 1.8μm)；柱温 40℃ ；洗脱方式为梯度洗脱；

进样体积 1 μL；

质谱条件：

本发明采用Zorbax Eclipse Plus RRHD C₁₈（3.0 x 150 mm 1.8μm) 柱，兼顾不同极性化合物性质，比较理想的实现了色谱保留和分离。221种化合物的理化性质差别大，在色谱柱上保留特征也不同，为得到理想的色谱峰及合适的分离度，对比选择了性质不同的色谱柱，考察其保留行为及分离情况。下表为不同色谱柱检测结果：

结果表明: 二甲双胍、阿卡波糖、伏格列波糖、烟酸等极性较强的化合物保留性极小，容易受色谱前期极性共流出物干扰；另有氯地那非部分化合物由于结构原因，有峰形拖尾严重等情况。伪伐地那非与那莫西地那非互为同分异构体，经优化后为17.66min ,18.65min，可实现色谱基线分离。这样他们用一般的色谱柱会出现检测不准确的问题。

本发明采用Zorbax Eclipse Plus RRHD C₁₈（3.0 x 150 mm 1.8μm) 柱时兼顾不同极性化合物性质，适合检测221种物质。

本发明添加甲酸铵和甲酸的流动相，从而提升离子化效率和检测灵敏度。221种化合物的性质不同，检测时对流动相的要求也不同，考虑到221种化合物的色谱行为和离子化程度。最后流动相加入甲酸会提高正离子物质的灵敏度，加入甲酸铵可提高负离子物质的灵敏度。流动相中添加低浓度甲酸铵，除了有利于提供缓冲体系外，还可以促进达格列净、曲格列酮、环格列酮等在离子化过程中产生[M⁺NH4]⁺峰，从而提升离子化效率和检测灵敏度。比较0.02%、0.05%、 0.1%、0.5%甲酸水溶液发现随着甲酸浓度的增加，保留时间降低至30min以内，分辨度加大。但是当浓度增加到 0.5%以后, 检测灵敏度差。优化甲酸铵含量，比较1mmol、2mmol、3mmol，最终2mmol可以将221种物质的分离较好, 出峰时间缩短且分析时间适中，特征离子的峰型保持较好，满足221种化合物的准确检测灵敏度。最后通过优化后确定流动相及梯度洗脱程序。

本发明采用 All Ions MS/MS模式中设置碰撞能量获得化合物二级质谱的信息。该模式可以选择多个碰撞能通道进行采集，根据目标物的保留时间、加合离子和碎片离子的精确分子量等信息与数据库进行检索比对，最终对化合物进行确证。不同碰撞能量，增加化合物判定准确性，确认性。比如在实际工作中，我们会遇到在某个能量下，某个物质会有相同的子离子，这就需要在其他能量下扫描该物质，做再次确认。我们的方法经过三种不同碰撞能量扫描，对保健品221种非法添加化学物质进行确认。保证检测物质的准确性，避免出现假阳性的可能。

本发明优化确定10V、20V、40V三种能量使谱图信息量更加充分和准确。我们对221种化合物设定三种不同能量值，根据化合物结构的键能稳定性进行的选择。一般情况结构化学键键能越稳定，需要打碎的能量越高，键能越低，需要打碎的能量越低。碰撞能较低时，采集到的碎片离子较少，造成特征性碎片较少，响应不明显。最终用于定性的离子可能会偏少，导致定性信息不充分。如果碰撞能较高，化合物的主要定性离子强度降低，同时相对分子量较低的碎片离子增加，而基质中的干扰峰通常处于较低相对分子质量端，这会对化合物的定性产生干扰。优化后可见母离子和子离子碎片谱图，其中母离子碎片相应占到碎片最高峰相应的20%，此情况能使谱图信息量更加充分和准确。针对要检测的221种物质，数量庞大，性质各不相同，对比优化了在20V、10Ｖ和20Ｖ双碰撞能通道下、10Ｖ、20Ｖ和40Ｖ三碰撞能通道下和10V、20V、50V三碰撞能通道下采集所筛出非法添加化合物和假阳、阴性非法添加化合物的占比情况。可以看出，在10Ｖ、20Ｖ和40Ｖ三碰撞能通道下，可筛查出非法添加化合物的占比明显高于其他情况，可以使得一些相对稳定的化合物产生较强的特征二级碎片离子，有助于对化合物进行同时基于母离子和二级碎片离子的准确判断定性。根据在不同数量和碰撞能量下有不同的结果，为得到每种物质的理想灵敏度，实验最终优化采用碰撞能量在10V、20V、40V。下表为不同碰撞能下准确筛查筛查结果：

（3）确认了 221种非法添加化合物的一级质谱、一级精确质荷比、同位素丰度比、保留时间和质量数误差；

（4）建立高分辨质谱数据库

在色谱分离条件下对221种非法添加化合物标准溶液进行分析，获得 221种化合物的保留时间、精确分子质量以及离子化方式，采集不同碰撞能量(10、20 和 40 V 下的目标化合物的二级质谱图，利用Masshunter定性软件提取每个化合物3个碰撞能量下的二级谱图，同时利用分子式生成功能计算出子离子碎片的理论分子式，在导入PCDL数据库中选择导入计算的理论值，从而建立高分辨质谱数据库，用于待检样品的数据库匹配确证。

以下是221种保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

表1 编号1-36保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

表2编号37-72保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

表3 编号73-100保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

表4 编号101-127保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

表5 编号128-157保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

表6 编号158-182保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

表7 编号183-204保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

表8 编号205-221保健品种的分子式、保留时间（ｔ）、定量离子和定性离子

产品检测前需要对产品进行前处理，前处理方法为：

待测样为片剂、颗粒剂、胶囊内容物，取样品研细后准确称取混合均匀的试样1g（精确至0.01 g）于50 mL 棕色容量瓶中，加入20 mL 甲醇，超声10 min，冷却至室温，甲醇定容至刻度，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定。

待测样为液体，准确称取一次口服剂量样品于50 mL 棕色容量瓶中，加入

20 mL 甲醇，超声10 min，冷却至室温，甲醇定容至刻度，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定。

待测样为胶囊，如需测量胶囊壳非法添加物的含量，将样品胶囊壳混合研细，

加三氯甲烷20ml，超声处理10min，过滤后取滤渣，挥干三氯甲烷，用5ml甲醇复溶，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定。

保健食品样品剂型较为复杂，片剂、胶囊、粉末、口服液等。在检测之前需

要经过样品前处理过程，使用甲醇直接超声提取获得了较好的提取效率和重复性。

本发明的有益效果是：运用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法建立保健食品中221种非法添加化学成分的检测方法，并建立相应非法添加化学物质的高分辨质谱数据库。对比高分辨质谱数据库中相应的特征碎片离子，能够对保健食品监督抽检和风险监测的221种非法添加化学物质进行定性和定量风险筛查和测定。能够更有针对性，更快速有效地对保健品非法添加进行准确的分析检测，使得成分检测分析更快速。过程简单，检测精度高，检测灵敏。

附图说明

图1目标化合物总离子流色谱图；

图2目标化合物标准谱库中在三种碰撞能量下的二级碎片质谱图；

图3设置二级质谱的一级质荷比（m/z）、保留时间的偏差范围参数图；

图4设置二级质谱的母离子加合形式参数图；

图5 PCDL数据库检索结果汇总图；

图6一级质谱精确质量得分判别图；

图7二级子离子与标准谱库的匹配得分判别图；

图8 保留时间判别图。

具体实施方式

实施例1

一种超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法检测一宣称有减肥功效保健品221种非法添加成分检测方法，包括如下步骤：

(2) 建立色谱分离条件、质谱条件: 仪器名称：Agilent 1290 InfinityIILC-6545Q-TOF/MS液相色谱-质谱联用仪，配有双喷射电喷雾电离源；（双喷射电喷雾电离源为美国Agilent公司）

色谱分离条件: 流动相: A 相为体积分数 0.1% 甲酸水溶液+2mmol甲酸铵，B 甲醇；流速0.4 mL /min；色谱柱: Zorbax Eclipse Plus RRHD C₁₈（3.0 x 150 mm1.8μm) ；柱温 40℃ ；洗脱方式为梯度洗脱；

进样体积 1 μL；

质谱条件：

（4）建立高分辨质谱数据库

（5）待测物处理检测

某市售片剂减肥类保健品，样品收集后，按下述步骤进行分析和鉴定：

步骤1：准确称取待测样品1g，置于50ml具塞试管中，准确加入甲醇溶液20ml，密塞，超声提取10min，定容至50ml，过0.22μm有机系滤膜供仪器测定。

步骤2：处理好的样品经Agilent 1290 Infinity IILC-6545Q-TOF/MS液相色谱质谱联用仪系统按建立的筛查方法进行数据采集，实际样品测试总离子流色谱图见图1，由图1可知目标物的保留时间11.49min，一级精确质荷比(m/z)280.1828，正离子模式，分子离子峰为[M+H]⁺峰。

步骤3：利用建立的保健品中非法添加数据库对样品采集得到的数据保留时间和一级精确质荷比对比一级谱库进行检索匹配，其中一级质荷比测定值与理论值偏差为0.48ppm（≤5ppm），匹配得分98.57分，保留时间匹配率达到96.6分，满足定性要求。

步骤4：用Masshunter定性软件提取实际样品中西布曲明在10V、20V和 40V三种碰撞能量下的二级谱图（见图2），同时利用建立的标准谱库中的标准二级谱与实测样本中的目标物进行匹配确证。

步骤5：设置一级质荷比（m/z）、保留时间的偏差范围，母离子加合形式（如图3、图4）三个参数开展二级谱库对目标化合物的确认工作。

步骤6：利用设置参数设置完毕后，通过二级谱库检索匹配得到的目标化合物西布曲明分子式，总离子流图，精确一级质荷比，精确二级离子谱图等数据进

行，最终结果汇总图5：

非法添加物确证的条件：一级质谱精确质量得分大于90分；二级子离子与标准谱库的匹配得分、保留时间与谱库保留时间的一致性得分大于70分，上述条件全部满足的情况下可以判定样品中含有该非法添加物质。以该样品为例，鉴定样品中西布曲明确证一级质谱精确质量得分判别图（见图6)得分98.57；二级质谱判别图（见图7）99.3；保留时间判别图（见图8）得分96.6。由结果可知全部满足确证条件，可以判定样品中含有西布曲明非法添加物质。

因此本发明的方法基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱方法建立了221种保健品中非法添加化合物的二级质谱库，包含了化合物名称、CAS 号、一级精确质荷比、二级质谱图等信息，可用于未知样品二级质谱图自动检索评分。对比高分辨质谱数据库中相应的特征碎片离子，通过较好的的匹配度确证目标化合物。该方法前处理简便、灵敏度高、扩展性强，通量高，能够对保健食品监督抽检和风险监测中非法添加化学物质进行快速风险筛查和测定。

Claims

1.超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法测定保健食品中非法添加成分的方法，其特征在于，包括如下步骤：

标物配置分别称取 221种对照品 10.0 mg，用甲醇定容至 10 mL，配制成单标贮备液；以甲醇为溶剂，将221种单标贮备液稀释为100倍，即得10 μg /mL 的混合标准工作溶液；

建立色谱分离条件、质谱条件: 仪器名称：Agilent 1290 Infinity IILC-6545Q-TOF/MS 液相色谱-质谱联用仪，配有双喷射电喷雾电离源；

确认了 221种非法添加化合物的一级质谱、一级精确质荷比、同位素丰度比、保留时间和质量数误差；

建立高分辨质谱数据库；

在优化好的色谱分离条件下对221种非法添加化合物标准溶液进行分析，获得 221种化合物的保留时间、精确分子质量以及离子化模式，采集不同碰撞能量10，20，40 V 下的目标化合物的二级质谱图，利用Masshunter定性软件提取每个化合物3个碰撞能量下的二级谱图，同时利用分子式生成功能计算出子离子碎片的理论分子式，再将转化好的理论值导入到PCDL数据库中，从而建立高分辨质谱数据库，用于待检样品的数据库匹配确证。

2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法测定保健食品中非法添加成分的方法，其特征在于，所述建立色谱分离条件为: 流动相: A 相为体积分数 0.1% 甲酸水溶液+2mmol甲酸铵，B 甲醇；流速0.4 mL /min；色谱柱: ZorbaxEclipse Plus RRHD C₁₈ 型号为3.0 x 150 mm 1.8 μm；柱温 40℃ ；洗脱方式为梯度洗脱如下表：

进样体积 1 μL；

质谱条件：

。

3.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-四级杆-飞行时间高分辨质谱法测定保健食品中非法添加成分的方法，其特征在于，所述建立高分辨质谱数据库的方法是：在色谱分离条件下对221种非法添加化合物标准溶液进行分析，获得 221种化合物的保留时间、精确分子质量以及离子化方式，采集不同碰撞能量10、20 和 40 V 下的目标化合物的二级质谱图，利用Masshunter定性软件提取每个化合物3个碰撞能量下的二级谱图，同时利用分子式生成功能计算出子离子碎片的理论分子式，再导入PCDL数据库中选择导入计算的理论值，从而建立高分辨质谱数据库，用于待检样品的数据库匹配确证。