CN106990185A - 一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法 - Google Patents

一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，以伊马替尼为内标，先用乙酸乙酯和叔丁基甲醚混合溶液对血浆中的药物进行萃取，再使用高效液相色谱分离样品，然后使用高分辨质谱平行反应监测模式进行药物靶向性检测，并使用药物二级碎片离子进行定量，实现同时对血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂的浓度进行分析测定。该方法在具有快捷性的同时，能够获得纳克级检测限，兼具有极高的靶向性，表现出快速、通量高、灵敏度高、特异性强、精密度和准确度良好、稳定性好、提取回收率高、无明显基质效应和稀释效应等优点。本发明方法可用于临床上常用的抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制剂的血药浓度监测。

Description

一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法。
背景技术
一直以来，癌症因其居高不下的死亡率而备受关注。目前研究发现癌症是一种多因素诱发的疾病，包括基因组紊乱、饮食不规律、环境污染、辐射等等。与正常的细胞相比较，癌细胞具有更强的复制能力来对抗细胞的凋亡。临床上主要使用外科手术、放射治疗、化学药物治疗及靶向药物治疗等手段进行治疗，其中手术后的化学药物治疗是常用方法之一。大多数化学药物特异性差，通常导致严重的毒副反应。因此，具有高度特异性的靶向药物逐渐进入临床。
靶向药物通常能够与癌症细胞中的特殊分子进行特异性结合，从而抑制癌症细胞的增殖和转移。基于上述特征，小分子激酶抑制剂获得广泛关注，其中酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)最为常见，例如：表皮生长因子受体抑制剂(epidermal growth factor receptor-TKIs，EGFR-TKIs)，血管内皮生长因子受体抑制剂(vascular endothelial growth factor receptor-2-TKIs，VEGFR-2-TKIs)，ROS原癌基因1/间变性淋巴瘤激酶抑制剂(ROS proto-oncogene 1/anaplastic lymphoma kinase-TKIs，ROS1/ALK-TKIs)等。目前，酪氨酸激酶抑制剂阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼和拉帕替尼被广泛应用于各类癌症的治疗，并且取得了良好的治疗效果。同时，临床工作者和研究人员依旧密切关注用药安全方面的研究。众所周知，血药浓度的个体化差异通常会导致疗效上的差异，临床上的个体化给药引起广泛的关注。因此，用于血药浓度检测的高灵敏度、高选择性的检测方法显得尤为重要。
迄今为止，研究人员利用不同的液相色谱和质谱开发了一些方法分别用于上述药物的血药浓度检测，例如，Zheng等人研究开发的LC-MS/MS方法，用于吉非替尼及其主要代谢物的检测，灵敏度1ng/mL(参见：Zheng N,Zhao C,He X et al.Simultaneousdetermination of gefitinib and its major metabolites in mouse plasma by HPLC-MS/MS and its application to a pharmacokinetics study.J.Chromatogr.B AnalytTechnol.Biomed.Life Sci.1011,215-222(2016))；Lankheet等人建立了HPLC-MS/MS方法，用于检测血浆中厄洛替尼的浓度，灵敏度5ng/mL(参见：Lankheet N,Schaake E,Rosing Het al.Quantitative determination of erlotinib and O-desmethyl erlotinib inhuman EDTA plasma and lung tumor tissue.Bioanalysis 4(21),2563-2577(2012))；Roberts等人建立了定量方法用于检测血浆中克唑替尼浓度，灵敏度5ng/mL(参见：RobertsM,Turner D,Broniscer A,Stewart C.Determination of crizotinib in human andmouse plasma by liquid chromatography electrospray ionization-tandem massspectrometry(LC-ESI-MS/MS).Journal of Chromatography B-AnalyticalTechnologies in the Biomedical and Life Sciences.960,151-157(2014))。这些方法在灵敏度、特异性和高通量方面还有待提高。此外，这些方法检测标准并不统一。因此，迫切需要建立一种能够同时测定上述药物的方法，这样就不必针对不同药物的检测需求来开发不同的方法，可以大幅降低后续开发成本，也有利于检测标准的统一，从而为不同检测点或实验室采集的数据能够相互参考或使用提供可能性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，采用HPLC-Q-Orbitrap检测方法，并结合药物特征性二级碎片离子分析，同时对血浆中阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼和拉帕替尼的浓度进行分析测定，实现了对血浆中上述药物快速、灵敏、特异分析。
一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，所述六种酪氨酸激酶抑制剂为阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼和拉帕替尼，包括以下步骤：
(1)取空白血浆，加入药物的甲醇溶液和内标伊马替尼的甲醇水溶液，分别制得各种药物的不同浓度的标准曲线血浆样本；采用由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液萃取所述标准曲线血浆样本中药物；再在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图和质谱图；并在色谱图中对药物及内标的特征性二级碎片离子进行提取，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，然后以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线；
其中，所述药物是指所述六种酪氨酸激酶抑制剂，所述标准曲线血浆样本中各药物浓度范围如下：阿帕替尼0.02-10ng/mL，克唑替尼0.10-20.0ng/mL，厄洛替尼0.05-10.0ng/mL，吉非替尼0.05-10.0ng/mL，埃克替尼0.05-10.0ng/mL，拉帕替尼2.0-200.0ng/mL；所述标准曲线血浆样本中内标伊马替尼浓度为20.0ng/mL；
(2)取患者血浆样本，加入内标伊马替尼的甲醇水溶液，使得内标浓度达到20ng/mL，得到患者待测血浆样本；采用由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液萃取所述患者待测血浆样本中药物；再在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图和质谱图；并在色谱图中对药物及内标的特征性二级碎片离子进行提取，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，再根据标准曲线计算得到患者待测血浆样品中药物浓度；
其中，液相色谱条件：Hypersil GOLD-C18色谱柱，流动相为流动相A和流动相B，流动相梯度洗脱条件为：0-0.5min，流动相B的体积分数为20％；0.5-3.0min，流动相B的体积分数为20％-95％；3.0-6.0min，流动相B的体积分数为95％；6.0-6.1min，流动相B的体积分数为95％-20％；6.1-8.0min，流动相B的体积分数为20％；流速为0.4mL/min，进样量5μL，柱温30℃，进样器内温度4℃，其中，流动相A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为100％甲醇；
质谱条件：离子源为HESI，喷雾电压3000V，毛细管温度350℃，鞘气和辅助气分别为45psi和10arb；正离子模式下以平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)模式进行扫描，二级碎片扫描分辨率为17500；各药物和内标的具体碰撞解离能量分别为：阿帕替尼35％、克唑替尼21％、厄洛替尼37％、吉非替尼25％、埃克替尼35％、拉帕替尼35％、伊马替尼32％；各药物和内标的母离子/特征性二级碎片离子的检测离子对如下：阿帕替尼398.1975/212.0818、克唑替尼450.1258/260.1506、厄洛替尼394.1761/336.1343、吉非替尼447.1593/128.1070、埃克替尼392.1604/304.1081、拉帕替尼581.1420/458.1066、伊马替尼494.2662/394.1662。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)中，所述标准曲线血浆样本按以下方法制得：
取100μL空白血浆，加入一定体积的某一药物贮备液和内标贮备液，或者加入一定体积的用体积分数为50％的甲醇水稀释后的某一药物贮备液和内标贮备液，制得该药物某一标准浓度的标准曲线血浆样本，并依此法分别制得各药物的不同标准浓度的标准曲线血浆样本；其中，所述药物贮备液是以甲醇作为溶剂配制的各药物浓度为1.0mg/mL的药物甲醇溶液，所述内标贮备液是以体积分数为50％的甲醇水作为溶剂配制的内标浓度为1μg/mL的内标甲醇水溶液；
所述标准曲线血浆样本中，最终内标浓度为20.0ng/mL，最终血浆各药物的标准浓度如下：
吉非替尼：0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL；埃克替尼：0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL；厄洛替尼：0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL；拉帕替尼：2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、80.0ng/mL、100.0ng/mL、160.0ng/mL、200.0ng/mL；阿帕替尼：0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、10.0ng/mL；克唑替尼：0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、10.0ng/mL、16.0ng/mL、20.0ng/mL。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)中，用所述混合溶液萃取所述标准曲线血浆样本中药物，包括：将所述标准曲线血浆样本涡旋20s，然后加入500μL的由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液，涡旋1min后在4℃条件下10000g离心5min，取400μL上清液置于新管内，旋转蒸发干燥后加入100μL的体积分数为50％的甲醇水重溶，随后在4℃条件下10000g离心5min，取上清置进样管中，待进样分析。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(2)中，用所述混合溶液萃取所述患者待测血浆样本中药物，包括：将所述患者待测血浆样本涡旋20s，然后加入500μL的由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液，涡旋1min后在4℃条件下10000g离心5min，取400μL上清液置于新管内，旋转蒸发干燥后加入100μL的体积分数为50％的甲醇水重溶，随后在4℃条件下10000g离心5min，取上清置进样管中，待进样分析。
在本发明的一些具体实施例中，步骤(2)中，所述患者待测血浆样本的体积为20μL。
在本发明的一些具体实施例中，步骤(2)中，在萃取前，先用空白血浆稀释所述患者待测血浆样本。
在本发明的一些具体实施例中，所述Hypersil GOLD-C18色谱柱的规格为50×2.1mm，粒径为5μm。
本发明建立了一种基于高效液相色谱联合高分辨质谱的检测方法，先对上述药物进行液相分离，随后采用高分辨质谱仪中的平行反应监测(PRM)模式，即通过高分辨质谱中的四级杆对母离子进行有目的地筛选，筛选后的离子进入碰撞池发生高能碰撞进行碎裂，所产生的碎片被同时送入Orbitrap进行高分辨扫描，然后选择特征性二级碎片离子进行靶向定量，能够有效地增强选择性，降低假阳性率。
本发明中，对流动相进行了优化，优化后所采用的流动相组成为：体积分数为0.1％的甲酸水(流动相A)、100％甲醇(流动相B)，如此一来，在梯度洗脱下前述六种药物在3.5min时全部出峰完毕，得到的色谱质谱峰更窄、检测所需时间更短。
本发明中，对内标进行了优化，优化后所采用的内标为伊马替尼，其对上述的各药物无干扰。
本发明中，对碰撞能量进行了优化，分别确定药物阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、拉帕替尼、以及内标伊马替尼的碰撞能量依次为35％、21％、37％、25％、35％、35％、32％时，如此一来，所获取的离子信号最强，各药物的二级碎片离子峰强度最高。而且，由Orbitrap检测器进行的精度检测显示了本发明中数据精度的高可靠性：与理论值相比，上述各药物一级母离子在Orbitrap检测器中质量偏差小于5ppm，二级碎片母离子在Orbitrap检测器中质量偏差亦小于5ppm。
本发明中，在采用高效液相色谱串联高分辨质谱对血浆中药物浓度进行分析前，通过由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚混合溶液对待测血浆样本进行预处理，获得了较高的回收率，且能够避免基质效应。
本发明中，所用待测血浆样本量为20μL，显著低于其他文献报道所使用的样本量，因此，本发明适用于临床样本量较少的情况。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明建立了一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，可以同时适用和满足六种不同药物的检测需求，能够大幅降低后续开发成本，同时，有利于检测标准的统一，从而为不同检测点或实验室采集的数据能够相互参考或使用提供可能性。
(2)本发明在采用高效液相色谱串联高分辨质谱测定前对待测样品进行预处理，获得了较高的回收率，并且能够避免基质效应。
(3)本发明所用待测血浆样本量为20μL，显著低于其他文献报道所使用的样本量，从而使得本发明适用于临床样本量较少的情况。
(4)经方法学验证，本发明方法具有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度良好、稳定性好的优点；并且，各药物的提取回收率在可接受范围内，也未见明显基质效应，无明显稀释效应；同时，本发明方法还具有快速、通量高的优点。
(5)临床血浆样本中药物浓度的测定结果，进一步证明了本发明方法适用于临床血浆中药物浓度的检测。
附图说明
图1给出了7种物质的化学结构式，其中，(1)阿帕替尼；(2)克唑替尼；(3)吉非替尼；(4)埃克替尼；(5)拉帕替尼；(6)厄洛替尼；(7)伊马替尼。
图2A和图2B分别是对空白血浆、加入各药物和内标的血浆所测得的色谱图中进行特征性二级碎片离子提取的结果。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，以便理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例和附图，对本发明作进一步详细说明。应理解，下述的实施实例仅用于说明本发明，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
以下实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。例如，阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、拉帕替尼、伊马替尼从美国Selleck公司购买；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇和甲酸从美国Tedia公司购买。
一、标准曲线血浆样本和质控血浆样本的制备
1.1贮备液的制备：
用甲醇作为溶剂，分别配制六种酪氨酸激酶抑制剂药物(阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、拉帕替尼)的贮备液，六种药物贮备液的药物浓度均为1.0mg/mL；用体积分数为50％的甲醇水作为溶剂，配制内标伊马替尼的贮备液，内标贮备液的内标浓度为1μg/mL；所有的贮备液均存放在玻璃管中，4℃保存；
1.2标准曲线血浆样本的制备：
取100μL空白血浆，加入一定体积的前述的1.1项所制得的一种药物贮备液和内标贮备液(或者加入一定体积的用体积分数为50％的甲醇水稀释后的上述1.1项所制得的一种药物贮备液和内标贮备液)，制得该药物某一标准浓度的标准曲线血浆样本，并依此法分别制得各种药物的不同标准浓度的标准曲线血浆样本。标准曲线血浆样本中，最终血浆药物浓度如下表1所示，最终内标浓度为20.0ng/mL。
表1.各药物的标准曲线血浆样本的最终浓度
1.3质控血浆样本的制备：
取100μL空白血浆，加入一定体积的前述的1.1项所制得的一种药物贮备液和内标贮备液(或者加入一定体积的用体积分数为50％的甲醇水稀释后的上述1.1项所制得的一种药物贮备液和内标贮备液)，制得该药物某一质控浓度的质控血浆样本，并依此法分别制得各个药物的不同质控浓度的质控血浆样本。质控血浆样本中，最终血浆药物浓度如下表2所示，最终内标浓度为20.0ng/mL。
表2.各药物的质控血浆样本的最终浓度
二、患者血浆样本的制备(以阿帕替尼为例)
得到患者知情及伦理的同意下，在患者服用阿帕替尼至少一个月后开始采集血液。给药方式：1天一次。血液收集后在4℃条件下3000g离心5min，取上层血浆作为样本，-80℃保存。取20μL患者血浆样本，加入一定体积内标贮备液(或者用体积分数为50％的甲醇水稀释后的内标贮备液)，使得内标浓度达到20ng/mL，得到待测患者血浆样本。
三、血浆样本的预处理
将血浆样本涡旋20s，然后加入500μL的由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液，涡旋1min后在4℃条件下10000g离心5min，取400μL上清液置于新管内，旋转蒸发干燥后加入100μL的体积分数为50％的甲醇水重溶，随后在4℃条件下10000g离心5min，取上清置进样管中，待进样分析。上述的血浆样本为标准曲线血浆样本、质控血浆样本、待测患者血浆样本、空白血浆样本。
四、HPLC-MS/MS测试
4.1色谱条件
高效液相：Ultimate 3000 LC(Thermo Scientific)
色谱柱：Hypersil GOLD-C18柱子(50×2.1mm,5μm,Thermo Scientific)
流动相：体积分数为0.1％的甲酸水(流动相A)，100％甲醇(流动相B)
流速：0.4mL/min
进样量：5μL
柱温：30℃
进样器内温度：4℃
流动相梯度设置如下：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 流速(mL/min)
0 80％ 20％ 0.4
0.5 80％ 20％ 0.4
3.0 5％ 95％ 0.4
6.0 5％ 95％ 0.4
6.1 80％ 20％ 0.4
8.0 80％ 20％ 0.4
4.2质谱条件
质谱仪：Q-Exactive；
离子源：HESI电离源，喷雾电压3000V，毛细管温度350℃，鞘气和辅助气分别为45psi、10arb；
离子极性：正离子模式；
离子检测方式：平行反应监测(PRM)模式
各药物和内标的具体碰撞解离能量下见表3；二级碎片扫描分辨率为17500；各药物母离子和特征性二级碎片离子见下表3。
表3.各药物保留时间、精确分子量及碰撞能量
五、标准曲线的制备
对于按照“表1”中所列的某一药物的各标准浓度配制的各个标准曲线血浆样本中的每个样本进行以下操作：按照“三、血浆样本的预处理”项操作后，取5μL置于进样管中，依照“4.1”和“4.2”的条件，进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)测定，记录色谱图和质谱图；并在色谱图中对该药物及内标伊马替尼的特征性二级碎片离子(“表3”理论值)进行提取，计算药物峰面积和内标峰面积的比值；全部样本完成上述操作后，以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，用加权(1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得该药物的直线回归方程，即为该药物的标准曲线。依照同样的步骤，制备各药物的标准曲线。
根据标准曲线，本分析方法下：阿帕替尼线性范围为0.02-10ng/mL，克唑替尼线性范围为0.10-20.0ng/mL，厄洛替尼线性范围为0.05-10.0ng/mL，吉非替尼线性范围为0.05-10.0ng/mL，埃克替尼线性范围为0.05-10.0ng/mL，拉帕替尼线性范围为2.0-200.0ng/mL。各药物的直线回归方程以及定量下限的结果如表4所示。
表4.各药物线性回归方程、相关系数、线性范围及定量下限
*y代表药物峰面积/内标峰面积，x代表浓度
由表4可见，各药物的标准曲线在浓度范围内线性关系均为良好(r2﹥0.99)，并均取得了较低的定量下限。阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、拉帕替尼的定量下限分别为0.02ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL、0.05ng/mL、0.05ng/mL、2.0ng/mL。
六、方法学验证
方法学验证主要包括线性、灵敏度、特异性、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性。
6.1标准曲线和定量下限
见上述“五、标准曲线的制备”项的内容。结果显示：各药物的标准曲线在浓度范围内线性关系均为良好(r2﹥0.99)，并均取得了较低的定量下限。
6.2特异性
取100μL空白血浆，不加药物和内标，按照“三、血浆样本的预处理”项操作后，取5μL置于进样管中，依照4.1和4.2的条件，进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)测定，记录色谱图和质谱图，并在色谱图中对各药物及内标的特征性二级碎片离子(“表3”理论值)进行提取，结果如图2A所示，其中，从上至下依次为对以下药物及内标的特征性二级碎片离子的提取结果：埃克替尼、厄洛替尼、阿帕替尼、吉非替尼、克唑替尼、伊马替尼、拉帕替尼。
取100μL空白血浆，加入一定体积的前述的1.1项所制得的一种药物贮备液和内标贮备液(或加入一定体积的用体积分数为50％的甲醇水稀释后的上述1.1项所制得的一种药物贮备液和内标贮备液)，最终使得该药物浓度达到如“表1”中所示的浓度5，内标浓度为20.0ng/mL。随后，按“三、血浆样本的预处理”项操作，取5μL置于进样管中，依照“4.1”和“4.2”的条件，进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)分析，记录色谱图和质谱图，并在色谱图中对药物及内标的特征性二级碎片离子(“表3”理论值)进行提取。分别对六种药物依此法操作。结果如图2B所示。图2B显示了各药物和内标伊马替尼的特征性二级碎片离子峰。
由图2A和图2B可见，在未添加药物的空白血浆中没检测到特征性二级碎片离子峰，如图2A所示；在添加了药物的血浆中可检测到明显的特征性二级碎片离子峰，且各药物和内标峰形均良好，无杂峰干扰，如图2B所示。可见，血浆样品中内源性物质不干扰各药物及内标的测定，证明本发明方法对血浆中上述6种药物的检测具有较强的特异性。
6.3精密度和准确度
对于按照“表2”中所列的各质控浓度配制的各药物的质控血浆样本(每个药物每个浓度各制备6份，每天制备一批样品，连续3天，一共制备3批作为考察精密度和准确度的样品)中的每个样本进行以下操作：按照“三、血浆样本的预处理”项操作后，取5μL置于进样管中，依照“4.1”和“4.2”的条件，分别进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)测定，记录色谱图和质谱图，并在色谱图中对药物及内标的特征性二级碎片离子(“表3”理论值)进行提取，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，代入当天所得的标准曲线求测试浓度，最后计算批内和批间精密度(绝对值小于15％为合格)和准确度(85％-115％为合格)。具体结果见表5。
表5.各药物准确度和精密度测试结果
由表5可见，血浆中各药物的各测试浓度的准确度均在85％-115％的合格区间内，血浆中各药物的各测试浓度的批内和批间精密度绝对值均小于15％。由此证明本发明方法对血浆中上述6个药物的检测具有良好的精密度和准确度。
6.4基质效应和回收率
第1组：取空白血浆100μL，加入500μL的由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液，涡旋1min后在4℃条件下10000g离心5min，取400μL上清液置于新管内，加入“表6”中所列的一种药物和内标，使得该药物和内标浓度为“表6”所示的质控浓度，每个浓度均制备6份。依照此法分别制备如下“表6”所示的六种药物的不同质控浓度的样本。对于每个样本进行如下操作：旋转蒸发干燥后，加入100μL的体积分数为50％的甲醇水重溶，随后在4℃条件下10000g离心5min，取5μL上清置进样管中，依照“4.1”和“4.2”的条件，分别进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)测定，记录每次测试中药物峰面积和内标峰面积。
第2组：对于按照“表6”中所列的各质控浓度配制的各药物的质控血浆样本(制备方法见1.3项，每个药物每个浓度各制备6份)中的每个样本进行以下操作：按照“三、血浆样本的预处理”项操作后，取5μL置于进样管中，依照“4.1”和“4.2”的条件，分别进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)分析，记录每次测试中药物峰面积和内标峰面积。
第3组：用体积分数为50％的甲醇水稀释按照1.1项所制得的药物贮备液和内标贮备液，分别制得20μL的如“表6”所示的不同质控浓度的各药物溶液(含内标)，加入到EP管中。每个药物每个浓度均制备6份。对于每个药物溶液进行以下操作：将药物溶液涡旋20s，然后加入500μL的由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液，涡旋1min后在4℃条件下10000g离心5min，取400μL上清液置于新管内，旋转蒸发干燥后加入100μL的体积分数为50％的甲醇水重溶，随后在4℃条件下10000g离心5min，取5μL上清置进样管中，依照“4.1”和“4.2”的条件，分别进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)分析，记录每次测试中药物峰面积和内标峰面积。
最终实验结果见表6，其中，回收率和基质效应根据以下公式计算得到：回收率％＝第2组药物峰面积/第1组药物峰面积×100％；基质效应％＝第1组药物峰面积/第3组药物峰面积×100％。
表6.人血浆内基质效应和提取回收率试验(n＝6)
由表6可见，血浆中各药物的低浓度基质效应在81.1％-93.4％之间，中高浓度基质效应在88.2％-97.4％之间，RSD值均在±15％之内，提示本发明对血浆中上述6个药物的检测未发现明显的基质效应。此外，血浆中各药物的各浓度(低、中、高)提取回收率在88.3％-103.6％之间，RSD值均在±15％之内，提示本发明对血浆中上述6个药物具有较高的提取回收率。因此，本发明方法中，各药物的提取回收率在可接受范围内，且未见明显基质效应。
6.5稀释效应(一百倍稀释)
对于按照“表1”中所列的各药物的浓度7配制的各个药物血浆样本(制备方法见1.2项，每个药物均制备3份)分别进行以下操作：
用空白血浆稀释100倍后，按“三、血浆样本的预处理”项操作，进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)分析，记录色谱图和质谱图，并在色谱图中对药物及内标的特征性二级碎片离子(“表3”理论值)进行提取，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，代入当天所得的标准曲线求测试浓度，将测试浓度乘以100，计算得出未稀释时的血浆药物浓度。
将计算得到的各药物浓度与各药物所对应的浓度7进行比较，结果显示：100倍稀释后，各药物的精密度均在15％以内，准确度均在85％-115％之间，表明在该稀释条件下，未出现明显的稀释效应，样品的精密度和准确度不受影响。
6.6稳定性
稳定性考察涵盖样品的整个检测过程中。各药物均设置低、中、高3个浓度，具体见表7。考察项目主要包括如下几个方面：室温短期稳定性，自动进样器内稳定性，冻融和长期稳定性。
表7.稳定性测试
具体操作如下：
将按照“表7”中所列的各药物的质控浓度配制的质控血浆样本(制备方法见1.3项)，每个药物每个浓度各制备15份。其中，
3份按“三、血浆样本的预处理”项下操作，立即进样分析，所得的结果为0h的对照样品；
3份于室温放置12小时后按“三、血浆样本的预处理”项下操作分析；
3份按“三、血浆样本的预处理”项下操作，于自动进样器中放置12h后，再进样分析；
3份于配制好后反复冻融三次(每次冰冻24小时后化冻)，按“三、血浆样本的预处理”项下操作分析；
3份于配制好后放入-80℃冰箱中冷冻保存30天后取出化冻，按“三、血浆样本的预处理”项下操作分析。
计算各种条件下样品相对于0h样品均值的偏差(即准确度)以及CV(变异系数)值。最终实验结果见表7。由表7可见：血浆中各药物的各浓度在上述考察条件下检测得出的CV值均小于10％，提示在上述考察条件下本发明方法对血浆中上述6个药物的检测具有较强的稳定性。
七、患者血浆样本中药物浓度的检测
将“二、患者血浆样本的制备”所得的患者待测血浆样本按照“三、血浆样本的预处理”操作后，取5μL置于进样管中，依照4.1和4.2的条件，进行HPLC-MS/MS(使用target-MS/MS模式)测定，记录色谱图和质谱图，并在色谱图中对药物及内标的特征性二级碎片离子(“表3”理论值)进行提取，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，代入当天所得的标准曲线求得测定浓度。具体检测结果见表8。
表8.临床血浆样本中阿帕替尼浓度测定
样本编号 性别 年龄 剂量(mg) 用药后采集时间(h) 测定浓度(ng/mL)
1 男 62 500 12 305
2 男 71 250 12 72
3 男 63 250 12 142
4* 男 62 250 12 182
5 女 54 250 12 89
6 男 54 500 12 20
7 女 52 375 12 66
8 男 61 250 12 577
*表示样本采集于同一位病患，该病患因经济条件限制而调整药物剂量。
结果分析：
(1)表8中样本1号和4号采集于同一位患者，该患者因经济原因将药物服用剂量从原先的500mg/天调整为250mg/天，本发明所测得的调整前后的血药浓度随即发生变化，显示本发明方法在上述药物血浆浓度检测方面的适用性。
(2)根据表8中结果显示，不同患者在服用相同药物剂量的情况下，出现了差异较大的血药浓度。该结果提示临床上患者在服用上述药物时确实存在个体差异，显示本发明的血药浓度检测具有临床意义和应用价值。
综上，经方法学验证，本发明方法具有灵敏度高、特异性强、精密度和准确度良好、稳定性好的优点；并且，各药物的提取回收率在可接受范围内，也未见明显基质效应，无明显稀释效应；同时，本发明方法还具有快速、通量高的优点。临床血浆样本中阿帕替尼浓度测定结果，进一步证明了本发明方法适用于临床血浆中药物浓度的检测。
在以上实施例中，如没有特别说明的情况下，药物均是指六种酪氨酸激酶抑制剂药物(阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼、拉帕替尼)中的一种或多种。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制，通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (7)

1.一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，所述六种酪氨酸激酶抑制剂为阿帕替尼、克唑替尼、厄洛替尼、吉非替尼、埃克替尼和拉帕替尼，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取空白血浆，加入药物的甲醇溶液和内标伊马替尼的甲醇水溶液，分别制得各种药物的不同浓度的标准曲线血浆样本；采用由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液萃取所述标准曲线血浆样本中药物；再在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图和质谱图；并在色谱图中对药物及内标伊马替尼的特征性二级碎片离子进行提取，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，然后以药物浓度为横坐标，以药物峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线；
其中，所述药物是指所述六种酪氨酸激酶抑制剂，所述标准曲线血浆样本中各药物浓度范围如下：阿帕替尼0.02-10ng/mL，克唑替尼0.10-20.0ng/mL，厄洛替尼0.05-10.0ng/mL，吉非替尼0.05-10.0ng/mL，埃克替尼0.05-10.0ng/mL，拉帕替尼2.0-200.0ng/mL；所述标准曲线血浆样本中内标伊马替尼浓度为20.0ng/mL；
(2)取患者血浆样本，加入内标伊马替尼的甲醇水溶液，使得内标浓度达到20ng/mL，得到患者待测血浆样本；采用由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液萃取所述患者待测血浆样本中药物；再在高效液相色谱质谱联用仪上进样分析，记录色谱图和质谱图；并在色谱图中对药物及内标的特征性二级碎片离子进行提取，计算药物峰面积和内标峰面积的比值，再根据标准曲线计算得到患者待测血浆样品中药物浓度；
其中，液相色谱条件：Hypersil GOLD-C18色谱柱，流动相为流动相A和流动相B，流动相梯度洗脱条件为：0-0.5min，流动相B的体积分数为20％；0.5-3.0min，流动相B的体积分数为20％-95％；3.0-6.0min，流动相B的体积分数为95％；6.0-6.1min，流动相B的体积分数为95％-20％；6.1-8.0min，流动相B的体积分数为20％；流速为0.4mL/min，进样量5μL，柱温30℃，进样器内温度4℃，其中，流动相A为体积分数为0.1％的甲酸水溶液，流动相B为100％甲醇；
质谱条件：离子源为HESI，喷雾电压3000V，毛细管温度350℃，鞘气和辅助气分别为45psi和10arb；正离子模式下以平行反应监测模式进行扫描，二级碎片扫描分辨率为17500；各药物和内标的碰撞解离能量分别为：阿帕替尼35％、克唑替尼21％、厄洛替尼37％、吉非替尼25％、埃克替尼35％、拉帕替尼35％、伊马替尼32％；各药物和内标的母离子/特征性二级碎片离子的检测离子对如下：阿帕替尼398.1975/212.0818、克唑替尼450.1258/260.1506、厄洛替尼394.1761/336.1343、吉非替尼447.1593/128.1070、埃克替尼392.1604/304.1081、拉帕替尼581.1420/458.1066、伊马替尼494.2662/394.1662。
2.如权利要求1所述的一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述标准曲线血浆样本按以下方法制得：
取100μL空白血浆，加入一定体积的某一药物贮备液和内标贮备液，或者加入一定体积的用体积分数为50％的甲醇水稀释后的某一药物贮备液和内标贮备液，制得该药物某一标准浓度的标准曲线血浆样本，并依此法分别制得各药物的不同标准浓度的标准曲线血浆样本；其中，所述药物贮备液是以甲醇作为溶剂配制的各药物浓度为1.0mg/mL的药物甲醇溶液，所述内标贮备液是以体积分数为50％的甲醇水作为溶剂配制的内标浓度为1μg/mL的内标甲醇水溶液；
所述标准曲线血浆样本中，最终内标浓度为20.0ng/mL，最终血浆各药物的标准浓度如下：
吉非替尼：0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL；
埃克替尼：0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL；
厄洛替尼：0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、8.0ng/mL、10.0ng/mL；
拉帕替尼：2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、80.0ng/mL、100.0ng/mL、160.0ng/mL、200.0ng/mL；
阿帕替尼：0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、10.0ng/mL；
克唑替尼：0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、10.0ng/mL、16.0ng/mL、20.0ng/mL。
3.如权利要求1所述的一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中，用所述混合溶液萃取所述标准曲线血浆样本中药物，包括：将所述标准曲线血浆样本涡旋20s，然后加入500μL的由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液，涡旋1min后在4℃条件下10000g离心5min，取400μL上清液置于新管内，旋转蒸发干燥后加入100μL的体积分数为50％的甲醇水重溶，随后在4℃条件下10000g离心5min，取上清置进样管中，待进样分析。
4.如权利要求1所述的一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中，用所述混合溶液萃取所述患者待测血浆样本中药物，包括：将所述患者待测血浆样本涡旋20s，然后加入500μL的由体积比为1:1的乙酸乙酯和叔丁基甲醚组成的混合溶液，涡旋1min后在4℃条件下10000g离心5min，取400μL上清液置于新管内，旋转蒸发干燥后加入100μL的体积分数为50％的甲醇水重溶，随后在4℃条件下10000g离心5min，取上清置进样管中，待进样分析。
5.如权利要求1～4中任一项所述的一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述患者待测血浆样本的体积为20μL。
6.如权利要求5所述的一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中，在萃取前，先用空白血浆稀释所述患者待测血浆样本。
7.如权利要求1所述的一种同时测定血浆中六种酪氨酸激酶抑制剂浓度的方法，其特征在于，所述Hypersil GOLD-C18色谱柱的规格为50×2.1mm，粒径为5μm。
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