CN112710771A - 一种基于hplc-ms/ms法检测abl酪氨酸激酶抑制剂的试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种基于hplc-ms/ms法检测abl酪氨酸激酶抑制剂的试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于HPLC‑MS/MS法检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的试剂盒及检测方法，ABL酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、帕纳替尼和氟马替尼；试剂盒包括如下试剂：样本处理液、标准品、质控品、内标液和流动相，流动相包括流动相A和流动相B；流动相A为0.1％甲酸甲醇溶液；流动相B为2mmol·L‑1乙酸铵‑0.1％甲酸水溶液；本发明基于HPLC‑MS/MS技术对血浆中ABL酪氨酸激酶抑制剂浓度定量检测；该检测结果不受常用药物及合并用药的干扰，并且大大提高了ABL酪氨酸激酶抑制剂定量检测的准确性；该试剂盒有助于提高ABL酪氨酸激酶抑制剂检测质量、促进检测方法标准化和规范化，使临床ABL酪氨酸激酶抑制剂血药浓度的监测更为快捷、准确、可靠。

Description

一种基于HPLC-MS/MS法检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的试剂盒 及检测方法
技术领域
本发明涉及组合物技术领域，具体涉及一种抗衰老组合物及其应用。
背景技术
慢性粒细胞白血病(CML)是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，占成人白血病的15％，全球年发病率为1.6～2.0/10万。近年来，BCR/ABL靶向的酪氨酸激酶抑制剂是CML患者临床治疗的首选药物。CML患者常伴随BCR/ABL突变，而伊马替尼(Imatinib)能特异性靶向抑制由BCR/ABL基因编码的癌蛋白的酪氨酸激酶活性，提高了CML患者的生存率，然而有报道指出，在应用Imatinib的过程中，约有15％～20％的患者治疗无效或复发，可能与其耐药有关。第二代ABL酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼(Dasatinib)、尼洛替尼(Nilotinib)和第三代帕纳替尼(Ponatinib)的陆续上市，为治疗Imatinib耐药或不耐受以及既往治疗无效的费城染色体(Ph)阳性CML患者提供了新的选择。Dasatinib作为CML二线治疗用药，其可抑制BCR/ABL1激酶和SRC家族激酶以及多种其它肿瘤中异常活化的激酶，包括KIT、EPH受体激酶和PDGFRβ受体，可克服以下原因导致的Imatinib耐药：BCR/ABL1过表达、BCR/ABL1激酶区域突变、激活包括SRC家族激酶在内的其他信号通路和多药耐药基因过表达。Nilotinib是一种氨基嘧啶衍生物，与Imatinib相比，能更加有效和选择性地抑制BCR-ABL的未突变形式和大多数突变形式的酪氨酸激酶活性。Ponatinib是第三代多靶点ABL酪氨酸激酶抑制剂，2012年12月经美国FDA批准上市，临床用于治疗携带有T315I突变阳性的成人CML(CP、AP和BP)或者携带有T315I突变阳性的Ph+ALL；还用于治疗成人未使用过其他ABL酪氨酸激酶抑制剂治疗的CML和Ph+ALL。随着治疗经验的增加，其他药物也陆续研发。国产新药氟马替尼(Flumatinib)是针对BCR/ABL设计的Imatinib结构修饰药物，能与变异的BCR/ABL结合，通过抑制BCR/ABL酪氨酸激酶活性，抑制Ph阳性的CML和部分急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者的瘤细胞增殖，从而导致白血病细胞凋亡，安全有效地治疗费城染色体阳性急性淋巴细胞性白血病(Ph+ALL)。在2014年荷兰和2015年ELN及2017年等专家共识和指南中，都推荐对ABL酪氨酸激酶抑制剂血药浓度进行监测，并给出了相应可靠的有效参考范围，为ABL酪氨酸激酶抑制剂血药浓度监测提供了依据。
目前国内外监测ABL酪氨酸激酶抑制剂血药浓度最常用的方法主要有：高效液相色谱法(HPLC)，荧光偏振免疫法(FPIA)，高效毛细管电泳法(HPCE)，放射免疫法(RIA)，受体结合法(RBA)等。
HPLC-MS/MS技术是近年来迅速发展的定量分析技术，具有高选择性、高灵敏度、样本处理简单等特点，日渐成为体内药物分析和药物代谢研究领域的实用方法。研究开发一种结果准确、价格低廉、操作简便、易于推广的ABL酪氨酸激酶抑制剂血药浓度的HPLC-MS/MS检测试剂盒，使其能广泛应用于我国ABL酪氨酸激酶抑制剂临床研究和常规血药浓度监测中，将有助于提高ABL酪氨酸激酶抑制剂检测质量、促进检测方法标准化和规范化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于HPLC-MS/MS法检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的试剂盒及检测方法，以满足ABL酪氨酸激酶抑制剂临床血药浓度监测和大规模临床研究的需要。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种基于HPLC-MS/MS法检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的试剂盒，其特征在于，所述ABL酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、帕纳替尼和氟马替尼；
所述试剂盒包括如下试剂：
样本处理液、标准品、质控品、内标液和流动相，所述流动相包括流动相A和流动相B；
所述流动相A为0.1％甲酸甲醇溶液；
所述流动相B为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液。
优选地，所述样本处理液为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液。
优选地，所述标准品包括7个不同浓度水平的ABL酪氨酸激酶抑制剂的甲醇溶液，具体如下：
Level6：包括25μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，1000ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，2500ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level5：包括10μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，500ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，1000ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level4：包括5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，250ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，500ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level3：包括2.5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，100ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，250ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level2：包括1μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，50ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，100ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level1：包括0.5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，10ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，50ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Leve0：甲醇。
优选地，所述质控品包括高中低三个不同浓度点的质控样本溶液：
Quality Control H：包括20000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，750ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，2000ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control M：包括4000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，200ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，750ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control L：包括1000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，25ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，150ng/mL的Flumatinib甲醇溶液。
优选地，所述内标液包括100ng/mL Imatinib-d8甲醇溶液，20ng/mL Dasatinib-d8甲醇溶液，100ng/mL Nilotinib-d3甲醇溶液，10ng/mL Ponatinib-d8甲醇溶液。
本发明第二方面提供一种采用上述试剂盒检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的方法，所述方法包括：在待测样本中添加样本处理液和内标液并混匀，然后离心、移取上清液；随后，将上清液注入HPLC-MS/MS系统中利用高效液相色谱对ABL酪氨酸激酶抑制剂进行富集、分离，再利用质谱同位素内标定量法，以ABL酪氨酸激酶抑制剂标准品浓度为横坐标，以ABL酪氨酸激酶抑制剂标准品实测峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，建立标准曲线，再根据标准曲线计算待测样本中ABL酪氨酸激酶抑制剂浓度。
优选地，所述高效液相色谱条件如下：
采用Ultimate XB-C18色谱柱(4.6×50mm,5um)，柱温60℃；流速0.8mL·min-1；流动相A为0.1％甲酸甲醇溶液，流动相B为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，进样量5uL；
优选地，所述高效液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：
0.01min，流动相A浓度为22.6％，保持0.49min，～0.50min流动相A浓度从22.6％～60％，～1.00min流动相A浓度从60％～100％，保持1min，～2.00min A相浓度从100％～60％，～2.50min流动相A浓度从60％～22.6％，保持0.50min停止。
优选地，所述质谱的条件如下：
采用Triple Quad 4500四级杆质量检测器，电喷雾电离源；离子极性：正离子模式；监测模式为MRM；离子喷射电压为4500V；温度为500℃；喷雾气为55；辅助加热气为55；气帘气为30；碰撞气压力为Medium；不同ABL酪氨酸激酶抑制剂及内标物的质谱条件参数如表1所示：
表1不同ABL酪氨酸激酶抑制剂及内标物的质谱条件参数
Figure BDA0002860390850000051
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明基于HPLC-MS/MS技术对血浆中ABL酪氨酸激酶抑制剂浓度定量检测；该检测结果不受常用药物及合并用药的干扰，并且在样本处理过程中加入了同位素内标，大大提高了ABL酪氨酸激酶抑制剂定量检测的准确性；该试剂盒有助于提高ABL酪氨酸激酶抑制剂检测质量、促进检测方法标准化和规范化，使临床ABL酪氨酸激酶抑制剂血药浓度的监测更为快捷、准确、可靠。
本发明通过对高效液相色谱条件的限定，能够充分富集和分离ABL酪氨酸激酶抑制剂，具有优异的ABL酪氨酸激酶抑制剂回收率，同时，该试剂盒具有优异的稳定性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为ABL酪氨酸激酶抑制剂空白血浆色谱图；
图2为血浆ABL酪氨酸激酶抑制剂色谱图。
附图中，1-Imatinib；2-Imatinib-d8；3-Flumatinib；4-Dasatinib-d8；5-Dasatinib；6-Ponatinib-d8；7-Ponatinib；8-Nilotinib-d3；9-Nilotinib。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为一种基于HPLC-MS/MS法检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的试剂盒，ABL酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、帕纳替尼和氟马替尼；
该试剂盒包括如下试剂：
样本处理液、标准品母液、质控品、内标液和流动相，所述流动相包括流动相A和流动相B
流动相A为0.1％甲酸甲醇溶液；
流动相B为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液；
样本处理液为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液；
标准品母液包括100μg/mL的Imatinib甲醇溶液、100μg/mL的Nilotinib甲醇溶液、10μg/mL的Dasatinib甲醇溶液、10μg/mL的Ponatinib甲醇溶液和10μg/mL的Flumatinib甲醇溶液；
质控品包括高中低三个不同浓度点的质控样本溶液：
Quality Control H：包括2000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，75ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，200ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control M：包括400ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，20ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，75ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control L：包括100ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，2.5ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，15ng/mL的Flumatinib甲醇溶液。
内标液包括100ng/mL Imatinib-d8甲醇溶液，20ng/mL Dasatinib-d8甲醇溶液，100ng/mL Nilotinib-d3甲醇溶液，10ng/mL Ponatinib-d8甲醇溶液。
实施例2
本实施例为实施例1中试剂盒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
1、标准品的制备：
配制标准品母液：100μg/mL Imatinib甲醇溶液配制：1mg Imatinib标准品，用甲醇溶解，并用甲醇定容至10mL容量瓶中，超声混匀，分装备用；同上操作得到100μg/mLNilotinib甲醇溶液；
10μg/mL Dasatinib甲醇溶液配制：1mg Dasatinib标准品，用甲醇溶解，并用甲醇定容至10mL容量瓶中，超声混匀，分装备用，即为100μg/mL Dasatinib，取100μL 100μg/mLDasatinib储备液，加900μL甲醇，振荡混匀，即为10μg/mL Dasatinib甲醇溶液；同上操作得10μg/mL Ponatinib甲醇溶液和10μg/mL Flumatinib甲醇溶液；
配制标准品：Imatinib标准品配制：Level6 25000ng/mL：取250μL100μg/mLImatinib甲醇溶液，加750μL甲醇，振荡混匀；Level5 10000ng/mL：取100μL100μg/mLImatinib甲醇溶液，加900μL甲醇，振荡混匀；Level4 5000ng/mL：取50μL 100μg/mLImatinib甲醇溶液，加950μL甲醇，振荡混匀；Level3 2500ng/mL：取100μLLeve6溶液，加900μL甲醇，振荡混匀；Level2 1000ng/mL：取100μLLeve5溶液，加900μL甲醇，振荡混匀；Level1500ng/mL：取100μLLeve4溶液，加900μL甲醇，振荡混匀；Leve0：甲醇；
同上操作得出上述实施例1中ABL酪氨酸激酶抑制剂七个不同浓度水平的标准品样本Level6～Leve0：
Level6：包括25μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，1000ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，2500ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level5：包括10μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，500ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，1000ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level4：包括5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，250ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，500ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level3：包括2.5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，100ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，250ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level2：包括1μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，50ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，100ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level1：包括0.5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，10ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，50ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Leve0：甲醇。
2、质控品的制备
Imatinib质控品配制：Quality Control H：取200μL100μg/mL Imatinib甲醇溶液，加800μL甲醇，振荡混匀；Quality Control M：取40μL100μg/mL Imatinib甲醇溶液，加960μL甲醇，振荡混匀；Quality Control L：取100μL Level 5，加900μL甲醇，振荡混匀。
同上操作得出上述实施例1中ABL酪氨酸激酶抑制剂中高、中、低三个不同浓度点的质控品样本：
Quality Control H：包括20000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，750ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，2000ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control M：包括4000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，200ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，750ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control L：包括1000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，25ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，150ng/mL的Flumatinib甲醇溶液。
3、样本处理液的制备
100mmol.L-1乙酸铵水溶液的配制：称取7.7g乙酸铵，用广州屈臣氏蒸馏水溶解，并用广州屈臣氏蒸馏水定容至100mL容量瓶中，即为100mmol.L-1乙酸铵溶液，超声混匀，分装备用；取1mL甲酸溶液，2mL 100mmol.L-1乙酸铵溶液，用广州屈臣氏蒸馏水定容至1000mL容量瓶中，即为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，超声混匀，分装备用。
4、内标液的制备
Imatinib内标Imatinib-d8溶液配制100μg/mL Imatinib-d8甲醇溶液配制：1mgImatinib-d8标准品，用甲醇溶解，并用甲醇定容至10mL容量瓶中，超声混匀，分装备用；
100ng/mL Imatinib-d8内标液配制：取500μL 100μg/mL Imatinib-d8储备液，用甲醇定容至500mL容量瓶中，超声混匀，分装备用；
同上操作配制20ng/mL Dasatinib-d8内标液，100ng/mL Nilotinib-d3内标液，10ng/mL Ponatinib-d8内标液，超声混匀，分装备用。
5、流动相的制备
取1mL甲酸溶液，用甲醇定容至1000mL容量瓶中，超声混匀，即为0.1％甲酸甲醇溶液(流动相A)。
100mmol.L-1乙酸铵水溶液的配制：称取7.7g乙酸铵，用广州屈臣氏蒸馏水溶解，并用广州屈臣氏蒸馏水定容至100mL容量瓶中，即为100mmol.L-1乙酸铵溶液，超声混匀，分装备用；取1mL甲酸溶液，2mL 100mmol.L-1乙酸铵溶液，用广州屈臣氏蒸馏水定容至1000mL容量瓶中，即为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液(流动相B)。
实施例3
本实施例为一种采用上述试剂盒检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的方法，该方法包括：
取待测样本100μL，加入2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液100μL，再加入含有ABL酪氨酸激酶抑制剂内标液300μL，旋涡混匀30～60S，高速离心(13200rpm)8min，移取上清液170μL，上机待测，进行HPLC-MS/MS定量分析；
其中，高效液相色谱条件如下：
采用Ultimate XB-C18色谱柱(4.6×50mm,5um)，柱温60℃；流速0.8mL·min-1；流动相A为0.1％甲酸甲醇溶液，流动相B为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，进样量5uL；
洗脱方式为梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：
0.01min，流动相A浓度为22.6％，保持0.49min，～0.50min流动相A浓度从22.6％～60％，～1.00min流动相A浓度从60％～100％，保持1min，～2.00min A相浓度从100％～60％，～2.50min流动相A浓度从60％～22.6％，保持0.50min停止。
质谱的条件如下：
采用Triple Quad 4500四级杆质量检测器，电喷雾电离源；离子极性：正离子模式；监测模式为MRM；离子喷射电压为4500V；温度为500℃；喷雾气为55；辅助加热气为55；气帘气为30；碰撞气压力为Medium；不同ABL酪氨酸激酶抑制剂及内标物的质谱条件参数如表1所示：
表1不同ABL酪氨酸激酶抑制剂及内标物的质谱条件参数
Figure BDA0002860390850000111
注：DP：declustering potential；CE：collision energy；CXP：cell exitpotential；EP：Exclusion potention。
标准曲线的绘制：将试剂盒中的标准品再次稀释10倍后，得Imatinib标曲点为：0、50、100、250、500、1000、2500ng/mL，作为校准曲线Level 0、Level 1、Level 2、Level 3、Level 4、Level 5和Level 6的实际测试浓度；以上各Level经振荡混匀，分装备用；
同上操作得出ABL酪氨酸激酶抑制剂七个不同浓度水平的标曲点如下：
Level6：包括2500ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，100ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，250ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level5：包括1000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，50ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，100ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level4：包括500ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，25ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，50ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level3：包括250ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，10ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，25ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level2：包括100ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，5ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，10ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level1：包括50ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，1ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，5ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Leve0：甲醇。
以ABL酪氨酸激酶抑制剂7个标准品样本的标示浓度为横坐标(X)，以ABL酪氨酸激酶抑制剂7个标准品样本的实测峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，以Y对X行加权二乘法回归进行线性拟合，绘制成标准曲线；拟合线性回归方程：Y＝aX+b其中a为斜率，b为截距，并计算相关系数(r)，r应不低于0.9900；
质控要求：将试剂盒中的质控品再次稀释10倍后得Imatinib质控品浓度：100、400、2000ng/mL，作为质控点Quality Control L、M和H的实际测试浓度；以上各QualityControl振荡混匀，分装备用；
同上操作得出实施例中ABL酪氨酸激酶抑制剂高、中、低三个不同浓度点的质控品样本：
Quality Control H：包括2000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，75ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，200ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control M：包括400ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，20ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，75ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control L：包括100ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，2.5ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，15ng/mL的Flumatinib甲醇溶液。
每1分析批样本随行1条标准曲线和6个质控样本(高、中、低浓度各2个)。质控样本测定结果偏差应小于15％，最多允许1/3的质控样本结果超过上述限度，但不能出现在同一浓度质控样本中。如质控样本测定结果不符合上述要求，则该分析批样本测定结果作废，重新检测。
通过上述实施例3的方法分别检测得到ABL酪氨酸激酶抑制剂空白血浆以及血浆ABL酪氨酸激酶抑制剂的色谱图，具体地，图1为ABL酪氨酸激酶抑制剂空白血浆色谱图，图2为血浆ABL酪氨酸激酶抑制剂色谱图；
由图1、图2可知：血浆中没有物质干扰此5种ABL酪氨酸激酶抑制剂测定，Imatinib、Dasatinib、Nilotinib、Ponatinib、Flumatinib出峰时间分别是1.67、1.69、1.94、1.82、1.65min，峰型良好。
实验例
1、回收率、精密度试验研究
分别取ABL酪氨酸激酶抑制剂低、中、高三个标准浓度质控品，各5份，并按照实施例3中的检测方法进行操作，连续测定3天，将实测浓度与标准浓度之比作为相对回收率，计算日间、日内精密度及相对回收率，结果如表2～表6所示；
表2 Imatinib精密度试验和回收率试验(n＝5，x±s)
Figure BDA0002860390850000131
表3 Dasatinib精密度试验和回收率试验(n＝5，x±s)
Figure BDA0002860390850000132
表4 Nilotinib精密度试验和回收率试验(n＝5，x±s)
Figure BDA0002860390850000141
表5 Ponatinib精密度试验和回收率试验(n＝5，x±s)
Figure BDA0002860390850000142
表6 Flumatinib精密度试验和回收率试验(n＝5，x±s)
Figure BDA0002860390850000143
2、ABL酪氨酸激酶抑制剂在室温保存和4℃冷藏保存条件下的稳定性
分别取ABL酪氨酸激酶抑制剂低、中、高三个标准浓度质控品，各3份；样品于4℃冷藏放置时间为72h后，按照实施例3的方法进行操作处理，分别测定各样品的浓度；其余样品于室温放置72h后，按照实施例3的方法进行操作处理后，分别测定各样品的浓度，考察其稳定性，测得浓度和标准浓度相比较，结果如表7～表11所示：
表7 Imatinib稳定性试验(n＝3，x±s，72h)
Figure BDA0002860390850000144
Figure BDA0002860390850000151
表8 Dasatinib稳定性试验(n＝3，x±s，72h)
Figure BDA0002860390850000152
表9 Nilotinib稳定性试验(n＝3，x±s，72h)
Figure BDA0002860390850000153
表10 Ponatinib稳定性试验(n＝3，x±s，72h)
Figure BDA0002860390850000154
表11 Flumatinib稳定性试验(n＝3，x±s，72h)
Figure BDA0002860390850000155
Figure BDA0002860390850000161
由表2～表11可知：本发明试剂盒具有操作简单，结果准确，精密度高，相对回收率达到95％～115％，准确度好，RSD均低于6％，精密度和稳定性高，可以满足临床成批量样本检测的要求。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (9)

1.一种基于HPLC-MS/MS法检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的试剂盒，其特征在于，所述ABL酪氨酸激酶抑制剂包括伊马替尼、达沙替尼、尼洛替尼、帕纳替尼和氟马替尼；
所述试剂盒包括如下试剂：
样本处理液、标准品、质控品、内标液和流动相，所述流动相包括流动相A和流动相B；
所述流动相A为0.1％甲酸甲醇溶液；
所述流动相B为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样本处理液为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品包括7个不同浓度水平的ABL酪氨酸激酶抑制剂的甲醇溶液，具体如下：
Level6：包括25μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，1000ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，2500ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level5：包括10μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，500ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，1000ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level4：包括5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，250ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，500ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level3：包括2.5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，100ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，250ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level2：包括1μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，50ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，100ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Level1：包括0.5μg/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，10ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，50ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Leve0：甲醇。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括高中低三个不同浓度点的质控样本溶液：
Quality Control H：包括20000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，750ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，2000ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control M：包括4000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，200ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，750ng/mL的Flumatinib甲醇溶液；
Quality Control L：包括1000ng/mL的Imatinib/Nilotinib甲醇溶液，25ng/mL的Dasatinib/Ponatinib甲醇溶液，150ng/mL的Flumatinib甲醇溶液。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内标液包括100ng/mL Imatinib-d8甲醇溶液，20ng/mL Dasatinib-d8甲醇溶液，100ng/mL Nilotinib-d3甲醇溶液，10ng/mLPonatinib-d8甲醇溶液。
6.一种采用权利要求1～5任一所述的试剂盒检测ABL酪氨酸激酶抑制剂的方法，其特征在于，包括：在待测样本中添加样本处理液和内标液并混匀，然后离心、移取上清液；随后，将上清液注入HPLC-MS/MS系统中利用高效液相色谱对ABL酪氨酸激酶抑制剂进行富集、分离，再利用质谱同位素内标定量法，以ABL酪氨酸激酶抑制剂标准品浓度为横坐标，以ABL酪氨酸激酶抑制剂标准品实测峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，建立标准曲线，再根据标准曲线计算待测样本中ABL酪氨酸激酶抑制剂浓度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件如下：
采用Ultimate XB-C18色谱柱(4.6×50mm,5um)，柱温60℃；流速0.8mL·min-1；流动相A为0.1％甲酸甲醇溶液，流动相B为2mmol·L-1乙酸铵-0.1％甲酸水溶液，进样量5uL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱程序如下：
0.01min，流动相A浓度为22.6％，保持0.49min，～0.50min流动相A浓度从22.6％～60％，～1.00min流动相A浓度从60％～100％，保持1min，～2.00min A相浓度从100％～60％，～2.50min流动相A浓度从60％～22.6％，保持0.50min停止。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质谱的条件如下：
采用Triple Quad 4500四级杆质量检测器，电喷雾电离源；离子极性：正离子模式；监测模式为MRM；离子喷射电压为4500V；温度为500℃；喷雾气为55；辅助加热气为55；气帘气为30；碰撞气压力为Medium；不同ABL酪氨酸激酶抑制剂及内标物的质谱条件参数如表1所示：
表1不同ABL酪氨酸激酶抑制剂及内标物的质谱条件参数
Figure FDA0002860390840000031
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