CN115015409A - 一种阿胶多肽lcms特征图谱的建立方法及其质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法及其质量评价方法，该方法包括了对照参比溶液及供试品溶液的制备，LCMS色谱质谱条件和数据采集模式，以及标准特征图谱的制作。本发明同时公开了由该方法得到的阿胶LCMS标准指纹图谱，该特征图谱是以阿胶中五个多肽成分为物质基础。本发明检测方法操作简便，稳定性高，重现性好，所得的图谱特征峰展示的全面，通过标准指纹图谱的共有峰对比，可以对阿胶、阿胶粉、阿胶配方颗粒进行快速的鉴别和控制，有利于全面评估药材和饮片的内在质量，确保临床用药的安全性和有效性。
Description
技术领域
本发明属于中药品质控制管理技术领域，尤其涉及一种阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法及其质量评价方法。
背景技术
阿胶是我国传统医学常用的名贵药材，与人参、鹿茸并称为中药三宝。被历代医家视为补血、止血圣药，在临床广泛应用。阿胶的制作和应用距今已有2500多年的历史。《本草纲目》称之为“圣药”，具有补血止血，滋阴润燥等功效，现代临床应用阿胶治疗血液系统、免疫系统、心血管系统、呼吸系统等疾病，说明阿胶不仅为妇科良药，更是集预防、治疗、保健、强身健体于一身的国药瑰宝，是中华民族乃至世界的宝贵财富。随着健康产业的发展与全球化进程的加速，阿胶不仅以其独特的疗效造福了我国千千万万的家庭，更是紧随世界贸易的步伐走出了国门。
阿胶是以动物器官组织作为原料，经过深加工而制成的一种特殊药品，既可以作为一种制剂直接使用，也可以作为药材进行处方配伍使用。其物质组成复杂，对其进行有效的质量控制是保证其临床疗效的重要基础。中药特征图谱是一种药材质量控制技术方法，兼具整体性和模糊性的特点，能够较为全面的反应中药整体质量。但是，目前阿胶的质量控制方法，特别是以质谱技术为核心的分析方法，受限于在单个提取离子流通道内的色谱峰定性定量分析，单个通道内的色谱峰仅呈现一个多肽成分的离子信息，无法将阿胶中多种特征性多肽成分进行整体分析，限制了阿胶特征图谱检测方法的发展。
目前国内外对于阿胶中以多肽作为物质基础建立LCMS特征图谱的相关文献未见报道。因此提供一种新型的阿胶LCMS特征图谱建立方法，可以有效反应阿胶药品多肽成分的整体性和复杂性，对阿胶品质进行全面的评价和控制，进而为临床安全有效的用药提供保证。
发明内容
针对阿胶现有检测手段的不足，本发明提供一种阿胶多肽LCMS特征图谱建立方法。该方法实现了对阿胶多肽整体检测，对其现有的质量控制体系做到有效的补充，进而为阿胶的鉴别和质控提供可靠依据。
本发明提供一种阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法，包括下列步骤：
1)对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液和供试品溶液的制备：取阿胶对照药材适量，加碳酸氢铵溶液溶解后加入胰蛋白酶酶解，滤过取续滤液，作为对照药材参照物溶液；取驴源多肽A1对照品、驴源多肽A2对照品适量，加碳酸氢铵溶液溶解，作为对照品参照物溶液；
取阿胶待测样品适量，加碳酸氢铵溶液溶解后加入胰蛋白酶酶解，滤过取续滤液，作为供试品溶液；
2)LCMS色谱质谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速0.2～0.5ml/min；采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM)，监测离子对300～700Da。
3)特征图谱的建立：按照步骤2)色谱质谱条件对对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液和供试品溶液进行数据采集，获得阿胶样品的总离子流图(TIC)和各通道提取离子流图(XIC)，使用ChemPattern软件生成共有模式，从而确定阿胶多肽的LCMS标准特征图谱。
优选的，步骤1)所述的对照药材参照物溶液和供试品溶液，按如下步骤制备：取样品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；
精密量取1ml至5ml量瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前新制)1ml，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，37℃恒温酶解12小时，滤过，得对照药材参照物溶液或供试品溶液。
优选的，步骤2)所述的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18色谱柱。
进一步优选，色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.8μm。
优选的，步骤2)所述梯度洗脱条件为：
优选的，步骤2)所述离子对为：
本发明的另一个目的是提供一种通过上述方法建立的阿胶多肽LCMS标准指纹图谱。
所述阿胶多肽的LCMS标准指纹图谱，将10批阿胶样品，按上述方法制备成供试品溶液，以LCMS分离检测，数据导入chempattern软件处理分析，选择轮廓质谱图，质核比容差0.01Da，以高斯曲线模拟得到阿胶LCMS标准特征图谱。
本发明所获得的特征图谱包括5个共有峰，以驴源多肽A1为参比峰，各共有峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为0.16(峰1)、0.51(峰2)、1.09(峰4)、1.34(峰5)。
通过对照品对比，共有峰3为驴源多肽A1、峰4为驴源多肽A2。
本发明的目的三是利用上述方法建立的指纹图谱评价阿胶质量。
优选的：评价阿胶质量的方法为：建立指纹图谱后，进行方法学验证考察精密度、稳定性以及重复性，再利用相同检测条件检测待测样品，检测结果通过相似度评价软件对比评价，从而完成对待测阿胶样品的质量评价。
本发明的有益效果：
本发明方法首次以阿胶的轮廓质谱信息结合ChemPattern软件，建立了阿胶的LCMS特征图谱，实现多种特征性多肽成分的整体分析，解决了现有方法仅在单个提取离子流通道内进行分析的限制。
本发明提供了一种新型的阿胶LCMS特征图谱建立方法，可以有效反应阿胶药品多肽成分的整体性和复杂性，对阿胶品质进行全面的评价和控制，进而为临床安全有效的用药提供保证。
本发明检测方法操作简便，稳定性高，重现性好，所得的图谱特征峰展示的全面，通过标准指纹图谱的共有峰对比，可以对阿胶、阿胶粉、阿胶配方颗粒进行快速的鉴别和控制，有利于全面评估药材和饮片的内在质量，确保临床用药的安全性和有效性。
附图说明
图1为阿胶LCMS标准特征图谱，共有峰3为驴源多肽A1、峰4为驴源多肽A2；
图2为阿胶配方颗粒LCMS特征图谱。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案和优点更加清晰，以下将结合附图对实施例中的技术方案进行清楚完整的描述。显而易见，以下实施例是本申请实施例的一部分，而不是全部，因此，以下对实施例的详细描述并非限定本申请要求保护的范围，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下做出的等同替换或修改，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1阿胶LCMS标准特征图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
AB SCIEX 6500+液相色谱质谱联用仪，赛多利斯XSE205电子天平，Climacell222恒温恒湿箱。
1.2试药
10批阿胶样品来自市场收集。阿胶对照药材、驴源多肽A1、A2购自于中国食品药品检定研究院。乙腈和甲酸为色谱纯、水为纯化水、其余试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱质谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml。
采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM)，监测离子对见下表：
2.2对照药材参比溶液、对照品参比溶液和供试品参比溶液的制备：
取阿胶对照药材0.1g，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml至5ml量瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前新制)1ml，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，37℃恒温酶解12小时，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取驴源多肽A1对照品、驴源多肽A2对照品适量，精密称定，加1％碳酸氢铵溶液制成每1ml各含2.5μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取本品粉末0.1g，精密称定，同对照药材参照物溶液的制备方法，制成供试品溶液。
2.3标准特征图谱的建立
测定10个批次的阿胶样品，获得10份样品的LCMS图谱，导出原始数据，导入到chempattern软件，选择轮廓质谱图，质核比容差0.01Da，以高斯曲线模拟生成共有模式，作为标准特征图谱。如图1所示。其中以3号驴源多肽A1为参照峰，计算出该标准指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间tR为0.16(峰1)、0.51(峰2)、1.09(峰4)、1.34(峰5)。其中3号峰为驴源多肽A1，4号峰为驴源多肽A2。
将10批次阿胶样品测得的TIC图谱导出，样品共有峰的相对保留时间分别列于下表。
典型样品的特征图谱见图2。
2.4方法学考察
2.4.1耐用性考察
取样品A1，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别于AB sciex 6500+液质联用仪和岛津8050液质联用仪两台仪器进行2次重复测定。两台仪器对A1的测定结果一致，共有峰的相对保留时间的RSD＜1％。标明方法对不同型号的仪器耐用性良好，适用范围广。
2.4.2稳定性实验
取样品A1，按照2.2项下方法制备供试品溶液，每间隔2小时进样一次，连续进样24小时，共进样12针，计算共有峰相对保留时间RSD＜0.5％，标明本方法制备的供试品溶液在24小时内稳定性良好。
2.4.3重现性实验
取样品A1，按照2.2项下方法制备供试品溶液，平行制备6份，分别进样，计算6份样品共有峰相对保留时间RSD＜0.2％，标明本方法重现性良好。
实施例2阿胶配方颗粒特征图谱的测定
1.1仪器
AB SCIEX 6500+液相色谱质谱联用仪，赛多利斯XSE205电子天平，Climacell222恒温恒湿箱。
1.2试药
1批阿胶配方颗粒样品来自市场收集。阿胶对照药材、驴源多肽A1、A2购自于中国食品药品检定研究院。乙腈和甲酸为色谱纯、水为纯化水、其余试剂为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱质谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(色谱柱内径2.1mm)；以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，流速为每分钟0.3ml。
采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)正离子模式下多反应监测(MRM)，监测离子对见下表：
2.2对照药材参比溶液、对照品参比溶液和供试品参比溶液的制备：
取阿胶对照药材0.1g，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml至5ml量瓶中，加胰蛋白酶溶液(取序列分析级胰蛋白酶，加1％碳酸氢铵溶液制成每1ml中含1mg的溶液，临用前新制)1ml，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，37℃恒温酶解12小时，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取驴源多肽A1对照品、驴源多肽A2对照品适量，精密称定，加1％碳酸氢铵溶液制成每1ml各含2.5μg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备取配方颗粒，研细成粉末0.1g，精密称定，同对照药材参照物溶液的制备方法，制成供试品溶液。
2.3特征图谱的测定
测定阿胶配方颗粒样品，获得样品的LCMS图谱，以3号驴源多肽A1为参照峰，计算该指纹图谱中共有峰的相对保留时间tR为0.16(峰1)、0.51(峰2)、1.09(峰4)、1.34(峰5)。其中3号峰为驴源多肽A1，4号峰为驴源多肽A2。
以上内容仅仅是对本发明的结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法，其特征是：包括下列步骤：
1)对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液和供试品溶液的制备：取阿胶对照药材适量，加碳酸氢铵溶液溶解后加入胰蛋白酶酶解，滤过取续滤液，作为对照药材参照物溶液；取驴源多肽A1对照品、驴源多肽A2对照品适量，加碳酸氢铵溶液溶解，作为对照品参照物溶液；
取阿胶待测样品适量，加碳酸氢铵溶液溶解后加入胰蛋白酶酶解，滤过取续滤液，作为供试品溶液；
2)LCMS色谱质谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，流速0.2～0.5ml/min；采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化正离子模式下多反应监测，监测离子对300～700Da。
3)特征图谱的建立：按照步骤2)色谱质谱条件对对照药材参照物溶液、对照品参照物溶液和供试品溶液进行采集数据，获得各样品的总离子流图和各通道提取离子流图，使用ChemPattern软件生成共有模式，从而确定阿胶多肽的LCMS标准特征图谱。
2.如权利要求1所述的阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法，其特征是：所述步骤1)的对照药材参照物溶液和供试品溶液，按如下步骤制备：取样品粉末0.1g，置50ml量瓶中，加1％碳酸氢铵溶液40ml，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀；
精密量取1ml至5ml量瓶中，加胰蛋白酶溶液1ml，加1％碳酸氢铵溶液稀释至刻度，摇匀，37℃恒温酶解12小时，滤过，得对照药材参照物溶液或供试品溶液。
3.如权利要求1所述的阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法，其特征是：所述步骤2)的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18色谱柱。
4.如权利要求3所述的阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法，其特征是：所述色谱柱规格为2.1mm×100mm，1.8μm。
5.如权利要求1所述的阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法，其特征是：所述步骤2)梯度洗脱条件为：
6.如权利要求1所述的阿胶多肽LCMS特征图谱的建立方法，其特征是：所述步骤2)离子对为：
7.通过权利要求1-6任一所述方法建立的阿胶多肽LCMS标准指纹图谱。
8.如权利要求7所述的阿胶多肽LCMS标准指纹图谱，其特征是：所述特征图谱包括5个共有峰，以驴源多肽A1为参比峰，各共有峰相对保留时间与参照峰相对保留时间比值分别为0.16(峰1)、0.51(峰2)、1.09(峰4)、1.34(峰5)。
9.利用权利要求1-6任一所述方法建立评价阿胶质量的方法。
10.如权利要求9所述的评价阿胶质量的方法，其特征是：具体为：建立指纹图谱后，进行方法学验证考察精密度、稳定性以及重复性，再利用相同检测条件检测待测样品，检测结果通过相似度评价软件对比评价，从而完成对待测阿胶样品的质量评价。
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