CN112782291A - 一种阿胶及其制剂中驴源性成分的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于检测领域，具体涉及一种阿胶及其制剂中驴源性成分的鉴定方法。该鉴定方法具体通过以下步骤实现：（1）标准溶液配置：吸取驴源多肽A1、驴源多肽A2标准储备液，碳酸氢铵溶液稀释至刻度，配制混合标准工作溶液；吸取驴源多肽A1同位素、驴源多肽A2同位素标准储备液，碳酸氢铵溶液稀释至刻度，配制成混合内标工作溶液；（2）标准曲线制备；（3）试样处理后采用液相色谱‑质谱法进行检测。本发明提供的鉴定方法，鉴定结果准确，且操作简单，大大降低了检测成本；本发明提供的方法重复性好，且稳定性好，能够更加全面的监控阿胶及其制剂的质量。
Description
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及一种阿胶及其制剂中驴源性成分的鉴定方法。
背景技术
阿胶是一种固体胶，通过对马科动物驴的鲜皮或者干燥皮进行煎煮、浓缩而制成。阿胶能够调节人体机能、提高人体免疫力，同时在肿瘤、哮喘等疾病的防治过程中有着辅助性治疗作用。利用阿胶作为原料，采用现代技术衍生出许多阿胶产品：阿胶浆、复方阿胶浆、阿胶口服液等，阿胶浆等对于气血不足的疾病症状能有很好的治疗和保健功效，同时还具有美容养颜的功效。但是，由于驴养殖业发展滞后，且驴的生长周期慢，导致驴的存栏数日渐下滑，使得市场上驴皮作为主要原料出现短缺，且加个飞快上涨，甚至出现掺假掺杂等现象，严重扰乱市场。
中国专利申请CN109576379A公开了一种鉴定阿胶中驴源性成分的特异性引物及试剂盒，其通过DNA提取，PCR特异性扩增等来鉴别原料中是否存在驴源性成分，该类方法试验过程繁琐，检测成本高，且需要特定的设备进行检测。中国专利CN105842375A公开了一种鉴别阿胶及其制品中驴源性成分的多肽，该方法指出了35条特异性多肽，该方法可能出现漏检，准确性有待提高。因此，研究一种更加高效、准确率高的驴源性成分的鉴定方法成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种阿胶及其制剂中驴源性成分的鉴定方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种阿胶及其制剂中驴源性成分的鉴定方法， 具体包括以下步骤：
（1）标准溶液配置：准确称取驴源多肽A1、驴源多肽A2对照品各10 mg，分别置于10mL容量瓶，用1%碳酸氢铵溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL 的驴源多肽A1、驴源多肽A2标准储备液；准确称取驴源多肽A1、驴源多肽A2同位素内标各10 mg，分别置于10mL容量瓶，用1%碳酸氢铵溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL 的驴源多肽A1同位素、驴源多肽A2同位素标准储备液，-18℃保存；分别准确吸取驴源多肽A1、驴源多肽A2标准储备液各200 μL于10mL容量瓶，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，配制成浓度为20 μg/mL混合标准工作溶液；分别准确吸取驴源多肽A1同位素、驴源多肽A2同位素标准储备液各100 μL于10 mL容量瓶，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL混合内标工作溶液；
（2）标准曲线制备：分别准确移取混合标准工作溶液，分别加入混合内标工作溶液，用1%碳酸氢铵溶液稀释，配制成浓度为20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500ng/mL的系列标准溶液，内标浓度均为200 ng/mL，供液相色谱-串联质谱测定；
（3）试样处理：称取粉碎混匀后的阿胶试样0.1g，置于50 mL离心管中，加1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度；取混匀后的阿胶浆2.0 g，置于15 mL离心管中，加1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至10ml；称取粉碎混匀后的阿胶糕1.0g，置于50 mL离心管中，加1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度。分别准确吸取1.00 mL于15 mL离心管中，加胰蛋白酶溶液1.0 mL，再加入混合内标工作溶液100 μL，用1%碳酸氢铵溶液稀释至5 mL，摇匀，置于恒温箱中，于37℃恒温酶解16小时，取出，冷却至室温，经0.22 μm滤膜过滤，采用液相色谱-质谱法进行检测。
本发明所使用的驴源多肽A1氨基酸序列为GPAGPTGPVGK，如SEQ ID NO.1所示；所述驴源多肽A2氨基酸序列为GEAGAAGPAGPAGPR，如SEQ ID NO.2所示；所述驴源多肽A1同位素氨基酸序列为G(15N)PA(15N)GPTGPVGK；所述驴源多肽A2同位素氨基酸序列为G(15N)EA(15N)GAAGPAGPAGPR。
进一步的，所述液相色谱的条件为：C18（100 mm×1 mm，5 μm），流速：0.3 mL/min；柱温：30℃；进样量：2 µL；流动相：A相：0.1%甲酸水，B相：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱。
进一步的，所述梯度洗脱为分段洗脱，第一段洗脱条件为：0-2min，95%A+5%B；2-5min，50%A+50%B；5-7min，30%A+70%B；7-10min，95%A+5%B；第二阶段洗脱条件为：0-3min，80%A+20%B；3-5min，60%A+40%B；5-8min，55%A+45%B；8-10min，20%A+80%B。
进一步的，所述质谱的条件为：离子源：电喷雾（ESI）；扫描方式：正离子； 检测方式：多反应监测；毛细管电压：3.5 kV；二级锥孔电压：3.0 V；离子源温度：140℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔反吹气流量：50 L/h；定性离子对、定量离子对及碰撞能量如下所示：
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的鉴定方法，鉴定结果准确，且操作简单，大大降低了检测成本；
（2）通过对检测过程中流动相、洗脱程序等的筛选和优化，本发明提供的方法重复性好、稳定性好，能够更加全面的监控阿胶及其制剂的质量。
附图说明
图1为驴源多肽A1、驴源多肽A2标准溶液（50ng/mL）标准溶液离子质量色谱图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
本发明所使用的仪器和设备：液相色谱-串联质谱仪：配电 喷雾离子源，质量范围1～1500质核比（m/z）。分析天平：感量分别为0.01 g、0.1 mg和0.01 mg；恒温箱：30℃～100℃，或性能相当者；超声波振荡器；涡旋混合器。
实施例1
（1）试样制备
取试样不少于10g，粉碎混匀，备用。
（2） 试样保存
试样于4 ℃保存。
（3）试样处理
称取研磨成细粉的阿胶0.1g（精确至0.0001g），置于50 mL容量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，准确吸取1.00 mL于15 mL塑料离心管中，加胰蛋白酶溶液（4.4）1.0 mL，再加入混合内标工作溶液（4.4.4）100 μL，用1%碳酸氢铵溶液（4.3）稀释至5 mL，摇匀，置于恒温箱中，于37℃恒温酶解16小时，取出，冷却至室温，经0.22 μm滤膜过滤，待上机测定。
（4）液相色谱参考条件
a) 色谱柱：C18（100 mm×1 mm，5 μm）；
b) 流动相：A相：0.1%甲酸水，B相：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱条件：第一段洗脱条件为：0-2min，95%A+5%B；2-5min，50%A+50%B；5-7min，30%A+70%B；7-10min，95%A+5%B；第二阶段洗脱条件为：0-3min，80%A+20%B；3-5min，60%A+40%B；5-8min，55%A+45%B；8-10min，20%A+80%B；
c) 流速：0.3 mL/min；
d) 柱温：30℃；
e) 进样量：2 µL；
（5）质谱条件
a) 离子源：电喷雾（ESI）；
b) 扫描方式：正离子；
c) 检测方式：多反应监测；
d) 毛细管电压：3.5 kV；
e) 二级锥孔电压：3.0 V；
f) 离子源温度：140℃；
g) 脱溶剂气温度：350 ℃；
h) 脱溶剂气流量：800L/h；
i) 锥孔反吹气流量：50 L/h；
k) 定性离子对、定量离子对及碰撞能量见表1。
表1定性、定量离子对及碰撞能
对比例1
其他步骤同实施例1，不同之处在于：液相色谱参考条件：
a)色谱柱：C18（100 mm×1 mm，5 μm）；
b)流动相：A相：0.1%甲酸水，B相：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱条件：0-2min，95%A+5%B；2-8min，50%A+50%B；8-15min，30%A+70%B；15-20min，95%A+5%B；
c)流速：0.3 mL/min；
d)柱温：30℃；
e)进样量：2 µL；
通过该梯度洗脱条件进行洗脱时，峰形差，定量限为0.050%，灵敏度降低。
（一）定性测定
在相同测试条件下，试样溶液中驴源多肽A1、驴源多肽A2的保留时间与标准工作液中驴源多肽A1、驴源多肽A2的保留时间之比，偏差在±5%以内，且试样中目标离子的相对丰度，应当与浓度相当的标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表2 要求。
表2 定性确证时相对离子丰度的允许偏差
（二）定量测定
将标准工作溶液和试样溶液分别注入到液质联用仪中，按内标法以峰面积比定量，标准溶液及试样溶液中各目标物与其内标物峰面积比均应在仪器检测的线性范围内。必要时，应将试样进行稀释，使测试浓度在标曲范围内，以保证检测结果的准确性。在上述色谱-质谱条件下，驴源多肽A1、驴源多肽A2标准溶液特征离子质量色谱图如图1所示。
（1）分析结果的表述
试样中阿胶含量按下式计算：
式中：
X-试样中阿胶含量，单位为%；
C 1-从标准曲线上查得试样中驴源多肽A1的浓度，单位为ng/mL；
C 2-从标准曲线上查得试样中驴源多肽A2的浓度，单位为ng/mL；
V-定容体积，单位为mL；
n-稀释倍数，n=5；
K-食品阿胶中驴源多肽A1、驴源多肽A2的含量限度和，K=0.1%；
m-试样的质量，单位为g。
结果保留三位有效数字。
（2）灵敏度
该方法驴源多肽A1、A2检出限均为0.012%，定量限均为0.030%。
（3）准确度
本方法在阿胶含量1.0%，2.0%，4.0%添加水平上的平均回收率为90.0 %～120.0%。
（3）准确度
本方法在阿胶含量1.0%，2.0%，4.0%添加水平上的平均回收率为90.0 %～120.0%。
（4）精密度
在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
（5）特异性试验
采用猪、牛、羊、骆驼、鹿皮采用相同的方法熬制的胶，采用本发明提供的方法进行检测，均未检出驴源性成分。
核苷酸序列表
<110>山东省食品药品检验研究院
<120>一种阿胶及其制剂中驴源性成分的鉴定方法
<160>2
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
Gly Pro Ala Gly Pro Thr Gly Pro Val Gly Lys 10
1 5 10
<210>2
<211>15
<212> PRT
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
Gly Glu Ala Gly Ala Ala Gly Pro Ala Gly Pro Ala Gly Pro Arg 15
1 5 10 15
Claims (5)
1.一种阿胶及其制剂中驴源性成分的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）标准溶液配置：准确称取驴源多肽A1、驴源多肽A2对照品各10 mg，分别置于10 mL容量瓶，用1%碳酸氢铵溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL 的驴源多肽A1、驴源多肽A2标准储备液；准确称取驴源多肽A1、驴源多肽A2同位素内标各10 mg，分别置于10mL容量瓶，用1%碳酸氢铵溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1.0 mg/mL 的驴源多肽A1同位素、驴源多肽A2同位素标准储备液，-18℃保存；分别准确吸取驴源多肽A1、驴源多肽A2标准储备液各200 μL于10mL容量瓶，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，配制成浓度为20 μg/mL混合标准工作溶液；分别准确吸取驴源多肽A1同位素、驴源多肽A2同位素标准储备液各100 μL于10 mL容量瓶，1%碳酸氢铵溶液稀释至刻度，配制成浓度为10 μg/mL混合内标工作溶液；
（2）标准曲线制备：分别准确移取混合标准工作溶液，分别加入混合内标工作溶液，用1%碳酸氢铵溶液稀释，配制成浓度为20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的系列标准溶液，内标浓度均为200 ng/mL，供液相色谱-串联质谱测定；
（3）试样处理：称取混匀后的试样2.0 g，置于10 mL容量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至刻度，准确吸取1.00 mL于15 mL离心管中，加胰蛋白酶溶液1.0 mL，再加入混合内标工作溶液100 μL，用1%碳酸氢铵溶液稀释至5 mL，摇匀，置于恒温箱中，于37℃恒温酶解16小时，取出，冷却至室温，经0.22 μm滤膜过滤，采用液相色谱-质谱法进行检测。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述驴源多肽A1氨基酸序列为GPAGPTGPVGK；所述驴源多肽A2氨基酸序列为GEAGAAGPAGPAGPR；所述驴源多肽A1同位素氨基酸序列为G(15N)PA(15N)GPTGPVGK；所述驴源多肽A2同位素氨基酸序列为G(15N)EA(15N)GAAGPAGPAGPR。
3. 根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述液相色谱的条件为：C18（100 mm×1 mm，5 μm），流速：0.3 mL/min；柱温：30℃；进样量：2 µL；流动相：A相：0.1%甲酸水，B相：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱。
4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述梯度洗脱为分段洗脱，第一段洗脱条件为：0-2min，95%A+5%B；2-5min，50%A+50%B；5-7min，30%A+70%B；7-10min，95%A+5%B；第二阶段洗脱条件为：0-3min，80%A+20%B；3-5min，60%A+40%B；5-8min，55%A+45%B；8-10min，20%A+80%B。
5.根据权利要求1-4任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述质谱的条件为：离子源：电喷雾（ESI）；扫描方式：正离子； 检测方式：多反应监测；毛细管电压：3.5 kV；二级锥孔电压：3.0 V；离子源温度：140℃；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：800L/h；锥孔反吹气流量：50 L/h；定性离子对、定量离子对及碰撞能量如下所示：
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