CN107991424B - 蛴螬的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛴螬的检测方法，该方法包括薄层色谱鉴别方法和蛴螬中肌苷、鸟苷的含量测定；所述薄层色谱鉴别具体操作步骤为：制备供试品溶液、对照药材溶液，参照薄层色谱法试验，以环己烷：乙酸乙酯：甲醇=10:10:0.5作为展开剂进行展开，在紫外光灯下检视即可；所述肌苷、鸟苷的含量测定，具体步骤为：制备供试品溶液、混合对照品溶液，在下述色谱条件下检测：以乙腈为流动相A,以0.08%三氟乙酸为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为260nm；流速1.0 mL·min^‑1；检测器：紫外；柱温：30℃；进样量：10µL。该检测方法能够对蛴螬材的品质进行有效评估，且方法简单、快速、准确、重现性好。

Description

蛴螬的检测方法

技术领域

本发明属于中药材检测领域，具体涉及蛴螬的检测方法。

背景技术

蛴螬为金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子Holotrichia diomphalia Bates的干燥幼虫。收载于《中药大辞典》下册，第二版3224页，为我国习用药材。蛴螬具有破瘀、散结、止痛、解毒等功效；主血瘀经闭、症瘕、折伤瘀痛、痛风、破伤风、喉痹、痈肿、丹毒等。

大部分文献报道中，蛴螬多采用氨基酸测定、定氮法测定蛋白质等方法进行质量评价，但针对蛴螬的质量控制不具有专属性研究。大黄虫丸(收载于《中国药典》2015年版一部499页)、大黄虫胶囊、大黄虫片、大虻虫丸、干漆丸、山茱萸丸、天浆子丸等成方制剂中均用到蛴螬，并且蛴螬列入《中国药典》2015年版四部成方制剂中本版药典未收载的药材和饮片中。因蛴螬未有完善的质量标准控制方法，地方标准不具有专属性，且国内数十家药品企业生产的中成药中均用到了蛴螬药材，鉴于企业发展与需求，建立蛴螬的质量标准，有助于推行业的规范与发展，为质量评价和控制提供科学、有效的方法和依据。此外，建立蛴螬质量标准对于提升药品质量起到关键作用，具有重要的社会效益和经济效益。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种蛴螬的检测方法，所述方法包括：薄层色谱鉴别和蛴螬中肌苷、鸟苷的含量测定；其中，所述薄层色谱鉴别，具体操作步骤为：取本品粉末2.0g，加甲醇20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取蛴螬对照药材2.0g，同法制成对照药材溶液；参照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按体积配比以环己烷：乙酸乙酯：甲醇＝10:10:0.5作为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

所述蛴螬中肌苷、鸟苷的含量测定，具体操作步骤如下：

(1)肌苷对照品溶液的制备：精密称取肌苷对照品11.58mg，置20ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得肌苷对照品溶液；

(2)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品13.41mg，置200ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得鸟苷对照品溶液；

(3)混合对照品溶液的制备：分别精密吸取肌苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液各1ml，至10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得混合对照品溶液；

(4)供试品溶液的制备：取蛴螬药材粉末，混匀，精密称定2.0070g，置具塞锥形瓶中，加入超纯水20ml，精密称定重量,超声处理30分钟，放冷，补足减失的重量,混匀,过滤，得供试品溶液；

(5)色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A,以0.08％三氟乙酸为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：

检测波长为260nm；流速1.0mL·min^-1；检测器：紫外；柱温：30℃；进样量：10μL；

(6)测定：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录40min的色谱图，即得。

本发明的优点和有益效果为：

(1)本发明所述方法可全面评价和控制蛴螬质量，对原检测方法进行有效补充，采用蛴螬对照药材进行薄层色谱鉴别，方法操作简便，荧光斑点清晰。

(2)本发明采用测定肌苷、鸟苷进行含量控制，因肌苷、鸟苷为蛴螬的活性成分且化学结构稳定，分析过程杂质干扰少，控制含量可有效评价蛴螬药材的品质。该检测方法操作易行，定性测定专属性强、分离效果好，精密度、重现性高，稳定性良好，能够有效的为蛴螬药材的质量控制提供科学依据。

附图说明

图1蛴螬薄层色谱图。

图2肌苷线性回归方程。

图3鸟苷线性回归方程。

图4肌苷、鸟苷混合对照品高效液相色谱图。

图5编号为A供试品高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。

实施例1

1、仪器与试药

1.1仪器：UltiMate 3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；2001B型系列超纯水器(北京普析通用仪器有限责任公司)；电子天平BT125D型万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造)；SK5200H超声波清洗器(300W 60Hz上海科导仪器有限公司)；LINOMAT 5薄层色谱点样仪、TLC VISUALIZER薄层色谱数码成像系统(卡玛公司)。

1.2试药与试剂：蛴螬对照药材(来源：北京同仁堂股份有限公司,经鉴定为正品蛴螬)；肌苷对照品(批号140669-201305；含量为99.1％；使用前不需干燥,来源：中国食品药品检定研究院)；鸟苷(批号111977-201501；含量为93.6％；本品使用前无需处理,来源：中国食品药品检定研究院)；蛴螬(市售及采集十批药材,规定编号为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J)。环己烷、乙酸乙酯为分析纯；甲醇、三氟乙酸为色谱纯；水为超纯水；硅胶G薄层色谱预制板(规格：20×10cm，涂层厚度0.2mm±0.03m；来源：烟台市化学工业研究所，批号：20150825)；色谱柱为Waters HSS T 3(5μm 4.6×250mm)。

1.3方法与结果：

1.3.1薄层色谱法

蛴螬薄层色谱鉴别方法：取本品粉末2.0g，加甲醇20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取蛴螬对照药材2.0g，同法制成对照药材溶液；

参照薄层色谱法(中华人民共和国药典2015年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲醇按体积配比10:10:0.5作为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点，结果见图1。图1中，供试品1为编号A的蛴螬、供试品2为编号B的蛴螬、供试品3为编号的C蛴螬、供试品4为编号D的蛴螬、供试品5为编号E的蛴螬、供试品6为编号F的蛴螬、供试品7为编号G的蛴螬、供试品8为编号H的蛴螬、蛴螬供试品9为编号I的蛴螬、供试品10为编号J的蛴螬、供试品S为蛴螬对照药材。

1.3.2高效液相色谱法测定蛴螬中肌苷、鸟苷的含量

1.3.2.1肌苷对照品溶液的制备：精密称取肌苷对照品11.58mg，置20ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得肌苷对照品溶液。

1.3.2.2鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品13.41mg，置200ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得鸟苷对照品溶液。

1.3.2.3混合对照品溶液的制备：分别精密吸取肌苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液各1ml，至10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得混合对照品溶液。

1.3.2.4供试品溶液的制备：取蛴螬药材粉末，混匀，精密称定2.0070g，置具塞锥形瓶中，加入超纯水20ml，精密称定重量,超声处理30分钟，放冷，补足减失的重量,混匀,过滤，得供试品溶液。

1.3.2.5色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A,以质量分数为0.08％的三氟乙酸水溶液为流动相B，按表1中规定进行梯度洗脱；检测波长为260nm；流速1.0mL·min^-1；检测器：紫外；柱温：30℃；进样量：10μL；

表1梯度洗脱表

1.3.2.6测定：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录40min的色谱图，即得。

1.4方法学考查

1.4.1线性关系：混合对照品溶液0.1μl、1μl、5μl、10μl、20μl分别注入液相色谱仪，按照上述色谱条件对样品进行测定，以峰面积为纵坐标(Y)，进样质量为横坐标(X)，峰面积对质量作线性回归方程；得回归方程，结果见表2。

表2线性关系方程

上述结果表明，肌苷、鸟苷具有良好的线性关系，见图2、3。

1.4.2精密度试验：取混合对照品溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，测定其峰面积，结果见表3，结果表明仪器精密度良好。

表3精密度试验

1.4.3稳定性试验：取编号为A的供试品2.0029g，按照供试品制备方法制成供试品溶液，按照上述色谱条件分别做0、3、6、9、12、18h的色谱图，测定其稳定性，肌苷、鸟苷的峰面积的RSD分别为0.84％；1.40％，由实验数据说明样品溶液在18h内基本稳定，该方法稳定性良好，结果见表4。

表4稳定性试验结果

1.4.4重复性试验：取编号为A的供试品6份，按照含量测定样品溶液的配制方法制备溶液，并依照上述色谱条件测定，结果肌苷、鸟苷的RSD分别为1.78％、1.76％。表明方法重复性良好，结果见表5。

表5重复性试验结果

1.4.5回收率试验：精密称取编号为A的供试品6份，每份分别依次加入肌苷、鸟苷对照品浓度为3.36mg/ml；0.5516mg/ml的溶液10.00ml，按供试品制备方法制备，测定方法同供试品测定方法操作，计算其加标回收率,结果见表6。

表6回收率试验结果

1.5样品含量测定

按上述色谱条件测定十批供试品溶液，每克蛴螬中含肌苷、鸟苷见表7。

表7样品含量测定结果

综上，本发明所建立的薄层色谱鉴别，专属性强；高效液相色谱法测定蛴螬中肌苷、鸟苷含量具有精密度好、重复性、稳定性良好的特点，可全面、有效地用于控制与评价药材的质量。

本发明在确实上述检测方法的同时，还曾尝试以甲醇为流动相A，0.08％三氟乙酸为流动相B；乙腈为流动相A,水为流动相B；乙腈为流动相A,以0.1％甲酸为流动相B；乙腈为流动相A,以0.1％乙酸为流动相B，但结果并不理想，上述这些色谱条件无论如何进行调试都会存在峰形拖尾或色谱峰不对称等缺点，只有采用乙腈为流动相A,以0.08％三氟乙酸为流动相B，且按照上述梯度洗脱方式进行梯度洗脱时峰形才不拖尾，且色谱峰对称。

Claims (1)

1.蛴螬的检测方法，其特征在于：包括薄层色谱鉴别和蛴螬中肌苷、鸟苷的含量测定；

所述薄层色谱鉴别，具体操作步骤如下：

取本品粉末2.0g，加甲醇20ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取蛴螬对照药材2.0g，同法制成对照药材溶液；参照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按体积配比以环己烷：乙酸乙酯：甲醇＝10:10:0.5作为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm的紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光主斑点；

所述蛴螬中肌苷、鸟苷的含量测定，具体操作步骤如下：

(1)肌苷对照品溶液的制备：精密称取肌苷对照品11.58mg，置20ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得肌苷对照品溶液；

(2)鸟苷对照品溶液的制备：精密称取鸟苷对照品13.41mg，置200ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得鸟苷对照品溶液；

(3)混合对照品溶液的制备：分别精密吸取肌苷对照品溶液、鸟苷对照品溶液各1ml，至10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀，得混合对照品溶液；

(4)供试品溶液的制备：取蛴螬药材粉末，混匀，精密称定2.0070g，置具塞锥形瓶中，加入超纯水20ml，精密称定重量,超声处理30分钟，放冷，补足减失的重量,混匀,过滤，得供试品溶液；

(5)色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A,以0.08％三氟乙酸为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱条件为：

检测波长为260nm；流速1.0mL·min^-1；检测器：紫外；柱温：30℃；进样量：10μL；

(6)测定：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱，测定，记录40min的色谱图，即得。