CN101000331A - 表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法 - Google Patents
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Abstract
表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法:1.样品用有机溶剂或60℃以上高温水提取,提取液作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上的含量与比例,为检测结果A;2.样品用60℃以下低温水提取,提取液作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上的含量与比例,为检测结果B;3.将检测结果A与表征指标A进行比对;检测结果B与表征指标B进行比对,如果检测结果A与检测结果B同时分别在表征指标A和表征指标B的范围之内,则表明该样品与天然冬虫夏草的质量特性一致。本发明确定了能够科学、客观表征优质天然冬虫夏草特性的检测方法和指标。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于虫草(包括天然冬虫夏草、人工冬虫夏草及人工蛹虫草)的质量评价方法,具体涉及一种表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法。
背景技术
冬虫夏草为一种寄生于鳞翅目蝙蝠科昆虫幼虫所形成的虫生真菌,是传统名贵中药,具有补肾、益肺等功效。冬虫夏草在我国主要分布于西藏、青海、四川、云南、甘肃等省区海拔3000~5000m的高寒地区的草甸、灌丛、山坡、谷地等高山雪线附近,青藏高原是丰产区。由于冬虫夏草具有重要的食用与药用价值,野生资源被极度采集致使资源愈来愈少,国内外市场货源紧缺,为此,广大科学工作者多年来对冬虫夏草的人工栽培、深层发酵、开发应用等都进行了广泛的研究,尤其在深层发酵代用品研究方面取得较大进展。现已自冬虫夏草中分离出多种无性型菌株,其中一些菌株的深层发酵物已制成了不同的制剂与产品。
目前,核苷被认为是虫草的主要活性成分之一,至今,在虫草中发现了十几种核苷类成分,如腺苷、腺嘌呤、尿苷、尿嘧啶、鸟苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、胞苷、胞嘧啶及脱氧鸟苷等。2005版《(中国药典》规定天然冬虫夏草中腺苷含量不得少于0.01%(0.1mg/g),但文献报道及我们的研究均证明,人工虫草中腺苷的含量远远高于天然冬虫夏草,提示:以腺苷作为指标的虫草质量评价方法存在明显不足。虽然目前报道测定虫草中多种核苷类成分的方法很多,但至今未有形成可以表征天然冬虫夏草特性的核苷类成分指标及其测定方法,严重影响了虫草的质量评价及其应用的安全性和有效性。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于评价虫草(包括包括天然冬虫夏草、人工冬虫夏草及人工蛹虫草)质量的方法,该方法首先确定了能够科学、客观的表征优质天然冬虫夏草特性的检测方法和指标,然后以同样的方法检测待检测的虫草样品,得到检测指标,与上述能够表征优质天然冬虫夏草特性的指标进行对比,即可得到准确的评价结果。
本发明目的是通过如下技术方案实现的:
首先,发明人对采自云南、四川、青海和西藏的若干批优质天然虫草分别进行了多次的各种测定,经过对测定结果的综合分析,得到以下可以科学、客观表征天然虫草质量的两组指标体系:
用有机溶剂或60℃以上的高温水提取,提取液作HPLC分析,得到表征指标A:
尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比分别为100∶10~50∶5~40∶15~50∶0~10,其中尿苷含量为0.6~1.2mg/g;
用60℃以下的低温水提取,提取液作HPLC分析,得到表征指标B:
尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比分别为100∶80~160∶40~80∶0~10∶0~10,其中尿苷含量为1.5~2.4mg/g。
以上A、B两组指标必须同时使用,每组指标中至少需要各取其中的三种成分的含量与比例,才能够达到全面表征天然虫草质量特性的目的。
根据以上指标体系,即可对各种天然冬虫夏草、人工冬虫夏草及人工蛹虫草的质量进行测定和评价,具体方案如下。
表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法,步骤如下:
步骤一,样品用有机溶剂或60℃以上的高温水提取,提取液作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该比例称为检测结果A;
步骤二,样品用60℃以下的低温水提取,提取液作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该比例称为检测结果B;
步骤三,将检测结果A与表征指标A进行比对,所述的表征指标A是:尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比为100∶10~50∶5~40∶15~50∶0~10,其中尿苷含量为0.6~1.2mg/g;
将检测结果B与表征指标B进行比对,所述的表征指标B是:尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比为100∶80~160∶40~80∶0~10∶0~10,其中尿苷含量为1.5~2.4mg/g;
步骤四,查看步骤三的两组比对结果,如果检测结果A与检测结果B同时分别在表征指标A和表征指标B的范围之内,则表明该样品与天然冬虫夏草的质量特性一致。
上述方案中所述的有机溶剂选自:甲醇、乙醇或乙腈等。
上述方案中所述的高效液相色谱条件为:C18色谱柱,以5~20mM三乙胺(或同系物)水溶液-甲醇(或乙醇或乙腈)梯度(0~60min,有机溶剂比例由0~15%开始,增幅为0~1.5%/min)洗脱分离,常规液相色谱检测器检测,紫外检测波长为260±10nm。
更优化和更具体地说,本发明的表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法,具体操作步骤如下:
步骤一,以下方法中的任意一种:
①.样品粉末加入10~30倍量60~95℃水,称重,混匀。置高温(60-100℃)水浴0.5~6小时后,室温超声30分钟,补足重量,离心,上清液用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析;
②.样品粉末加入10~30倍量有机溶剂,称重,混匀。室温超声30分钟,补足重量,离心,上清液用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析;
③.样品粉末加入10~30倍量有机溶剂,回流提取或索氏1-4小时,离心,上清液定容,用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析;
④.样品粉末进行加压溶剂提取,提取参数:有机溶剂或水为提取溶剂,提取温度60~180℃,提取时间5~15min,提取压力1000~1500psi,循环1~3次,提取1次。当使用11ml的提取管,所需溶剂约为25ml。提取液定容为2g生药/100ml,0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析;
用以上四种检测方法之一得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该含量与比例称为检测结果A;
步骤二,样品粉末加入10~30倍量水,称重,混匀。60℃以下低温下静置8~24小时后,超声30分钟,补足重量,离心,上清液用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该含量与比例称为检测结果B。
步骤三、步骤四,与前述相同。
按照以上所述的表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法的各步骤操作,即可对任何来源的虫草药品或样品进行质量评价。
本发明提供的表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法确定了能够科学、客观表征优质天然冬虫夏草特性的检测方法和指标。以同样的方法检测待检测的虫草样品,得到检测指标,与上述能够表征优质天然冬虫夏草特性的指标进行对比,即可得到准确的评价结果。
附图说明
图1、图2分别为实施例1的水提取物与甲醇提取物的HPLC色谱图;
图3、图4分别为实施例2的水提取物与甲醇提取物的HPLC色谱图;
图5、图6分别为实施例3的水提取物与甲醇提取物的HPLC色谱图。
具体实施方式
实施例1:
样品制备:取天然冬虫夏草样品粉末约0.5g于50ml具塞管中,①精确加入去离子水10ml,称定重量,混匀。室温下静置18小时后,超声30分钟,补足重量,离心;②加甲醇10ml,称定重量,混匀,超声30分钟,补足重量,离心;上清液用0.45μm滤膜过滤后供HPLC分析。
HPLC分析:Agilent 1100系列高效液相色谱仪,配备有四元泵,自动进样系统,二极管阵列检测器(DAD)和Agilent色谱工作站。色谱柱为ZorbaxSB-C18(250×4.6mm i.d.,5μm)分析柱及Zobax SB-C18(12.5×4.6mm i.d.,5μm)预柱。洗脱条件为水(含10mM三乙胺)(A)和甲醇(B)梯度洗脱:0~30分钟,从0%B到30%B梯度洗脱。检测波长为254nm。柱温25℃。进样体积10μl。
测定结果,参照图1、图2:测定采自云南、四川、青海和西藏的天然虫草6批,室温水超声处理样品的检测数据是:尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比为100∶80~160∶40~80∶0~10∶0~10,其中尿苷含量为1.5~2.4mg/g;甲醇处理样品的检测数据是:100∶10~50∶5~40∶15~50∶0~10,其中尿苷含量为0.6~1.2mg/g。
实施例2:
样品制备:取人工虫草样品粉末约0.5克于50ml具塞管中,①精确加入去离子水10ml,称定重量,混匀。室温下静置18小时后,超声30分钟,补足重量,离心;②加甲醇10ml,称定重量,混匀,超声30分钟,补足重量,离心;上清液用0.45μm滤膜过滤后供HPLC分析。
HPLC分析:同实施例1。
测定结果,参照图3、图4:测定取自江西、河北、浙江和安徽等的人工虫草9批,其尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比,室温水超声处理样品的检测数据为:100∶0~20∶40~160∶30~140∶0~10,其中尿苷含量为1.0~4.0mg/g;甲醇处理样品的检测数据是:100∶0~20∶80~180∶60~160∶0~10,其中尿苷含量为0.8~5.0mg/g。
实施例3:
样品制备:取人工蛹虫草样品粉末约0.5克于50ml具塞管中,①精确加入去离子水10ml,称定重量,混匀。室温下静置18小时后,超声30分钟,补足重量,离心;②加甲醇10ml,称定重量,混匀,超声30分钟,补足重量,离心;上清液用0.45μm滤膜过滤后供HPLC分析。
HPLC分析:同实施例1。
测定结果,参照图5、图6:测定采自江苏、上海、广东和辽宁等的人工北虫草7批,其尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比,室温水超声处理样品的检测数据为100∶0~10∶20~100∶50~90∶200~800,其中尿苷含量为1.3~3.1mg/g;甲醇处理样品的检测数据是:100∶0~10∶5~60∶20~130∶500~2300,其中尿苷含量为0.2~2.0mg/g。
实施例4:
样品制备:取青海产天然虫草样品粉末约0.5克于50ml具塞管中,精确加入约95℃去离子水10ml,称定重量,混匀。置95-100℃水浴1小时后,室温超声30分钟,补足重量,离心,上清液用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析。
HPLC分析:同实施例1。
测定结果:与实施例1中甲醇处理样品结果相似。
实施例5:
样品制备:取人工虫草样品粉末约0.5克加1∶1倍量的硅藻土,进行加压溶剂提取,提取参数:提取溶剂为甲醇,提取温度160℃,提取时间为5min,压力为1.034×104KPa,循环提取1次,置换体积为40%。提取液在40℃旋转蒸发干燥,残渣以25ml去离子水溶解,用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析。
HPLC分析:同实施例1。
测定结果:与实施例2甲醇处理样品结果相似。
实施例6:
与实施例1基本相同,但有机溶剂采用乙醇。
实施例7:
与实施例1基本相同,但有机溶剂采用乙腈。
实施例8:
对需要检测质量的虫草样品进行检测。
步骤一,样品用有机溶剂或60℃以上的高温水提取,提取液作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该比例称为检测结果A;
步骤二,样品用60℃以下的低温水提取,提取液作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该比例称为检测结果B;
步骤三,将检测结果A与表征指标A进行比对,所述的表征指标A是:尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比为100∶10~50∶5~40∶15~50∶0~10,其中尿苷含量为0.6~1.2mg/g;
将检测结果B与表征指标B进行比对,所述的表征指标B是:尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比为100∶80~160∶40~80∶0~10∶0~10,其中尿苷含量为1.5~2.4mg/g;
步骤四,查看步骤三的两组比对结果,如果检测结果A与检测结果B同时分别在表征指标A和表征指标B的范围之内,则表明该样品与表征天然冬虫夏草的质量特性一致。
Claims (3)
1、一种表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法,步骤如下:
步骤一,样品用有机溶剂或60℃以上的高温水提取,提取液作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该比例称为检测结果A;
步骤二,样品用60℃以下的低温水提取,提取液作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该比例称为检测结果B;
步骤三,将检测结果A与表征指标A进行比对,所述的表征指标A是:尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比为100∶10~50∶5~40∶15~50∶0~10,其中尿苷含量为0.6~1.2mg/g;
将检测结果B与表征指标B进行比对,所述的表征指标B是:尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分的含量比为100∶80~160∶40~80∶0~10∶0~10,其中尿苷含量为1.5~2.4mg/g;
步骤四,查看步骤三的两组比对结果,如果检测结果A与检测结果B同时分别在表征指标A和表征指标B的范围之内,则表明该样品与天然冬虫夏草的质量特性一致。
2、按照权利要求1所述的表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法,其特征在于,
所述的有机溶剂选自:甲醇、乙醇或乙腈;
所述的高效液相色谱条件为:C18色谱柱,以5~20mM三乙胺或三乙胺的同系物的水溶液-甲醇,或三乙胺或三乙胺的同系物的水溶液-乙醇,或三乙胺或三乙胺的同系物的水溶液-乙腈,梯度洗脱分离,常规液相色谱检测器检测,紫外检测波长为260±10nm。
3、按照权利要求1或2所述的表征天然冬虫夏草特性的虫草质量评价方法,其特征在于,
所述的步骤一的具体操作,为以下方法中的任意一种:
①.样品粉末加入10~30倍量60~95℃水,称重,混匀,置60~100℃高温水浴0.5~6小时后,室温超声30分钟,补足重量,离心,上清液用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析;
②.样品粉末加入10~30倍量有机溶剂,称重,混匀。室温超声30分钟,补足重量,离心,上清液用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析;
③.样品粉末加入10~30倍量有机溶剂,回流提取或索氏1~4小时,离心,上清液定容,用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析;
④.样品粉末进行加压溶剂提取,提取参数:有机溶剂或水为提取溶剂,提取温度60~180℃,提取时间5~15min,提取压力1000~1500psi,循环1~3次,提取1次,当使用11ml的提取管,所需溶剂约为25ml,提取液定容为2g生药/100ml,0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析;
用以上四种检测法之一得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该含量与比例称为检测结果A;
所述的步骤二的具体操作为:
样品粉末加入10~30倍量水,称重,混匀,60℃以下低温下静置8~24小时后,超声30分钟,补足重量,离心,上清液用0.45μm滤膜过滤后作HPLC分析,得到尿苷、肌苷、鸟苷、腺苷和虫草素5种成分中任意三种或三种以上成分的含量与比例,该含量与比例称为检测结果B。
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CN100483131C (zh) | 2009-04-29 |
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