CN104297402A - 车前子中腺嘌呤核苷的hplc含量测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明首次从车前子中分离得到腺嘌呤核苷、麻叶千里光苷B、乙基葡萄糖苷,并在此基础上提供了一种利用HPLC法测定车前子中腺嘌呤核苷的含量的方法，该方法色谱条件为流动相：乙腈-水＝5:95；流速：0.1mL/min；柱温：25℃；检测波长：255nm；进样量：20μL，本发明为车前子质量标准的完善提供了含量测定指标，也为车前子的开发利用提供了新的科学依据。

Description

车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法

技术领域

本发明涉及采用HPLC法测定车前子中腺嘌呤核苷的含量，属于生物医药领域。

背景技术

车前子(Semen Plantaginis)为车前科植物车前Plantago asiatic L.或平车前Plantagodepressa Willd的干燥成熟种子。车前子作为药用首载于《神农本草经》，其味苷、性寒、无毒，入肝、肾、肺、小肠经，具有清热利尿通淋，渗湿止泻，明目，祛痰的功效。用于热淋涩痛，水肿胀满，暑湿泄泻，目赤胀痛，痰热咳嗽。车前子具有药食同源之性，被国家卫生部列为可用于保健食品的物品名单。

尽管国内外学者广泛的研究了车前子的化学成分及其药理作用，但是仍存在尚不明确的化学成分，车前子药材质量标准还有待于进一步完善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，在对车前子的化学成分进行进一步的深入研究的基础上，提供新的指标性成分及其含量测定方法，具体是提供一种采用HPLC法测定车前子中腺嘌呤核苷的含量的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法，

色谱条件：流动相：乙腈-水体积比为5:95

流速：0.1mL/min

柱温：25℃

检测波长：255nm

进样量：20μL；

供试品溶液的制备：

精密称取干燥的车前子粉末样品适量，以甲醇为提取溶剂，提取2-4次，提取时间均为100-140min，料液比(g/ml)为1:(10-11)，回收溶剂，用体积比为5:95的乙腈-水混合溶液溶解并定容至指定体积,过滤，制成供试品溶液；

对照品溶液的制备：

精密称取腺嘌呤核苷对照品，置于容量瓶中，用体积比为5:95的乙腈-水混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.0400-0.0410mg.mL^-1对照品溶液。

进一步地，上述的车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法，

色谱仪：Agilent1200高效液相色谱仪

检测器：UV检测器

色谱柱：Prevail C18(250mm×4.6mm，5mm)

色谱条件：流动相：乙腈-水体积比为5:95

流速：0.1mL/min

柱温：25℃

检测波长：255nm

进样量：20μL。

进一步地，上述的车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法，其特征在于，

供试品溶液的制备：

精密称取干燥的车前子粉末样品适量，以甲醇为提取试剂，提取3次，提取时间均为120min，料液比(g/ml)为1:11，回收溶剂，用体积比为5:95的乙腈-水混合溶液溶解并定容至25mL容量瓶,过0.22μm微孔滤膜，制成待测溶液。

进一步地，上述的车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法，其特征在于，对照品溶液的制备：

精密称取腺嘌呤核苷对照品0.00205g，纯度为98.85％，置于50.00mL容量瓶中，用体积比为5:95的乙腈-水混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.0405mg.mL^-1对照品溶液。

本发明所用到的对照品腺嘌呤核苷为自制，纯度为98.85％，腺嘌呤核苷的制备方法如下：

(1)提取

将车前子用80％乙醇回流提取三次，乙醇用量分别为10、8、8倍(W/V)，回流时间分别为1.5h、1.0h、1.0h，合并三次提取液，回收溶剂，得到车前子粗提物。

(2)分离

将车前子乙醇粗提取物，用洗脱剂I进行硅胶柱层析，收集洗脱液并经TCL检测，合并相同组分，得到C、D，E，F四个主要部分；其中，C部分为化合物麦角甾苷富集部分，D部分为化合物腺嘌呤核苷、麻叶千里光苷B、野漆树苷和1-辛烯3-O-β-D葡萄糖(6→1)-β-D-木糖苷富集部分，E部分为化合物乙基葡糖苷和京尼平苷酸富集部分，F部分为化合物芹菜素-7-O-葡萄糖苷富集部分。

(3)纯化

将步骤(2)所得2个部分分别反复纯化，最后纯化得到8个化合物，它们分别是腺嘌呤核苷、麻叶千里光苷B、野漆树苷、乙基葡萄糖苷、1-辛烯-3-醇3-O-β-D-吡喃木糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、京尼平苷酸、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、麦角甾苷。

纯化方法选自下列方法中的一种或几种：以乙酸乙酯硅胶柱层析、以甲醇-水(1.5:1)ODS柱层析、以乙酸乙酯-乙醇(10:1)硅胶柱层析、以甲醇-水(1:1)ODS柱层析、以乙酸乙酯-乙醇(30:1)硅胶柱层析、以乙酸乙酯-乙醇(20:1)硅胶柱层析、以甲醇-水(2:1)ODS柱层析、有机溶剂重结晶，上述均为体积比。

本发明深入研究了车前子的化学成分，得到了8个单体化合物并利用质谱、核磁共振、红外等多种波谱学方法并结合其理化性质，鉴定了这8个化合物的结构，它们分别是腺嘌呤核苷、麻叶千里光苷B、野漆树苷、乙基葡萄糖苷、1-辛烯-3-醇3-O-β-D-吡喃木糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、京尼平苷酸、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、麦角甾苷。首次从车前子中分离得到腺嘌呤核苷、麻叶千里光苷B、乙基葡萄糖苷，并在此基础上建立了车前子中腺嘌呤核苷含量的HPLC测定方法，为车前子质量标准的完善提供了含量测定指标，也为车前子的开发利用提供了新的科学依据。本发明的测定结果：安徽产车前子中化合物CQZ-1的平均含量是50.3、江西产车前子中化合物CQZ-1的平均含量是44.8、河北产车前子中化合物CQZ-1的平均含量是46.9μg/g。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明实验条件选择时对照品溶液(Ⅰ)和样品溶液(Ⅱ)分离的色谱图；

图2是本发明实施例1中的线性关系曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

一、车前子化学成分的提取及分离

(一)实验药材

药材购于安徽亳州。

(二)试剂材料

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醇、盐酸和氢氧化钠皆由北京化工厂生产，均为分析纯试剂；石油醚由天津天泰精细化学品有限公司生产；二乙胺由天津市光复精细化工研究所生产。Silica60F254s高效薄层层析板和ODS RP-18F254s高效薄层层析板，由Merck JapanLimited生产。

(三)提取

将10Kg车前子，用80％乙醇回流提取三次，乙醇用量分别为10、8、8倍(W/V)，回流时间分别为1.5h、1.0h、1.0h，合并三次提取液，回收溶剂，得到车前子粗提物。

(四)分离

将车前子乙醇粗提取物，用洗脱剂I进行硅胶柱层析，收集洗脱液并经TCL检测，合并相同组分，得到C、D，E，F四个部分；其中，C部分为化合物麦角甾苷富集部分，D部分为化合物腺嘌呤核苷、麻叶千里光苷B、野漆树苷和1-辛烯3-O-β-D葡萄糖(6→1)-β-D-木糖苷富集部分，E部分为化合物乙基葡糖苷和京尼平苷酸富集部分，F部分为化合物芹菜素-7-O-葡萄糖苷富集部分。

(五)纯化

1)将C部分使用硅胶柱层析，以乙酸乙酯作为流动相，将最先得到的含有大量一个相同流份的部分收集，得到组分C1，将C1反复以甲醇-水(1.5:1)为流动相使用ODS柱层析纯化，得到化合物CQZ-8：麦角甾苷。

2)将D部分使用硅胶柱层析分离，以乙酸乙酯-乙醇(10:1)为流动相洗脱，将最先得到的含有大量一个相同流份的部分收集，得到组分D1，将D1以甲醇-水(1.5:1)为流动相使用ODS柱层析分离，得到化合物CQZ-3：野漆树苷和化合物CQZ-5：1-辛烯3-O-β-D葡萄糖(6→1)-β-D-木糖苷，其余部分重结晶，得到化合物CQZ-1腺嘌呤核苷和化合物CQZ-2：麻叶千里光苷B。

3)将E部分以乙酸乙酯-乙醇(30:1)为流动相使用硅胶柱层析分离，得到E1和E2两个分别含有大量相同流份组分，将E1以乙酸乙酯-乙醇(20:1)为流动相使用硅胶柱层析分离，得到化合物CQZ-4：乙基葡糖苷。将E2以乙酸乙酯-乙醇(20:1)为流动相使用硅胶柱层析纯化，得到化合物CQZ-6：京尼平苷酸。

4)将F部分进行硅胶柱层析，以乙酸乙酯为流动相，将最先得到的含有大量一个相同流份的部分收集，得到F1，将F1反复以甲醇-水(2:1)为流动相使用ODS柱层析纯化，得到化合物CQZ-7：芹菜素-7-O-葡萄糖苷。

二、化学成分的结构鉴定

化合物CQZ-1的结构分析

化合物CQZ-1为白色粉末，m.p.226-228℃，易溶于水，微溶于甲醇。

化合物CQZ-1的ESI-MS出现m/z268.1[M+H]⁺的分子离子峰，提示化合物CQZ-1的分子量为267.2。

化合物CQZ-1的¹³C NMR(DMSO，150MHz)谱，共给出10个碳信号，结合DEPT谱可知，有1个亚甲基信号(δ_C61.66),6个次甲基信号(分别为δ_C70.65，73.43，85.85，87.90，139.91，152.36)，其余3个为季碳信号(分别为δ_C139.91，156.15，119.36)。δ_C156.15，149.06，δ_C119.36，δ_C139.91，152.36为烯碳信号，其中δ_C139.91和152.36为烯碳次甲基信号，这五个碳信号推测为腺嘌呤上各碳信号。δ_C87.90推测为核糖的端基碳信号，其余的次甲基信号可能为核糖上的其它碳信号。

¹H NMR(DMSO，600MHz)谱中，在δ_H8.35(1H，s)和δ_H8.14(1H，s)处的2个氢信号位于低场，推测为不饱和碳上质子信号，在δ_H7.34(2H，s)的2个氢可能为氨基上的质子信号。在δ_H5.44(2H,d,J＝6.0Hz)处的2个氢信号，可能为核糖上的亚甲基质子信号。在δ_H5.89(1H,d,J＝6.0Hz)的氢信号，可能为糖上1′质子的信号。

根据以上碳氢信号的分析，经与文献对照，确认化合物CQZ-1为腺嘌呤核苷，该化合物首次从车前子中分离得到。化合物CQZ-1结构式如下：

化合物CQZ-2的结构分析

化合物CQZ-2为白色粉末，m.p.164-166℃，易溶于甲醇，乙醇，氯仿，难溶于石油醚。

化合物CQZ-2的¹³C NMR(DMSO，150MHz)谱，共给出9个碳信号，结合DEPT谱可知，有1个亚甲基信号(为δ_C60.84),5个次甲基信号(分别为δ_C69.86，73.51，84.81，87.68，101.73，140.71)，其余2个为季碳信号(分别为δ_C150.73，163.09)。其中δ_C163.09可能为酯键上的羰基碳信号，δ_C150.73和140.71可能为烯碳信号，δ_C87.68可能为2′号位上连氧的碳信号，δ_C101.73可能为与两个氧原子相连的叔碳信号，δ_C60.84可能为6′号位上的亚甲基碳信号，δ_C69.86，73.51，84.81可能为其它各碳信号。

化合物CQZ-2的¹H NMR(DMSO，600MHz)中，δ_H11.29(1H，s)化学位移高，位于低场，可能是活泼质子信号；δ_H7.88(1H，d，J＝8.4Hz)可能为共轭双键上的质子信号；δ_H5.65(1H，d，J＝7.84Hz)可能为与两个氧原子相连的叔碳质子信号；δ_H3.62(1H，d，J＝9.6Hz)和δ_H3.55(1H，d，J＝9.6Hz)可能为6′碳上的2个质子信号；δ_H5.35(1H，s)和δ_H5.07(1H，s)可能分别为羟基质子信号，剩余的氢信号推测为其它质子信号。

根据以上碳氢信号的分析，经与文献对照，确认化合物CQZ-2为麻叶千里光苷B，该化合物首次从车子中分离得到。化合物CQZ-2结构式如下：

化合物CQZ-3的结构分析

化合物CQZ-3为是浅黄色粉末，难溶于水，易溶于甲醇，m.p.189-191℃。

化合物CQZ-3的ESI-MS出现m/z577.3[M-H]^-的分子离子，峰提示化合物CQZ-3的分子量为578.5。

化合物CQZ-3的¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)谱共给出24个碳信号，结合DEPT谱可知，有1个甲基信号为δ_C16.86，1个亚甲基信号为δ_C61.03,13个次甲基信号(分别为δ_C128.22，115.65，102.73，101.13，99.59，98.39，94.51，77.65，77.62，72.57，70.81，70.00,68.60)，其余9个为季碳信号(分别为δ_C182.60，165.31，162.97，161.54，161.50，157.53，121.60，105.64，76.89)。其中δ_C128.22，115.65和70.81三组信号强度约是其它同类碳信号的2倍，可能是由化学环境相同的碳信号叠加而产生，说明分子中可能有对称结构。δ_C182.60处季碳可能是羰基碳信号，δ_C94.51-162.97之间个碳信号的出现，可初步推断该化合物为一黄酮。

δ_C101.13，δ_C98.38，可能为糖的端基碳信号，提示分子内可能有两个糖分子，由δ_C16.86处甲基碳信号可初步堆断其中的一个糖可能是鼠李糖。

化合物CQZ-3的¹H NMR(CD₃OD，500MHz)谱，δ_H6.77(1H，s)和6.45(1H，s)可能为黄酮A环上3号位和8号位上的氢信号。δ_H7.88(2H，d，J＝6.0Hz)和6.94(2H，d，J＝6.0Hz)可能为黄酮B环2′和3′号位上的氢信号。δ_H1.35(3H，s)可能为鼠李糖上甲基氢信号。

根据以上碳、氢信号的分析，经与文献对照，确认化合物为野漆树苷。化合物CQZ-3结构式如下：

化合物CQZ-4的结构分析

化合物CQZ-4为白色晶体，m.p.138.5-139.5℃，易溶于水和甲醇。

化合物CQZ-4的ESI-MS出现m/z231.1[M+Na]⁺的分子离子峰，提示化合物CQZ-4的分子量为208.2。

化合物CQZ-4的¹³C NMR(CD₃OD，125MHz)谱，共给出9个碳信号，结合DEPT谱可知，有1个甲基信号(为δ_C,13.86),2个亚甲基信号(为δ_C63.10，δ_C61.36),5个次甲基信号(分别为δ_C98.74，70.92，70.16，69.69，68.83)。信号δ_C98.74，70.92，70.16，69.69，68.83，61.36推测为单糖上的碳信号，多余一个甲基信号和亚甲基信号。

化合物CQZ-4的¹H NMR(CD₃OD，500MHz)谱氢谱中δ_H1.27(3H，t，)为甲基上的碳信号，此信号为3重峰，表明此甲基与一个亚甲基相连，推测为单糖的乙基衍生物。

根据以上碳、氢信号的分析，经与文献对照，确认化合物CQZ-4为乙基葡糖苷，该化合物首次从车前子中分离得到。化合物CQZ-4结构式如下：

化合物CQZ-5的结构分析

化合物CQZ-5为白色粉末状固体，m.p.147.8-149.5℃，易溶于水和甲醇。

化合物CQZ-5的ESI-MS出现m/z445.2[M+Na]⁺的分子离子峰提示化合物CQZ-5的分子量为422.4。

化合物CQZ-5的¹³C NMR(CD₃OD，125MHz)谱，共给出19个碳信号，结合DEPT谱可知，有1个甲基信号(为δ_C13.02),7个亚甲基信号(为δ_C114.81，68.07，65.45，34.35，31.65，24.40，22.40),11个次甲基信号(分别为δ_C139.48，103.91，101.91，81.33，76.66，76.20，75.59，73.87，73.46，70.06，69.79)。其中δ_C34.35，31.65，24.40，22.40，是碳链上位于高场的4个亚甲基信号碳信号，δ_C101.91和103.91均可能为糖的端基碳信号。

由化合物CQZ-5的¹³H NMR(CD₃OD,500MHz)谱和HMQC谱，可知δ_H5.86(1H，m)与δ_C139.48相关，为双键2号位上的质子信号。δ_H5.26(1H，d，J＝14.5Hz),δ_H5.12(1H，d，J＝14.5Hz)分别与δ_C114.81相关，表明为末端双键上的质子信号。δ_H4.35(1H，d，J＝7.0Hz)和δ_H4.37(1H，d，J＝6.5Hz)分别和δ_C101.91，δ_C103.91相关，推测这两个信号为糖上的端基质子信号，由于它们的耦合常数分别为6.5、7.0Hz，说明糖均为β构型。此外，δ_H0.93(3H，t)与δ_C13.02相关，可知δ_H0.93为甲基上的氢信号；δ_H1.70(1H，m)和δ_H1.54(1H，m)2个氢信号与δ_C34.35碳相关，可知这两个信号是δ_C34.35亚甲基碳上的氢信号。1.42(2H，m)，1.34(2H，m)，1.32(2H，m)，0.93(3H，t)分别与δ_C24.40，22.40，31.65，13.02相关，可知它们分别是4～8号位上的质子信号。

从¹H-¹HCOSY谱上可知，δ_H1.70(1H，m)和δ_H1.54(1H，m)分别与δ_H1.42(对应δ_C24.40)和δ_H4.16(对应δ_C81.33)相关，同时δ_H1.42又与δ_H1.32(对应δ_C31.65)相关，δ_H1.32与δ_H1.34(对应δ_C22.40)，δ_H1.34与δ_H0.92(对应δ_C13.02)相关，δ_H5.89(对应δ_C139.48)与δ_H5.26(对应δ_C114.81)和δ_H4.16(对应δ_C81.33)提示δ_C114.81，139.48，81.33，34.35，24.40，31.65，22.40，13.02各信号处的碳原子依次相接。结合HMBCδ_H4.35(对应δ_C101.91)与δ_C81.33远程相关，提示C-3连接葡萄糖；δ_H4.37(对应δ_C103.91)与68.07远程相关，提示木糖与葡萄糖为6→1连接，其HMBC如下：

根据以上分析并结合文献，确认化合物CQZ-5为1-辛烯-3-醇-3-O-β-D-吡喃木糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。化合物CQZ-5结构式如下：

化合物CQZ-6的结构分析

化合物CQZ-6为白色针状晶体，m.p.168.8-169.0℃，易溶于水和甲醇。

化合物CQZ-6的ESI-MS出现m/z373.2[M-H]^-的分子离子峰，提示化合物CQZ-6的分子量为374.3。

化合物CQZ-6的¹³C NMR(CD₃OD,150MHz)谱，共给出16个碳信号，结合DEPT谱可知，有3个亚甲基信号(δ_C62.97，61.76，40.03),10个次甲基信号(分别为δ_C153.64，128.69，100.62，98.56，78.69，78.16，75.18，71.85，47.31，36.98)，其余3个为季碳信号(分别为δ_C171.18，145.14，113.05)。其中δ_C171.18的季碳信号，可能为C＝O信号。δ_C61.76，36.98的两个亚甲基信号可能分别为与氧相连和与双键相连的亚甲基信号。δ_C153.64，145.14，128.69，113.05分别为烯碳信号。δ_C100.62，78.69，78.16，75.18，71.85，62.97六个碳信号可归属为糖的碳信号。根据上述碳谱特征，可初步推断化合物CQZ-6为环烯醚萜葡萄糖苷类化合物。

化合物CQZ-6的¹H NMR(CD₃OD,600MHz)谱，4.81(1H，d，J＝7.8Hz)可归属为葡萄糖端基质子信号，由于耦合常数为7.8Hz，说明该糖为β-D-吡喃葡萄糖。7.61(1H，_s)可能为环烯醚萜的3号碳上的质子信号，2.20(1H，m)和2.80(1H,m)可能为6号位上亚甲基上的质子信号，3.32(1H，m)可能为5号碳上的质子信号，4.42(1H，d，J＝14.4Hz)和4.30(1H，d，J＝14.4Hz)可能为10号位上的氢信号，3.94(1H，d，J＝12.0Hz)和3.73(1H，dd，J＝12.0Hz,J＝5.4Hz)可归属为糖上亚甲基质子信号。

根据以上分析并结合文献，确认化合物CQZ-6为京尼平苷酸。化合物CQZ-6结构式如下：

化合物CQZ-7的结构分析

化合物CQZ-7为黄色针状晶体，m.p.256-259℃，易溶于水和甲醇。

化合物CQZ-7的ESI-MS出现m/z431.2[M-H]^-的分子离子峰，提示化合物CQZ-7的分子量为432.3。

化合物CQZ-7的¹³C NMR(DMSO，125MHz)谱，共给出19个碳信号，结合DEPT谱可知，1个亚甲基信号(δ_C61.07),10个次甲基信号(分别为δ_C129.08，116.47，103.57，100.37，99.99，95.31，77.64，76.90，73.57，70.02)，其余8个为季碳信号(分别为δ_C182.47，164.73，163.44，161.82，161.58，157.41，121.50，105.82)。δ_C129.08，116.47两组组信号强度约是其它同类碳信号的2倍，可能是由化学环境相同的碳信号叠加而产生，说明分子中可能有对称结构。δ_C182.47处季碳可能是羰基碳信号。δ_C95.31-164.73之间个碳信号的出现，可初步推断该化合物为一黄酮。δ_C100.37可能为糖的端基碳信号，提示分子中有一个糖分子。

化合物CQZ-7的¹³H NMR(DMSO，500MHz)谱，δ_H12.97(1H，s)可能是5号碳上的羟基氢信号。δ_H7.95(2H，d，J＝9.0Hz)和δ_H6.94(2H，d，J＝9.0Hz)可能为2′，6′和3′，5′号碳上的氢信号。δ_H6.87(1H，s)单峰信号可能为3号碳上的氢信号。δ_H6.84(1H，d，J＝2.0Hz)可能为8号碳上的氢信号。δ_H6.45(1H，d，J＝2.5Hz)可能为6号碳上的氢信号。δ_H5.09(1H，d，J＝7.5Hz)归属为糖端基质子信号，由J＝7.5Hz可知糖为β构型。

根据以上碳、氢信号的分析，结合文献得此化合物为芹菜素-7-O-葡萄糖苷。化合物CQZ-7结构式如下：

化合物CQZ-8的结构鉴定

化合物CQZ-8为白色粉末，m.p.134.8-135.5℃，易溶于水和甲醇。

化合物CQZ-8的ESI-MS出现m/z647.2[M+Na]⁺的分子离子峰,提示化合物CQZ-8的分子量为624.5。

化合物CQZ-8的¹³C NMR(CD₃OD，125MHz)谱，共给出29个碳信号，结合DEPT谱可知,其中有1个甲基信号(为δ_C17.07)，3个亚甲基信号(为δ_C70.87,60.98,35.17),18个次甲基信号(分别为δ_C146.63，121.84，119.89，115.73，115.14，114.93，113.85，113.31，102.81，101.64，80.27，74,81，74.63，72.41，70.96，70.67，69.19，69.03)，7个季碳信号(分别为δ_C166.91，148.40，145.44，144.73，143.28，130.09，126.27)。δ_C166.91处季碳可能是羰基碳信号，低场δ_C113.31-148.40共14个碳信号可能为苯环或其它烯碳的信号。δ_C60.98,35.17可能分别为与氧相连和与烃基相连的亚甲基信号。δ_C102.81和δ_C101.64可能为糖的端基碳信号，提示分子内可能有两个糖分子，而δ_C17.07处1个甲基信号的出现，提示其中一个糖可能为鼠李糖。

化合物CQZ-8的13HNMR(CD3OD，500MHz)谱，δH1.12(3H，d，J＝6.0Hz)显示有3个氢，为甲基上的氢信号，可能是鼠李糖上的6″′位碳信号。δH2.83(2H，m)有2个氢信号，可能是亚甲基上的碳信号。δH6.60(1H，dd，J＝8.0Hz,J＝2.0Hz)，δH6.72(1H，d，J＝2.0Hz)，6.70(1H，d，J＝8.0Hz)归属于苯环上的氢信号，此处的3个氢可能为苯环6,5,2号碳上的氢信号。δH6.81(1H，d，J＝8.0Hz)，δH6.99(1H，dd，J＝8.0Hz,J＝2.0Hz)，δH7.082(1H，d，J＝2.0Hz)，可能为另一个苯环上5′，6′，2′号碳上氢信号。根据以上碳氢信号的特征，结合文献确认化合物CQZ-8为麦角甾苷。化合物CQZ-8结构式如下：

三、HPLC法测定车前子中腺嘌呤核苷含量的实验条件的选择

1、流动相选择

本实验对流动相的组成及比例进行了考察，由于被测物的极性比较大，分别对比例为2:98，5:95，10:90，20:80的甲醇-水和乙腈-水进行了筛选，结果发现5:95的乙腈-水能使目标成分与干扰组分的分离度大于1.5，且拖尾因子等参数符合要求，因此，经多次实验，最终确定色谱条件为：色谱柱Prevail C18(250mm×4.6mm，5mm)，流动相乙腈-水(5:95)，流速为1.0mL/min，柱温25℃，进样量20μL。对照品溶液和样品溶液分离的色谱图见图1。

2、检测波长选择

取化合物CQZ-1标准品适量，准确称量，溶于纯水，制成浓度为40μg/ml的标准溶液。置紫外分光光度仪测定，波长扫描范围为200-400nm。结果显示其最大吸收波长(λmax)为255nm，因此选择255nm为检测波长。

3、提取条件选择

分别对提取方法、提取溶剂类型、提取溶剂体积和提取次数进行了考察，从而确定最佳提取条件。

3.1、提取溶剂选择

精密称取干燥的车前子粉末8.0g，共5份，分别选择丙酮、乙酸乙酯、氯仿、乙醇、甲醇为提取溶剂，提取溶剂量为100mL，提取3次，回收溶剂，分别用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至25mL容量瓶，制备供试品溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液20μL注入高效液相色谱仪。实验数据见表一。

表一 不同提取溶剂时的峰面积

结果表明甲醇提取液中CQZ-1的色谱峰面积最大，说明提取效果最好，所以选用甲醇为最佳提取溶剂。

3.2、提取时间的选择

精密称取干燥的车前子粉末8.0g，共5份，分别以甲醇为提取试剂，提取时间分别为60,80,100,120,150min，提取溶剂量为100mL，均提取3次，合并提取液，回收溶剂，分别用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至25mL容量瓶，制备供试品溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液20μL注入高效液相色谱仪分析，记录峰面积，实验数据见表二。

表二 不同提取时间的峰面积

结果表明提取时间为120分钟和150分钟的提取液中化合物CQZ-1的色谱峰面积没有太大变化，所以选择提取时间为120min。

3.3、提取次数的选择

精密称取干燥的车前子粉末8.0g，共4份，以甲醇为提取试剂，提取时间为120min，提取溶剂量为100mL，分别提取1,2,3,4次，回收溶剂，分别用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至25mL容量瓶，制备供试品溶液，分别过0.22μm微孔滤膜，取续滤液20μL注入高效液相色谱仪分析，记录色谱峰面积。实验数据见表三。

表三 不同提取次数的峰面积

样品提取3次和提取4次，提取率没有明显差异，所以提取次数选择3次。

3.4、料液比的选择

精密称取干燥的车前子粉末8.0g，共5份，以甲醇为提取试剂，提取三次提取时间分别是120min，料液比为1:8，1:9，1:10，1:11，1:12，回收溶剂，分别用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至25mL容量瓶，制备供试品溶液，分别过0.22μm微孔滤膜，取续滤液20μL注入高效液相色谱仪。实验数据见表四。

表四 不同料液比时的峰面积

结果表明，料液比为1:11基本可以提取充分，因此确定料液比为1:11。

3.5、提取条件的确定

精密称取干燥的车前子粉末8.0g，以甲醇为提取试剂，提取3次，每次提取120min，料液比为1:11。回收溶剂，用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至25mL容量瓶，摇匀，即得。

实施例1

HPLC法测定车前子中腺嘌呤核苷的含量，步骤如下：

1、实验仪器和色谱条件

色谱仪：Agilent1200高效液相色谱仪

检测器：UV检测器

色谱柱：Prevail C18(250mm×4.6mm，5mm)

色谱条件：流动相：乙腈-水体积比为5:95

流速：0.1mL/min

柱温：25℃

检测波长：255nm

进样量：20μL。

2、方法学考察

2.1、线性关系的考察

精确称取CQZ-1对照品0.00604g，使用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至50mL容量瓶中，摇匀，得标准储备液。准确移12.50,6.00,2.50,1.25,0.75mL置25mL容量瓶，使用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至刻度，摇匀，得到6种不同浓度的标准品溶液，再分别注入高效液相色谱仪，进样量均为10μL，记录色谱图，测得CQZ-1色谱峰面积。以对照品峰面积S作为纵坐标，以对照品进样量质量m作为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程为：y＝3211x-6.5467R2＝0.9990。测定数据及处理结果见表五，标准曲线见图2。

表五 化合物的线性关系的测定数据及处理结果

实验结果表明，化合物CQZ-1在0.01208-1.2080μg范围内，对照品峰面积S与对照品进样浓度X呈良好的线性关系。

2.2、日内精密度实验

称取0.00320g CQZ-1，使用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至50mL容量瓶，得浓度为0.064mg﹒mL-1的标准溶液，注入高效液相色谱仪，每次进样量为10μL，连续进样6次，测得CQZ-1的峰面积，计算化合物CQZ-1峰面积的RSD值。实验结果见表六。

表六 化合物CQZ-1的日内精密度实验结果

结果表明，连续进样6次，化合物CQZ-1峰面积的RSD为0.13％，保留时间的RSD为0.63％,可见日内精密度良好。

2.3、日间精密度实验

使用2.2配置的溶液，注入高效液相色谱仪，每次进样量为10μL，连续进样6天,测得CQZ-1的峰面积，计算化合物CQZ-1峰面积的RSD值。实验结果见表七。

表七 化合物CQZ-1的日间精密度实验结果

结果表明，连续6天进样，化合物CQZ-1峰面积的RSD为0.20％，保留时间的RSD为0.64％,可见日间精密度良好。

2.4、重复性

精密称取干燥的车前子粉末样品8.0g(翻炒过)，共六份，分别以甲醇为提取试剂，提取时间为120min，提取3次，料液比为1:11。回收溶剂，分别用色谱乙腈-水(5:95)溶解定容至25mL容量瓶，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液20μL注入高效液相色谱仪，利用外标一点法测定样品中化合物CQZ-1的含量。实验结果见表八。

表八 化合物CQZ-1的重复性实验结果

实验表明：化合物CQZ-1平均含量为51.2μg/g，其RSD为1.3％，可见方法重复性良好。2.5、稳定性

精密称取干燥的车前子粉末8.0g，以甲醇为提取试剂，提取时间为120min，提取3次，料液比为1:11。回收溶剂，用色谱乙腈-水(5:95)溶解定容至25mL容量瓶。过0.22μm微孔滤膜，每隔2小时取滤液20μL注入高效液相色谱仪，利用外标一点法测定样品中化合物CQZ-1的含量。实验结果见表九。

表九 化合物CQZ-1的稳定性实验结果

实验表明：其RSD为1.4％，保留时间的RSD为0.84％,样品在十二个小时内稳定性良好。2.6、加样回收率实验

精密称取干燥的车前子粉末样品(翻炒过，化合物CQZ-1含量已知，为51.2μg/g)8.0g，置6个圆底烧瓶中，并依次分别移取0.064mg﹒mL-1的标准溶液3.2，3.2，5.6，5.6，10.0，10.0mL,分别使标准加入量约为样品中CQZ-1含量的0.5倍、1.0倍、1.5倍(每个倍数平行2份)，按液料比11：1补足甲醇量，按3.3.5进行回流提取，制备供试品溶液。取20μL注入HPLC，测定化合物CQZ-1的峰面积，根据外标一点法，计算供试品溶液中CQZ-1的总含量，再由下面公式求出CQZ-1的加样回收率以及RSD值。实验结果见表十。

表十 化合物CQZ-1的加样回收率实验结果

化合物CQZ-1的平均回收率为99.85％，RSD为0.90％，表明该方法回收率良好。

2.7、检测限和定量限

精密移取2.2项混合对照品溶液，以色谱乙腈-水(5:95)逐级稀释。分别取10μL稀释后的溶液注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算信噪比(S/N)。当对照品溶液降到0.0013mg/mL时S/N≥3.0，样品检测限为13ng。当对照品溶液降到0.004mg/mL时S/N≥10.0样品的定量限为40ng。

3、含量测定

3.1、供试品溶液的制备

精密称取不同产地干燥的车前子粉末样品8.0g(翻炒过)，以甲醇为提取试剂，提取3次，提取时间均为120min，料液比为1:11。回收溶剂，用色谱乙腈-水(5:95)溶解并定容至25mL容量瓶,分别过0.22μm微孔滤膜，制成待测溶液。

3.2、对照品溶液的制备

精密称取CQZ-1对照品(纯度为98.85％)0.00205g，置于50.00mL容量瓶中，色谱乙腈-水(5:95)溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.0405mg.mL-1对照品溶液。

3.3、样品的测定

分别取对照品与供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录CQZ-1峰面积，以外标法计算化合物CQZ-1的含量。分析数据及结果见表十一。

表十一 化合物CQZ-1的按量测定结果

实验结果表明，三个不同产地的车前子中化合物CQZ-1的平均含量分别是50.3、44.8、46.9μg/g。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法，其特征在于，

色谱条件：流动相：乙腈-水体积比为5:95

流速：0.1mL/min

柱温：25℃

检测波长：255nm

进样量：20μL；

供试品溶液的制备：

精密称取干燥的车前子粉末样品适量，甲醇回流提取，提取2-4次，提取时间均为100-140min，料液比(g/ml)为1:(10-11)，回收溶剂，用体积比为5:95的乙腈-水混合溶液溶解并定容至指定体积,过滤，制成供试品溶液；对照品溶液的制备：

精密称取腺嘌呤核苷对照品，置于容量瓶中，用体积比为5:95的乙腈-水混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，制成0.0400-0.0410mg.mL^-1对照品溶液。

2.如权利要求1所述的车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法，其特征在于，

色谱仪：Agilent1200高效液相色谱仪

检测器：UV检测器

色谱柱：Prevail C18(250mm×4.6mm，5mm)

色谱条件：流动相：乙腈-水体积比为5:95

流速：0.1mL/min

柱温：25℃

检测波长：255nm

进样量：20μL。

3.如权利要求1或2所述的车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法，其特征在于，供试品溶液的制备：

精密称取干燥的车前子粉末样品适量，以甲醇为提取溶剂，提取3次，提取时间均为120min，料液比(g/ml)为1:11，回收溶剂，用体积比为5:95的乙腈-水混合溶液溶解并定容至25mL容量瓶,过0.22μm微孔滤膜，制成供试品溶液。

4.如权利要求1或2所述的车前子中腺嘌呤核苷的HPLC含量测定方法，其特征在于，对照品溶液的制备：

精密称取腺嘌呤核苷对照品0.00205g，纯度为98.85％，置于50.00mL容量瓶中，用体积比为5:95的乙腈-水混合溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得0.0405mg.mL^-1对照品溶液。