CN102628839B

CN102628839B - 高纯度山茶苷a的制备及其质量控制方法

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Publication number: CN102628839B
Application number: CN2012100407080A
Authority: CN
Inventors: 刘元; 刘布鸣; 宋志钊; 黄艳; 兰太进; 张宁宁
Original assignee: Guangxi Institute Of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science
Current assignee: Yulin traditional Chinese medicine hospital
Priority date: 2012-02-22
Filing date: 2012-02-22
Publication date: 2013-10-30
Anticipated expiration: 2032-02-22
Also published as: CN102628839A

Abstract

本发明公开了一种以山茶科杨桐属植物亮叶杨桐为原料，提供一种高纯度山茶苷A的制备方法、检测方法与用途，其方法是：先将山茶科杨桐属植物亮叶杨桐粉碎，用乙醇加热回流提取，乙醇提取物经硅胶柱层析，用醋酸乙酯-甲醇混合溶剂洗脱，用薄层色谱检测，收集含有山茶苷A的洗脱液，合并，减压浓缩，重结晶，得到山茶苷A粗结晶。再用反相硅胶C－18柱制备高效液相法分离，对所收集的每一份洗脱液利用分析型高效液相色谱检测，合并保留时间相同而且纯度在90%～98%之间和98%以上的山茶苷A组分，减压浓缩，即可分别得到纯度在90%～98%之间的山茶苷A和纯度大于98%的山茶苷A组分，并采用薄层色谱和液相色谱进行质量控制。该方法不仅能提高山茶苷A纯度，而且能降低生产成本。

Description

高纯度山茶苷A的制备及其质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种化合物单体制备领域，具体涉及一种高纯度山茶苷A的制备及其质量控制方法。

背景技术

化学对照品又称标准品，是中药质量标准研究、质量检测和质量控制的实物对照，中药化学对照品的研究，是中药标准化研究的一个非常重要的部分，对产品的质量评价，特别是在药品生产的质量控制中，中药化学对照品起着极其重大的作用，是中药质量控制的基础与核心。

山茶苷A是一种黄酮类化学成分，是植物活性成分之一，也是许多植物和药品标准质量控制的指标性成分。目前尚未相应的国家药品标准物质，国内外对山茶苷A中药化学对照品的系统研究未见报道，参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，对山茶苷A化学对照品进行研究，建立山茶苷A化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立山茶苷A化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。

山茶苷A作为植物、药材及其产品的化学对照品，是质量控制的技术关键，众多企业、科研和检验部门都需要高纯度的山茶苷A对照品，其市场需求很大，由于山茶苷A在药材中的含量低，提取分离技术要求很高、难度很大。本发明进行山茶苷A中药化学标准品制备及其质量控制技术研究，解决高纯度山茶苷A化学对照品的问题，对中药现代化的作用是显而易见的，具有重大的实际意义和学术价值。

山茶苷A是从亮叶杨桐叶植物分离得到的活性物质，从公开文献所知，已有文献报道山茶苷A的提取方法，如：1.【题名】亮叶杨桐叶中山茶苷A的分离纯化及其抗氧化性能的研究【作者】袁尔东，宁正祥，刘本国，榻景益等，华南理工大学轻工与食品学院【刊名】食品工业科技，2008，（4）：212－214【文摘】：采用大孔树脂法对亮叶杨桐叶中山茶苷A进行分离纯化。结果显示，采用D101树脂，以3.0mg/mL流速上样，以无水乙醇3.0mg/mL流速洗脱，获得山茶苷A精制品的纯度可达91.7%。2.【题名】亮叶杨桐叶黄酮类提取物的鉴定及其抗氧化活性研究【作者】刘本国，战宇，宁正祥，高建华，许克勇【刊名】林产化学与工业，2008，28（1）：6－10. 【文摘】：为了开发亮叶杨桐——这种中国特有的植物，采用传统的有机溶剂提取法获得了亮叶杨桐叶的黄酮类提取物（FE）。高效液相色谱（HPLC）和多级串联电喷雾质谱（ESI－MSn）的分析表明，亮叶杨桐叶的主要黄酮类化合物为山茶苷A，其在FE中的质量分数为51.19%±1.13%。3.山茶苷A和山茶苷B的制备方法和用途，中国专利：申请（专利）号：200810062110.5申请（专利权）人：浙江大学地址：浙江省杭州市西湖区浙大路38号摘要：一种高纯度山茶苷A和山茶苷B的制备方法，以石崖茶为原料，用水醇溶剂系统提取，减压浓缩，以中极性有机溶剂萃取脱脂，水相继续浓缩石崖茶总黄酮，将总黄酮经水醇系统重结晶得到山茶苷A，将总黄酮用碳酸钾是山茶苷A转化成山茶苷B后通过离子交换层析或直接用水醇系统重结晶，得到山茶苷B。本发明设计合理，制备工艺简便，生产成本底，得率及纯度高，经过液-液萃取后采用重结晶法即可获得高纯度的山茶苷A和B，避开了常用的柱层析方法，有效降低有机溶剂消耗及能耗，减少环境污染，适于工业化生产。

上述方法从不同角度论述了山茶苷A的提取分离，分离纯度较高，但纯度均未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，且没有山茶苷A纯度与质量控制方法，无法满足高纯度山茶苷A化学对照品的需要。

发明内容

本发明的目的为了克服现有的山茶苷A纯度低、收率低或生产成本高的不足，以及无系统的山茶苷A的提取纯化与质量控制方法，提供一种高纯度山茶苷A的制备及其质量控制方法，该方法制备得到的山茶苷A纯度高、质量好，可以作为化学对照品或标准品，保证质量控制。

本发明是从山茶科杨桐属植物亮叶杨桐Adinandra nitida Merr. ex Li的叶子中经提取、分离、精制、纯化而制得的山茶苷A，其化学名、分子式、结构式如下：

中文名：山茶苷A

化学名：芹菜素－5－O－α－L－吡喃鼠李糖基(1→4)－6″－O－乙酰基－β－D－吡喃葡萄糖甙（apigenin-5-O-α-L-rhamnosyl-(1→4)-6″-acetyl-β-D-glucoside）

英文名：Camellianin A；

分子式：C₂₉H₃₂O₁₅；结构式如下：

本发明的目的是通过以下方案来实现的：

本发明的高纯度山茶苷A的制备方法，包括以下工艺过程：取山茶科杨桐属植物亮叶杨桐的干燥叶子，粉碎，用重量含量50－90％的乙醇提取2－8次，每公斤亮叶杨桐的干燥叶子加入乙醇的量为5－10倍，滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏，经硅胶柱层析，用醋酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集含山茶苷A的流分，薄层色谱TLC检测合并，浓缩，氯仿-甲醇重结晶，即得纯度为80～90％的山茶苷A粗结晶；将粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，色谱柱为C－18柱，利用乙腈-水为流动相洗脱，流速为5～10 mL/min，检测波长为330nm，柱温为25℃－35℃，收集山茶苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%－98%之间和纯度大于98%以上的山茶苷A，减压浓缩，得到纯度90%－98%之间以及大于98%以上的山茶苷A。

所述的醋酸乙酯－甲醇配比为：100:0～60:40；

所述的氯仿－甲醇配比为：5:1～5:5；

所述的乙腈－水配比为：15:85～50:50；

所述的HPLC条件为：色谱柱为C－18柱；流动相为乙腈：0.2%磷酸溶液=25:75～50:50；检测波长为330nm；流速为0.6 mL/min～1.5mL/min。

本发明高纯度化合物的质量控制方法如下：（1）薄层色谱方法进行山茶苷A分析；（2）液相色谱方法进行山茶苷A分析。

所述的薄层色谱方法：薄层板：聚酰胺薄膜（10×20cm）。3种展开剂系统：系统（1）乙醇－丙酮－水比例（7:5:6），系统（2）甲醇－冰醋酸－水比例（9:0.5:0.5），系统（3）乙醇－水比例（1:1）；点样：取本品适量，用甲醇制1mg/mL的溶液，在同一聚酰胺薄膜上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为0.5微克、1微克、3微克、5微克、10微克。置展开缸分别展开，展距：15cm。定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯（365nm）下检视。结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。

所述的液相色谱方法：色谱条件：色谱柱C－18，4.6×250mm，10微米；流速：1ml/min；进样量：10～20微升；面积归一化法定量。系统条件（1）流动相：甲醇－0.2%磷酸溶液比例（46:54－60:40）；检测波长：330nm；系统条件（2）流动相：乙腈－0.2%磷酸溶液比例（21:79－50:50）；检测波长：330nm；系统条件（3）流动相：乙腈－0.2%磷酸溶液比例（21:79－50:50）；检测波长：260nm。

含量与纯度测定：精密称取于105℃干燥至恒重的对照品适量，加80%甲醇水溶液制成每1ml含1mg的溶液，在测定条件下，进样20微升（约相当于20微克），注入液相色谱仪，用3个流动相溶剂系统分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法计算含量，结果系统测定对照品含量在均98%以上。杂质检查，分别在不同系统记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2.0%。

峰纯度检测：取对照品适量，按流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列DAD检测器进行峰纯度检查，山茶苷A的HPLC色谱峰>98%，其色谱峰紫外吸收光谱图，三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。

结果：本发明分离、纯化的山茶苷A化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共振、质谱以及理化检测确认化学结构。经3个展开系统5个不同浓度的TLC检测，2个流动相系统和2个不同波长的HPLC检测，同时对色谱峰用DAD做纯度检查，表明符合中药含量测定用化学对照品的要求，含量大于98%。

与现有技术相比，本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

1、本发明首次从石崖茶中制备出纯度符合化学对照品要求（含量98%以上）的山茶苷A，解决了山茶苷A化学对照品的供应问题，为亮叶杨桐茶药材的质量控制提供了提供科学基础和保证。

2、本发明设计合理，工艺简单，利用醇水溶剂提取，经过一次硅胶柱层析后重结晶即可得到纯度较高的山茶苷A，最后经制备高效液相色谱法制备出纯度达到98%以上的山茶苷A化学对照品，方法简便易行。

3、本发明分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。

4、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查、含量测定及质量控制，确保产品的质量。

通过对山茶苷A化学对照品进行研究，建立山茶苷A化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立山茶苷A化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。研究结果可为山茶苷A化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术，有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，将会产生潜在而不可估量的社会效益与经济效益。今后生产的各种产品，无论是在国内或是进入国际市场，都需要靠高水平的质量标准和高水平的分析测试技术来获得发展和提高，否则将失去市场，产品的质量标准和检测方法变得愈来愈重要，“安全、有效和质量可控”的用药标准已成为国际共识，药品生产应围绕着这一中心展开，其核心为质量标准控制水平，而化学对照品则起关键的作用。但目前大部分中药药材及其制剂，因化学成分不明或无化学对照品，无法阐明其作用的化学物质基础，也无法进行质量控制，而不能被现代文明社会所接受，也成为中草药和天然药物难以进入国际药品市场的制约关键，技术壁垒给发展中药产业带来了困难，因此，进行中草药化学成分的研究及质量标准规范化研究是中药现代化发展的必经之路，对阐明中草药作用的物质基础以及中草药制剂的生产加工工艺的制定、伪劣产品的鉴别等等具有重要的意义。毫无疑问，对山茶苷A进行质量标准研究，建立规范化的分析测试方法，制定高技术水平的控制山茶苷A质量的检测指标和分析方法，使之科学化、规范化，增强国际竞争力，为中药进入国际市场创造条件，具有重大的实际意义和学术价值。

附图说明

图1是高纯度山茶苷A的制备工艺流程图；

图2是山茶苷A色谱峰紫外吸收光谱图；

图3是山茶苷A色谱峰纯度检查5点光谱图；

图4是山茶苷A DAD峰纯度检查HPLC色谱图；

图5是山茶苷A质量控制的HPLC检测色谱图。

从图1中了解到，具体工艺为：

取山茶科杨桐属植物亮叶杨桐的干燥叶子，粉碎，用乙醇提取2－8次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏，经硅胶柱层析，用醋酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集含山茶苷A的流分，薄层色谱TLC检测合并，浓缩，氯仿-甲醇重结晶，即得纯度为80～90％的山茶苷A粗结晶；将粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，色谱柱为C－18柱，利用乙腈-水为流动相洗脱，流速为5～10 mL/min，检测波长为330nm，柱温为25℃－35℃，收集山茶苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%－98%之间和纯度大于98%以上的山茶苷A，减压浓缩，得到纯度90%－98%之间以及大于98%以上的山茶苷A。

从图2看出，山茶苷A的紫外光谱在262、329 ±1nm处有最大吸收峰，为黄酮类化合物的紫外特征吸收波长，紫外光谱与山茶苷A化学结构相符。

从图3看出，山茶苷A的5点色谱峰的光谱纯度检查，5点光谱完全重合，表明为单一纯物质峰。

从图4看出，山茶苷A的二极管阵列DAD峰纯度检查HPLC色谱图为单一的峰，表明为纯物质峰。

从图5看出，保留时间10分钟左右为主成分山茶苷A，主成分含量大于98.0%，各杂质峰面积总和不超过2.0%，其质量控制的HPLC检测色谱图峰结果数据信息如下：

具体实施方式

实施例一：取山茶科杨桐属植物亮叶杨桐的叶子5kg，粉碎成100目以下， 80％的乙醇提取2次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得乙醇提取物，得浸膏，经硅胶柱层析，用醋酸乙酯－甲醇（100:5～100:20）梯度洗脱，收集醋酸乙酯－甲醇（100:20）洗脱部分，用TCL检测，收集含有山茶苷A的流分，合并，浓缩，氯仿－甲醇（5：1）重结晶，得到山茶苷A粗结晶。将粗结晶用制备型RP－HPLC进行制备（色谱柱：C－18柱；流动相：乙腈:水=21:79；检测波长：330nm；流速：5mL/min），收集山茶苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测（色谱柱：C－18柱；流动相：乙腈:0.2%磷酸溶液=21:79；检测波长：330nm；流速：1mL/min）合并保留时间相同而且纯度在90%～98%之间以及纯度大于98%以上的山茶苷A，减压浓缩，得到纯度在90%～98%之间以及纯度大于98%以上的山茶苷A白色粉末。

实施例二：取山茶科杨桐属植物亮叶杨桐的叶子5kg，粉碎成100目以下， 75％的乙醇提取2次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得乙醇提取物，得浸膏，经硅胶柱层析，用醋酸乙酯－甲醇（100:10～100:25）梯度洗脱，收集醋酸乙酯－甲醇（100:25）洗脱部分，用TCL检测，收集含有山茶苷A的流分，合并，浓缩，氯仿－甲醇（4：1）重结晶，得到山茶苷A粗结晶。将粗结晶用制备型RP-HPLC进行制备（色谱柱：C－18柱；流动相：乙腈:水=20:80；检测波长：330nm；流速：6mL/min），收集山茶苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测（色谱柱：C－18柱；流动相：乙腈:0.2%磷酸溶液=30:70；检测波长：330nm；流速：1mL/min）合并保留时间相同而且纯度在90%－98%之间以及纯度大于98%以上的山茶苷A，减压浓缩，得到纯度在90%－98%之间以及纯度大于98%以上的山茶苷A白色粉末。

实施例三：取山茶科杨桐属植物亮叶杨桐的叶子5kg，粉碎成100目以下， 50％的乙醇提取2次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得乙醇提取物，得浸膏，经硅胶柱层析，用醋酸乙酯－甲醇（100:0～100:30）梯度洗脱，收集醋酸乙酯－甲醇（100:30）洗脱部分，用TCL检测，收集含有山茶苷A的流分，合并，浓缩，氯仿－甲醇（7:3）重结晶，得到山茶苷A粗结晶。将粗结晶用制备型RP－HPLC进行制备（色谱柱：C－18柱；流动相：乙腈:水=25:75；检测波长：330nm；流速：4mL/min），收集山茶苷A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测（色谱柱：C－18柱；流动相：乙腈:0.2%磷酸溶液=40:60；检测波长：330nm；流速：0.6mL/min）合并合并保留时间相同而且纯度在90%～98%之间以及纯度大于98%以上的山茶苷A，减压浓缩，得到纯度在90%～98%之间以及纯度大于98%以上的山茶苷A白色粉末。

高纯度山茶苷A的质量控制方法：

【薄层鉴别】取本品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，在同一聚酰胺薄膜上，分别按0.5微克、1微克、3微克、5微克、10微克不同的浓度梯度点样，以乙醇－丙酮-水（7：5：6）、甲醇－冰醋酸－水（9:0.5:0.5）、乙醇－水（1:1）三种系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光（365nm）下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。

【含量测定】照高效液相色谱法（中国药典2010年版附录VI D）测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈－0.2%磷酸溶液（21:79）为流动相；检测波长330nm，理论板数按山茶苷A峰计算应不低于3000。

测定法取于105℃干燥至恒重的本品适量，精密称定，加80%甲醇水溶液制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，精密量取 20微升注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法计算含量，主成分（山茶苷A C₁₈ H₂₀O₅）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。

Claims

1.一种高纯度山茶苷A的制备方法，其特征在于：包括以下工艺过程：取山茶科杨桐属植物亮叶杨桐的干燥叶子，粉碎，每公斤亮叶杨桐的干燥叶子用5－10倍重量的50－90％w/w的乙醇的提取2－8次，滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏，经硅胶柱层析，用醋酸乙酯-甲醇梯度洗脱，收集含山茶苷A的流分，薄层色谱TLC检测合并，浓缩，氯仿－甲醇重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的山茶苷A粗结晶；将粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，色谱柱为C－18柱，利用乙腈-水为流动相洗脱，流速为5～10 mL/min，检测波长为330nm，柱温为25℃－35℃，收集山茶苷 A组分，并对所收集的每一份洗脱液利用 HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%－98%之间和纯度大于98%以上的山茶苷A，减压浓缩，得到纯度90%－98%之间以及大于98%以上的山茶苷A；

所述的醋酸乙酯-甲醇配比为：100:0～60:40；

所述的氯仿-甲醇配比为：5:1～5:5；

所述的制备高效液相色谱法的流动相乙腈-水配比为：15:85～50:50；

所述的分析 HPLC条件为：色谱柱为C－18柱；流动相为乙腈：0.2%磷酸溶液=20:80～50:50；检测波长为330nm；流速为0.6 mL/min～1.5mL/min。

2.一种权利要求1所述的高纯度山茶苷 A的检测方法，其特征在于：采用薄层色谱分析方法，所述的薄层色谱分析方法：薄层板：聚酰胺薄膜；3种展开剂系统：系统（1）乙醇-丙酮-水重量比例7:5:6，系统（2）甲醇-冰醋酸-水重量比例9:0.5:0.5，系统（3）乙醇-水重量比例1:1；点样：取本品适量，用甲醇制1mg/mL的溶液，在同一聚酰胺薄膜上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为0.5 微克、1微克、3微克、5微克、10微克；置展开缸分别展开，展距：15cm；定位：喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，在 105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯下检视，波长选择365nm，结果在薄层色谱中，可见蓝色的单一的荧光斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。

3. 一种权利要求1所述的高纯度山茶苷 A的检测方法，其特征在于：采用液相色谱分析方法，所述的液相色谱分析方法：色谱条件：色谱柱C－18，4.6×250mm，10微米；流速：0.6－1.5ml/min；进样量：10～20微升；面积归一化法定量；系统条件（1）流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液重量比例46:54-60:40；检测波长：330nm；系统条件（2）流动相：乙腈－0.2%磷酸溶液重量比例21:79－50:50；检测波长：330nm；系统条件（3）流动相：乙腈－0.2%磷酸溶液重量比例21:79－50:50；检测波长：260nm；

含量与纯度测定：精密称取于105℃干燥至恒重的对照品适量，加80%甲醇水溶液制成每1ml含1mg的溶液，在测定条件下，进样20微升，注入液相色谱仪，用3个流动相溶剂系统分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的 2.5倍以上，用面积归一化法计算含量，结果系统测定对照品含量均在98%以上；杂质检查，分别在不同系统记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2.0%；

峰纯度检测：取对照品适量，按流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列 DAD检测器进行峰纯度检查，山茶苷A的HPLC色谱峰>98%，其色谱峰紫外吸收光谱图，三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。