CN101284855A - 山茶苷a和山茶苷b的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高纯度山茶苷A和山茶苷B的制备方法，以石崖茶为原料，用水醇溶剂系统提取，减压浓缩，以中极性有机溶剂萃取脱脂，水相继续浓缩石崖茶总黄酮，将总黄酮经水醇系统重结晶得到山茶苷A，将总黄酮用碳酸钾是山茶苷A转化成山茶苷B后通过离子交换层析或直接用水醇系统重结晶，得到山茶苷B。本发明设计合理，制备工艺简便，生产成本低，得率及纯度高，经过液－液萃取后采用重结晶法即可获得高纯度的山茶苷A和B，避开了常用的柱层析方法，降低有机溶剂消耗及能耗，减少环境污染，适于工业化生产。药理研究表明对H9C2心肌细胞系缺氧复氧模型损伤有显著的保护作用，可在治疗心血管系统疾病中应用。
Description
技术领域
本发明属植物药物领域，特别涉及一种利用石崖茶生产高纯度山茶苷A、B的制备方法及用途。
背景技术
石崖茶学名为亮叶杨桐(Adinandra nitida Merr.ex Li)，为产于广西的一种天然野生的珍贵名茶，石崖茶中除含有丰富的氨基酸、矿物质元素、茶多酚外，总黄酮含量高达28.4％，明显高于一般的茶叶。石崖茶除具有一般茶叶生津止渴、怡神醒脑的功效外，还具有清热解暑、抗肿瘤、止血和降压等作用。研究表明，石崖茶中的黄酮类化合物具有重要的生理活性，其中山茶苷A、B为其中的主要成分。但目前尚未有从石崖茶中大量制备山茶苷A、B的研究报道。在前期研究工作中，我们申报了石崖茶总黄酮的用途及其制备方法专利(申请号200610050392.8)，本研究是在以往研究基础上的深入，采用溶剂萃取、经简单重结晶及化学转化法发现了高纯度山茶苷A、B的制备方法，获得的山茶苷A、B经H9C2心肌细胞系缺氧复氧模型验证发现可以增加细胞的存活率及降低细胞LDH的活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度山茶苷A和山茶苷B的制备方法，具有一下结构式：
山茶苷A 山茶苷B
具体通过以下步骤实现：
(1)将石崖茶原料粉碎(或切碎)，用水/醇系统提取，按溶剂体积(单位：ml)与原料重量(单位：g)8∶1～10∶1的比例，提取2～3次，每次1小时，其中提取可采用加热回流、超声提取或渗漉，采用的醇可以是甲醇或乙醇，醇的浓度为50～100％，将提取液合并后浓缩回收醇，得到水相体积与原料重量比为1∶1～3∶1的浓缩液或浸膏；
(2)将浓缩液以中极性有机溶剂萃取脱脂，或浸膏用2至3倍量水溶解得到混悬液，以中极性有机溶剂萃取脱脂，除去有机溶剂后的水层浓缩至体积与原料重量比为1∶1，冷却后可析出大量沉淀，过滤或离心后得到石崖茶总黄酮；
(3)将总黄酮经水/醇系统分步结晶后得到山茶苷A；
(4)将总黄酮以碳酸钾处理后以盐酸中和或经阳离子交换树脂层析，以水/醇系统重结晶即可得到山茶苷B。
步骤(1)所述的水/醇系统是指水与甲醇或乙醇按8∶2～0∶1组成的溶剂系统。
步骤(2)所述的中极性有机溶剂选用乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷或1，2二氯乙烷中的一种。
步骤(3)所用的水-醇系统为水-甲醇或水-乙醇，第一次结晶采用90～100％的醇，第二次结晶采用50～70％的醇。
步骤(4)所述的碳酸钾处理是将总黄酮溶解在甲醇中，加入1～3倍量的碳酸钾，在70℃以上水浴中反应4小时，盐酸中和后第一次采用30～50％的醇结晶，第二次采用80～100％的醇结晶，获得含量≥90％的山茶苷B。
步骤(4)所述的阳离子交换树脂层析，是将反应产物经阳离子交换树脂除去盐和酸后，洗脱物直接用80～100％的甲醇或乙醇经过重结晶获得含量≥90％的山茶苷B。
本发明的另一个目的是提供山茶苷A和山茶苷B在治疗心血管系统疾病中的应用。用H9C2心肌细胞系缺氧复氧模型筛选结果表明山茶苷A和B具有心肌细胞保护作用，可以增加心肌细胞的存活率及降低细胞LDH的活性。可用于制备治疗心肌缺血、心肌梗塞或冠心病的药物。
本发明所述的山茶苷A和山茶苷B与制剂允许的药用辅料制备成药物。所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、喷雾剂和气雾剂。
本发明的有益之处是：
1.本发明首次从石崖茶中制备出含量达90％以上的山茶苷A、B，并可通过添加各种药用辅料制成多种剂型，为从石崖茶中开发出中药一类新药提供了物质基础；
2.本发明设计合理，工艺简单，利用水醇法提取、经过液-液萃取后采用重结晶法即可获得高纯度的山茶苷A、B，避开了常用的柱层析方法，使有机溶剂消耗及能耗都大大降低，同时减少了环境污染，非常适合工业化生产；
3.本发明分离速度快，生产周期短，因此具有很好的应用前景。
附图说明
图1为石崖茶中山茶苷A、B的制备工艺流程图。
具体实施方式
本发明结合以下实施例作进一步的说明。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。
实施例1山茶苷A的制备
参见图1，取石崖茶250g，粉碎至粒径大小在10mm以下，置于5000ml的圆底烧瓶中，加入80％甲醇3000ml回流提取1小时，过滤后滤渣再加入80％甲醇2000ml回流提取1小时，合并两次提取液，浓缩至500ml，以500ml乙酸乙酯萃取两次，水层继续浓缩至250ml，放置在温度为10℃的环境下结晶2小时，过滤，得到黄色的石崖茶总黄酮，将总黄酮先后用95％乙醇及50％乙醇结晶两次，得到山茶苷A，纯度为93.6％，收率为8.6％。
实施例2山茶苷A的制备
取石崖茶200g，粉碎至粒径大小在5mm以下，置于3000ml的圆底烧瓶中，加入50％乙醇1600ml渗漉提取，第一次提取7天，第二次补加溶剂后提取3天，合并两次提取液，回收乙醇后浓缩至600ml，加入等量乙酸乙酯萃取脱脂，水相继续浓缩至300ml，放置在室温下结晶1小时，过滤，得到黄色的石崖茶总黄酮，将总黄酮先后用甲醇及80％甲醇结晶两次，得到山茶苷A，纯度为91.8％，收率为9.5％。
实施例3山茶苷A的制备
取石崖茶300g，粉碎至粒径大小在5mm以下，置于5000ml的圆底烧瓶中，加入甲醇3000ml超声提取，第一次提取40分钟，第二次补加溶剂后提取20分钟，合并两次提取液，回收甲醇后浓缩得到浸膏，将此浸膏加入600ml水混悬，加入等量乙酸乙酯萃取脱脂，水相继续浓缩至300ml，放置在室温下结晶1小时，过滤，得到黄色的石崖茶总黄酮，将总黄酮先后用乙醇及70％乙醇结晶两次，得到山茶苷A，纯度为92.8％，收率为8.8％。
实施例4山茶苷B的制备
参见图1，取石崖茶250g，粉碎至粒径大小在10mm以下，置于5000ml的圆底烧瓶中，加入95％乙醇3000ml回流提取1小时，过滤后滤渣再加入95％乙醇2000ml回流提取1小时，合并两次提取液，浓缩得到浸膏。将此浸膏加入750ml水混悬，以750ml乙酸乙酯萃取两次，水层继续浓缩至500ml，放置在温度为10℃的环境下结晶2小时，过滤，得到黄色的石崖茶总黄酮56g。将总黄酮溶于1500ml甲醇中，加入碳酸钾56g，在70℃以上水浴中反应4小时。盐酸中和反应液，第一次采用30％的甲醇在5℃的环境下结晶2小时，过滤，得到山茶苷B的粗品，第二次采用甲醇在室温下结晶，得到山茶苷B精品，纯度为91.9％，收率为11.3％。
实施例5山茶苷B的制备
取石崖茶500g，粉碎至粒径大小在5mm以下，70％乙醇5000ml渗漉提取，第一次提取7天，第二次补加溶剂后提取3天，合并两次提取液，回收乙醇后浓缩得到流浸膏，加入1500ml水混悬溶解，加入等量乙酸乙酯萃取脱脂，水相继续浓缩至800ml，放置在室温下结晶1小时，过滤，得到黄色的石崖茶总黄酮128g。将总黄酮溶于3500ml甲醇中，加入碳酸钾256g，在70℃以上水浴中反应4小时。反应液通过D151H阳离子树脂，除去多余的碳酸钾，将洗脱液收集浓缩得到反应产物，产物采用80％乙醇在10℃的环境下结晶1小时，过滤，得到山茶苷B精品，纯度为93.2％，收率为9.7％。
实施例6山茶苷B的制备
取石崖茶350g，粉碎至粒径大小在5mm以下，置于5000ml的圆底烧瓶中，加入甲醇3000ml超声提取，第一次提取40分钟，第二次补加溶剂后提取20分钟，合并两次提取液，回收甲醇后浓缩得到浸膏，将此浸膏加入1050ml水混悬，加入等量乙酸乙酯萃取脱脂，水相继续浓缩至700ml，放置在室温下结晶1小时，过滤，得到黄色的石崖茶总黄酮86g。将总黄酮溶于1800ml甲醇中，加入碳酸钾258g，在70℃以上水浴中反应4小时。反应液通过732阳离子交换树脂除去多余的碳酸钾，洗脱液收集后浓缩得到反应产物，将产物采用95％乙醇在室温下结晶2小时，过滤，得到山茶苷B精品，纯度为92.6％，收率为9.3％。
实施例7喷雾剂的制备
山茶苷A或B5g，以乙醇100ml溶解，定容后加入吐温-80、维生素C后定量分装，分装成10瓶，制成喷雾剂。
实施例8气雾剂的制备
山茶苷A或B5g，乙醇溶解定容100ml后加入适量PEG300，定量分装于10瓶气雾剂耐压容器内，再压入适量抛射剂四氟乙烷，制成气雾剂。
实施例9滴丸的制备
山茶苷A或B5g，加入95g熔融的PEG6000，搅拌均匀并在75℃下保温，滴入甲基硅油冷却液中成丸，每丸25mg。
实施例10注射剂的制备
山茶苷A或B5g，加入10g甘露醇，加注射用水至200ml溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤后每瓶2ml分装于5ml的西林瓶内，放入真空冷动干燥机内冻干，取出后轧盖包装即得。
实施例11胶囊剂的制备
取山茶苷A或B5g，与淀粉20g混匀，加10％淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后，置60℃～70℃干燥后于12目筛整粒，套入1号空心胶囊中即得，每粒胶囊含药10mg。
实施例12片剂的制备
取山茶苷A或B5g，与淀粉10g混匀，加10％淀粉浆6g制成软材，加入硬脂酸镁0.3g，干淀粉10g混匀后压制成片即得，每片含药10mg。
实施例13山茶苷A、B的药理活性研究
将山茶苷A、B均配制成90uM，30uM和10uM三个浓度，H9C2心肌细胞按1×104个细胞/ml种板24小时后，撤去血清和高糖型培养基，换成含不同药物浓度的无糖血清。造缺氧6小时后，复氧12小时，吸取上清测LDH活性，用MTT孵育4小时，检测细胞存活率。所有数据用t-text进行统计分析。
结果表明山茶苷A、B在所设定浓度内均可以增加心肌细胞H9C2的存活率及降低细胞LDH的活性，是相对比较有前途的药物。
Claims (9)
1.山茶苷A和山茶苷B的制备方法，具有下列结构式：
山茶苷A 山茶苷B
其特征是通过以下步骤实现：
(1)将石崖茶原料粉碎或切碎，用水/醇系统提取，按溶剂体积与原料重量8∶1～10∶1的比例，提取2～3次，每次1小时，其中提取可采用加热回流、超声提取或渗漉方法，所用的醇选用甲醇或乙醇，醇的浓度为50～100％，将提取液合并后浓缩回收醇，得到水相体积与原料重量比为1∶1～3∶1的浓缩液或浸膏；
(2)将浓缩液以中极性有机溶剂萃取脱脂，或浸膏用2至3倍量水溶解得到混悬液，以中极性有机溶剂萃取脱脂，除去有机溶剂后的水层浓缩至体积与原料重量比为1∶1，冷却后析出大量沉淀，过滤或离心后得到石崖茶总黄酮；
(3)将总黄酮经水/醇系统分步重结晶后得到山茶苷A；
(4)将总黄酮以碳酸钾处理后以盐酸中和或经阳离子交换树脂层析，以水/醇系统重结晶得到山茶苷B。
2.根据权利要求1所述的山茶苷A和山茶苷B的制备方法，其特征是：步骤(1)所述的水/醇系统是指水与甲醇或乙醇按8∶2～0∶1组成的溶剂系统。
3.根据权利要求1所述的山茶苷A和山茶苷B的制备方法，其特征是：步骤(2)所述的中极性有机溶剂选用乙醚、乙酸乙酯、三氯甲烷或1，2二氯乙烷中的一种。
4.根据权利要求1所述的山茶苷A和山茶苷B的制备方法，其特征是：步骤(3)所用的水/醇系统为水-甲醇或水-乙醇组成的溶剂系统，第一次结晶采用90～100％的醇，第二次结晶采用50～70％的醇。
5.根据权利要求1所述的山茶苷A和山茶苷B的制备方法，其特征是：步骤(4)所述的碳酸钾处理是将总黄酮溶解在甲醇中，加入1～3倍量的碳酸钾，在70℃以上水浴中反应4小时，盐酸中和后第一次采用30～50％的醇结晶，第二次采用80～100％的醇结晶，获得含量≥90％的山茶苷B。
6.根据权利要求1所述的山茶苷A和山茶苷B的制备方法，其特征是：步骤(4)所述的阳离子交换树脂层析，是将反应产物经阳离子交换树脂除去盐和酸后，洗脱物直接用80～100％的甲醇或乙醇经过重结晶获得含量≥90％的山茶苷B。
7.根据权利要求1的方法制备获得的山茶苷A或山茶苷B在治疗心血管系统疾病中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是：所述山茶苷A或山茶苷B在制备治疗心肌缺血、心肌梗塞或冠的药物中的应用。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征是：所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂、喷雾剂或气雾剂。
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