CN105061458B - 一种无毒、高纯银杏总内酯及其单体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种无毒、高纯银杏总内酯及其单体的制备方法，它采用溶剂萃取+沉析+配合填料柱层析+超临界CO2反萃取结晶组合工艺，制取高纯银杏总内酯及其单体。萃取溶剂为甲酸丙酯，沉析溶剂采用石油醚，可获得总内酯纯度高达98％；再上中性氧化铝与正相硅胶配合填料柱层析，超临界CO2反萃取结晶，可获得银杏内酯单体A、B、C的纯度达97％以上，且有毒银杏酸未检出。该分离纯化工艺，方法简便、产品纯度高、易于应用到实际生产中。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种天然产物有效成分的提取分离和纯化方法，确切地说是一种自银杏内酯粗提物中制备高纯银杏总内酯及其单体的方法。
二、背景技术
银杏总内酯包括银杏内酯A(以下简称GA)、银杏内酯B(以下简称GB)、银杏内酯C(以下简称GC)、银杏内酯J、银杏内酯M和白果内酯等，属银杏特有成分。银杏内酯，如GA、GB、GC等对治疗心脑血管疾病具有显著疗效。为开发高效、靶点明确的新药或保健食品，有必要对银杏内酯进行高纯分离。银杏内酯从银杏内酯粗提物中分离获得。银杏内酯粗提物主要从银杏叶中提取分离获得，但银杏叶中含有致敏性物质—银杏酸等，中国药典2010年版限定银杏叶粗提物(GBE)中总银杏酸含量百万分之十以下，欧洲药典要求更低。
见诸于文献报道的有银杏内酯分离方法主要有醇类提取－溶剂萃取－柱色谱分离法、醇类提取－溶剂萃取－反相色谱分离法、色谱分离—重结晶法、超临界流体萃取法(SCFE)等。
经由国家知识产权局网站检索，截至2015年7月25日，与银杏内酯分离/制备方法直接相关的授权发明专利或申请主要有：
1、CN104817570A(发明人：林德良《一种银杏内酯B制备方法及其制备得到的银杏内酯B》)：该发明提供一种银杏内酯B的制备方法及其制备得到的银杏内酯B。本发明摒弃了有毒的有机溶剂，代之以乙醇和水并配合分离柱、水处理以及中低浓度乙醇重结晶技术用于银杏内酯B的分离纯化，得到高纯度的银杏内酯B，杂质含量少且未检出白果内酯和致敏性成分银杏酸。该发明基于柱层析、重结晶分离纯化银杏内酯B。
2、CN103159619A(发明人：薛锋，《从银杏外种皮中提取银杏酸、银杏内酯的工业化生产技术》)：该发明涉及一种从银杏外种皮中提取银杏酸、银杏内酯的工业化生产技术，包括以下步骤：银杏外种皮浸取；浸取物的分离与浓缩分馏；浓缩液的pH值调节，分离出粗提物银杏酸，经过结晶重结晶、碱液和酸析进行脱色，进一步提纯银杏酸；浓缩液后的母液进行萃取、反萃取后调节pH值，酸化后浓缩、冷却过滤得银杏内酯粗品，将银杏内酯粗品同醇溶解后，进行柱分离，得高纯度的银杏内酯。本发明利用酸溶液调节含银杏酸或银杏内酯溶液的pH值，通过同离子效应将银杏酸或银杏内酯析出，该技术具有工艺简单、操作方便、成本低、提取率高，提取纯度高的优点，能从银杏外表皮中大量、迅速地提取银杏酸和银杏内酯，适合工业化大生产的要求。该发明基于萃取、调pH值、柱分离获得高纯银杏总内酯。
3、CN102627656A(发明人杜安全、周正华，《提取分离银杏内酯A、B、C、J、M及白果内酯的工艺》:本发明公开了一种提取分离银杏内酯A、B、C、J、M及白果内酯的工艺，以银杏叶或银杏树根皮为原料，以弱碱性水为溶剂提取，提取液浓缩，过滤，中和，滤液先上聚酰胺柱，收集流出液，聚酰胺柱用水洗脱，洗脱液与流出液合并上大孔树脂柱，以乙醇洗脱，浓缩至小体积，分步析出结晶。粗晶用乙醇、甲醇等进行重结晶，分别得银杏内酯A、B、C、J、M和白果内酯单体，经HPLC检测，银杏内酯A、B、C和白果内酯纯度可以达到98％，银杏内酯J、M纯度可以达到97.5％。本发明工艺简单，成本低，收率高。该法采用碱水提取、酸中和，大孔树脂柱分离、重结晶纯化。
4、ZL98111546.2(发明人潘见、《物质成分的超临界流体结晶分离方法》)：该发明是将超临界流体萃取与结晶分离技术方法集成为一体；在超临界流体、夹带剂和结晶器的共同作用下，在结晶釜内完成萃取、吸附、结晶和干燥，使混合物料中的有效成分一步实现梯度结晶分离。该法可用于分离银杏总内酯。
5、ZL200310104958.7(《模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯B的方法》)：该发明是一种用模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯B的方法。以银杏叶为原料，经过水煮，乙酸乙酯萃取、模拟移动床纯化、乙醇重结晶、甲醇重结晶得到纯度大于90％银杏内酯B单体。该发明基于模拟移动床色谱分离GB。
6、ZL00117758.3(《由银杏叶或银杏叶浸膏制备药物银杏内酯A、B的方法》)：该发明是一种由银杏叶或银杏叶浸膏制备药物银杏内酯A、B的方法。该方法是向银杏叶或其浸膏加入乙醇等浸取剂，得到的浸取液经过滤、分层，取出有机相去杂，然后经浓缩、干燥获得富集GA和GB，采用制备型液相色谱再分离A与B。该发明的特征在于加入浸取液的同时加入氯化物盐析剂，及去杂过程加入钾盐或钠盐；液相色谱的分离柱流动相为乙酸乙酯和石油醚混合液，固定相为硅胶。该发明的单体纯化依赖于制备色谱。
7、CN101085780A(申请号200610014207.X，《银杏内酯的制备方法》)：该发明公开了本发明公开了一种银杏内酯的制备方法，按顺序包括如下步骤：(l)取银杏叶粗提物，粉碎，加醋酸乙酯搅拌萃取，滤过，滤液回收醋酸乙酯至尽，干燥，得银杏内酯粗提物；(2)取银杏内酯粗提物，粉碎，用乙醇充分溶解，溶液上酸性氧化铝柱，收集流出液，再用乙醇洗脱，收集洗脱液，合并流出液和洗脱液，减压浓缩，结晶，得银杏内酯晶体混合物；(3)将银杏内酯晶体混合物用少量乙醇洗涤，滤过，再重结晶，即得银杏内酯混合晶体。该发明的目标产物是银杏内酯A和银杏内酯B的混合晶体。
8、CN101134758A(申请号：200710050242.1，《从银杏叶中提取分离银杏内酯A、B、C、J及白果内酯单体的方法》)：该发明公开了一种从银杏叶中提取分离银杏内酯A、B、C、J及白果内酯单体的方法，即以银杏叶为原料，采用乙醇提取，乙酸乙酯萃取，极性无孔吸附树脂柱吸附，乙醇结晶得银杏总内酯，再经过硅胶柱层析，用正己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱，分段收集洗脱液，依次分别得到白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C和银杏内酯，再用不同浓度乙醇结晶分别得到白果内酯、银杏内酯A(60-80％乙醇结晶)、银杏内酯B(30-70％乙醇结晶)、银杏内酯C和银杏内酯J单体，纯度99％以上。此方法采用硅胶柱层析方法预分离各单体。
9、CN1680392A(申请号：200510023164.7，《一种高纯度银杏内酯的制备方法》)：该发明公开了采用高速逆流色谱法(HSCCC)从银杏叶中分离一种高纯度银杏内酯的制备方法。用三个溶剂体系，分别经过两次HSCCC分离后，可得到银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J和白果内酯，纯度均达到99％以上。该方法涉及三个溶剂体系，二次分离。
10、CN1844125A(申请号：200510063407.X，《一种从银杏叶或银杏叶提取物中提取银杏内酯B的新方法》)：该发明特征在于，采用了液—液萃取后再进行精制的方法；萃取的溶剂为正丁醇或其他与正丁醇溶解性与极性相似的溶剂；其提取方法包含以下步骤：(l)取银杏叶或银杏叶提取物，加水煮沸，冷藏，取上清液，过滤，收集滤液；(2)滤液中加入正丁醇或其他与正丁醇相似溶解性、相似极性的溶剂萃取，分出水层；(3)萃取液经减压回收正丁醇作为萃取液，并蒸干，收集干燥物；(4)干燥物中加入乙醇溶液煮沸使溶解，冷藏，抽滤，并洗涤得晶体；(5)晶体中加入乙醇使溶解，冷藏，抽滤，得银杏内酯B晶体；(6)银杏内酯B晶体经真空干燥后得纯度为90％以上的银杏内酯B单体。该方法中正丁醇萃取的浸膏内含有较多GA、GC、白果内酯和黄酮类成分，难以直接结晶获得GB。
11、CN1594319A(申请号200410041120.2，《银杏内酯提取工艺和银杏内酯注射液及其制备方法》)：该发明公开了一种银杏内酯提取工艺和银杏内酯注射液及其制备方法。该提取工艺为称取一定量银杏叶粉碎，加数倍量的稀丙酮液温浸提取，回收丙酮，除杂，醋酸乙酯萃取纯化，醋酸钠再除杂，回收醋酸乙酯，40％～95％乙醇或甲醇中重结晶，过滤，40℃～80℃干燥。此法使用乙醇水或甲醇结晶，产品脱水困难亦可能有甲醇残留。10、CN1733768A(申请号200510041266.1，《银杏内酯提取和纯化工艺》)：该发明公开了一种银杏内酯提取和纯化工艺，该工艺包含下列步骤：称取银杏干叶，粉碎，按药材重量加2～10倍的5％～95％乙醇或甲醇提取，提取液回收醇后用脱脂溶剂除杂，萃取，再除杂，得粗制品，用5％～95％乙醇重结晶，过滤，干燥得银杏总内酯精制品。该发明的目标产物是银杏总内酯。等等。
三、发明内容
本发明旨在为中药新药或高档保健食品开发提供高纯度的原料药银杏总内酯以及银杏内酯单体A、B、C，所要解决的技术问题是自市场原料过剩的银杏内酯粗提物中分离并纯化银杏总内酯及其中银杏内酯单体。
本发明的技术方案是以市售的银杏内酯粗提物为原料，包括溶解、提纯以及分离和纯化，所述的溶解就是将粗提物溶于温水中得到溶液；所述的提纯是指对粗提物溶液进行萃取和沉析得到纯度≥98％的银杏总内酯；所述的分离和纯化是指对银杏总内酯进行分离并纯化，从而得到高纯度的银杏内酯单体A、B、C。具体工艺过程如下：
1.萃取：以甲酸丙酯为溶剂对粗提物溶液进行萃取，溶剂与溶液体积比1：1，萃取完全后液液分离，萃取液浓缩至原体积的四分之一得到浓缩液；
2.沉析：向浓缩液中加入石油醚进行沉析，浓缩液与石油醚的体积比1：0.3～0.5，沉析完全后固液分离，沉析物为纯度≥98％银杏总内酯；
3分离：以配合填料柱层析对银杏总内酯进行分离，配合填料是中性氧化铝和正相硅胶以1：3～4的质量比均匀混合得到的填料，以体积比为1：1～2的石油醚和甲酸丙酯混合液作为洗脱液，依次分段收集银杏内酯单体C、A、B洗脱液，将各单体溶液分别旋转蒸发干燥后便得到GA、GB和GC，纯度均在90％左右。
4.纯化：用超临界CO2反萃取结晶法对GA、GB和GC进行纯化，反萃取含义是用超临界CO2流体将单体中的杂质萃取带走，反萃取结晶压力9-15MPa，温度55-60℃，时间45-60min，得到纯度≥97％的银杏内酯单体C、A、B，且银杏酸未检出。
所述的银杏内酯粗提物除了符合中国药典2010年版规定标准外，质量更高，其中，银杏总内酯的含量度≥70％，即纯度≥70％。
总之，本发明技术方案是以银杏内酯粗提物为起始原料，采用溶剂萃取+沉析+配合填料柱层析+超临界CO2反萃取结晶集成组合工艺制备高纯的银杏总内酯及其中银杏内酯单体。
本发明的主要的优点在于：
①.利用银杏内酯与黄酮、有机酸等杂质在空间结构、分子极性、分子量等存在一定差异，直接进行萃取、沉析分离、配合填料柱层析、超临界CO2流体反萃取结晶精制，省去了溶剂重结晶漫长过程。
②.本工艺可获得多品种系列产品，如98％以下所有纯度梯度产品，银杏内酯单体C、A、B，纯度可达97％以上，且银杏酸未检出，可促进所有银杏内酯类新药的开发。
备注：
(1)银杏内酯的检测(高效液相色谱法测定)
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以正丙醇-四氢呋喃-水(1：15：84)为流动相；用蒸发光散射检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。
(2)总银杏酸的检测(照高效液相色谱法测定)
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-1％冰醋酸溶液(90：10)为流动相；检测波长为310nm。理论板数按白果新酸峰计算应不低于4000。
【具体参见中国药典2010年版第一部P392-393】
四、具体实施方式
实施例1：
(1)溶解：称取100g市售纯度70.6％的银杏内酯粗提物(GA纯度33.4％，GB纯度29.7％，GC纯度7.5％)原料，按照液固比20:1(V/W)，即2L的温水(40℃)溶解；
(2)萃取：用甲酸丙酯为溶剂进行萃取，上述溶液与甲酸丙酯萃取溶剂的体积比1:1，萃取2次；
(3)沉析：萃取液浓缩至约1L，加入石油醚进行沉析，石油醚体积为萃取浓缩液的体积的30％，获得沉析物为纯度98.3％的银杏总内酯；
(4)配合填料柱层析：采用中性氧化铝与正相硅胶复合填料，氧化铝与硅胶的质量比1:3，洗脱液为甲酸丙脂与石油醚的混合物(甲酸丙脂:石油醚＝2:1,V/V)，分段收集各单体洗脱液并分别旋转蒸发干燥后得到纯度90％银杏内酯单体C、A、B，
(5)超临界CO2反萃取结晶：将上述步骤(4)分段收集的各自纯度90％以上单体分别进行超临界CO2反萃取结晶，压力10MPa、温度60℃、时间60min，分别得到纯度97.3％的GC2.1g、纯度98.1％GA 9.7g、纯度97.7％GB 8.3g，且银杏酸未检出。
实施例2：
(1)溶解：称取100g市售纯度70.6％的银杏内酯粗提物(GA纯度33.4％，GB纯度29.7％，GC纯度7.5％)原料，按照液固比22:1(V/W)，即2.2L的温水(40℃)溶解；
(2)萃取：用甲酸丙酯为溶剂进行萃取，上述溶液与甲酸丙酯萃取溶剂的体积比1:1，萃取2次；
(3)沉析：萃取液浓缩至约1.1L，加入石油醚进行沉析，石油醚体积为萃取浓缩液的体积的30％，获得沉析物为纯度98.8％的银杏总内酯；
(4)配合填料柱层析：采用中性氧化铝与正相硅胶复合填料，氧化铝与硅胶的质量比1:3，洗脱液为甲酸丙脂与石油醚的混合物(甲酸丙脂:石油醚＝1:1,V/V)，分段收集各单体洗脱液并分别旋转蒸发干燥纯度90％银杏内酯单体C、A、B，
(5)超临界CO2反萃取结晶：将上述步骤(4)分段收集的各自纯度90％以上单体分别进行超临界CO2反萃取结晶，压力15MPa、温度55℃、时间50min，分别得到纯度98.2％的GC1.9g、纯度97.8％GA 9.9g、纯度97.2％GB 8.6g，且银杏酸未检出。
Claims (1)
1.一种无毒、高纯银杏总内酯及其单体的制备方法，以纯度≥70％银杏内酯粗提物为原料，包括用40℃温水溶解、提纯以及分离和纯化，其特征在于：所述的提纯、分离和纯化有以下工艺过程：
(1).萃取：向粗提物溶液中加入等体积的甲酸丙酯进行萃取，萃取完全后分离，将萃取液浓缩至原体积的四分之一得到浓缩液；
(2).沉析：向浓缩液中加入石油醚进行沉析，浓缩液与石油醚的体积比1：0.3～0.5，沉析完全后分离，沉析物为纯度≥98％银杏总内酯；
(3).分离：以配合填料柱层析对银杏总内酯进行分离，配合填料是中性氧化铝和正相硅胶以1：3～4的质量比均匀混合得到的填料，洗脱液为石油醚和甲酸丙酯以1：1～2的体积比混合的混合液，依次分段收集银杏内酯单体C、A、B洗脱液，将各单体溶液分别旋转蒸发干燥后便得到GA、GB和GC；
(4)纯化：用超临界CO2反萃取结晶法对GA、GB和GC进行纯化，反萃取结晶压力9-15MPa，温度55-60℃，时间45-60min，得到纯度≥97％的银杏内酯单体C、A、B，且银杏酸未检出。
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