CN102464665B - 一种银杏内酯a的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银杏内酯A的制备方法，其特征在于包含下列步骤：将银杏叶粗提物用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离，即可；其中，所述的大孔反相吸附树脂的参数如下：粒径为50～100μm，孔径为

Description

一种银杏内酯A的制备方法

技术领域

本发明具体的涉及一种银杏内酯A的制备方法。

背景技术

银杏(Ginkgobilobal.)为银杏科银杏属植物。银杏树出现于二亿年前，在冰川世纪几近灭种，仅在我国幸存，被达尔文称为“活化石”。随着银杏叶研究的发展，现已证明：银杏叶的活性成分主要是黄酮和内酯类化合物。其中内酯类化合物有：银杏内酯A(BN52020)、银杏内酯B(BN52021)、银杏内酯C(BN52022)、银杏内酯M(BN52023)、银杏内酯J(BN52024)及白果内酯，已证明银杏内酯均为强血小板活化因子(platelet-activating factor，PAF)受体拮抗剂。它们独特的药理作用和治疗价值已引起世界范围制药工业的极大兴趣。

随着对银杏叶中有效药用成分的明确，单一有效成分新药成为近十年来开发的目标。银杏内酯是仅在银杏叶中发现的一类具有特殊结构及显著药理活性的重要成分，迄今尚未发现存在于其他任何植物中。更重要的是它们具有独特的药理作用和治疗价值。

目前银杏叶仍是提取银杏内酯化合物的主要工业生产来源。银杏内酯的提取分离方法报道较多，但由于银杏叶中这类化合物含量很低，且具有特定结构，因此，提取分离步骤费时且得率低。何珺等人发表的“DA201型大孔吸附树脂分离银杏叶提取物中银杏内酯A、B、C和白果内酯的研究”(何珺，何照范等.DA201型大孔吸附树脂分离银杏叶提取物中银杏内酯A、B、C和白果内酯的研究[R].中草药.2004.12(35))中采用大孔吸附树脂DA201提纯，并通过两次结晶的办法得到纯度为95％的银杏内酯A，此方法的缺点在于树脂的提取收率低，只有62％，且银杏内酯A的纯度不高，因此结晶后的纯度只有95％。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的银杏内酯A的提取分离方法中，收率和纯度都很低的缺陷，而提供了一种银杏内酯A的制备方法。本发明的制备方法不仅产物收率高，且可以达到很高的产物纯度。

本发明人经过大量研究，发现采用一种特别选择的大孔反相吸附树脂对银杏叶粗提物进行分离，可得到很高收率的银杏内酯A。本发明人还进一步优化了吸附洗脱条件，使得银杏内酯A的收率大于85％，且纯度大于90％，并且可通过两次结晶使得银杏内酯A的纯度达到98％以上。

因此本发明涉及一种银杏内酯A的制备方法，其包含下列步骤：将银杏叶粗提物用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离，即可；所述的大孔反相吸附树脂的参数如下：粒径为50～100μm，孔径为树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯。其中，所述的孔径较佳的为所述的粒径较佳的为60～80μm。所述的大孔反相吸附树脂更佳的为苏州纳微生物科技有限公司生产的大孔反相吸附脂，型号为NM PS100，其粒径为：50～100μm，孔径为树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯。

所述的大孔反相吸附树脂在使用前，较佳的先进行预处理，预处理的方法可为本领域常规的预处理该类树脂的方法。优选的方法如下：用酸水溶液冲洗树脂，再用去离子水洗到中性，即可。其中，所述的酸水溶液中的酸可为无机酸，如盐酸，其摩尔浓度较佳的为0.5～2.5N，优选1N。酸水溶液较佳的为酸的丙酮水溶液，丙酮的体积浓度较佳的为60～90％，优选70％。酸水溶液的用量较佳的为2～5个柱体积，优选2～3个柱体积。更佳的预处理步骤如下：将含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量为3BV，再用去离子水洗到中性。

本发明中，所述的银杏叶粗提物可为本领域常规的经过溶剂提取和/或萃取等方法而制得的银杏叶粗提物。本发明中，所述的银杏叶粗提物可为醇提和/或酯溶剂萃取所得的粗提物，其中所述的醇可为乙醇，酯可为乙酸乙酯。

较佳的，所述的银杏叶粗提物可由下列方法制得：

(1)将银杏叶用乙醇水溶液浸泡提取后离心，取上清液；

(2)将步骤(1)所得物质用乙酸乙酯萃取。

步骤(1)中，所述的银杏叶较佳的为干银杏叶。在浸泡提取前较佳的先将银杏叶用水洗，水洗的次数较佳的为1次。所述的乙醇水溶液的体积浓度较佳的为40～80％，更佳的为60～70％。每次提取所用的乙醇水溶液与银杏叶的体积质量比较佳的为3～8L/Kg，更佳的为5L/Kg。所述的每次浸泡的时间较佳的为1～3小时，更佳的为2小时。浸泡的温度较佳的为60～80℃。所述的浸泡提取以及离心的次数较佳的为1～3次，更佳的为2次。得到上清液后，较佳的再进行浓缩除去乙醇，得浓缩液。

步骤(2)中，在用乙酸乙酯萃取之前，较佳的先用无机酸调节步骤(1)所得的浓缩液的pH为2～6，更佳的为3～4，其中无机酸优选盐酸。萃取的次数较佳的为1～3次，更佳的为2次。乙酸乙酯的用量较佳的为步骤(1)所得物质的1～3倍体积，优选1.5倍体积。所述的萃取较佳的包含下列步骤：先用乙酸乙酯萃取，弃去萃余相，再将萃取相中加入水，震荡混合后弃去水相，得酯相，即可。更佳的，将酯相浓缩，除去乙酸乙酯，即可。

本发明中，所述的用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离的方法和条件均可为本领域常规的用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离的方法和条件，本发明人经过大量研究，摸索出以下特别优选的步骤和条件：以体积浓度40～60％的乙醇水溶液为洗脱剂，将银杏叶粗提物用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离，即可。

较佳的，在所述的柱层析分离中，收集银杏内酯A的纯度大于80％(优选大于90％)的洗脱液，即可。

其中，所述的柱层析分离的步骤较佳的如下：将银杏叶粗提物上柱后，先用体积浓度20％～30％的乙醇水溶液进行洗脱除杂，再用体积浓度40％～60％的乙醇水溶液进行洗脱，收集银杏内酯A的纯度大于80％(优选大于90％)的洗脱液，即可。

其中，所述的体积浓度20～30％的乙醇水溶液的用量较佳的为4～6个柱体积，更佳的为5个，体积浓度40％～60％的乙醇水溶液的用量较佳的为3-5个柱体积，更佳的为4个柱体积。

本发明中，银杏内酯A纯度的检测可采用HPLC方法，以银杏内酯A标准品为对照。

本发明中，在将银杏叶粗提物用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离之前，较佳的，先将银杏叶粗提物溶于体积浓度10～15％的乙醇水溶液中，得银杏叶粗提物乙醇溶液，再上柱进行柱层析分离。该银杏叶粗提物乙醇溶液的pH值较佳的为2～4，其pH值可由无机酸调节，所述的无机酸较佳的为盐酸。

本发明中，在大孔反相吸附树脂柱层析分离结束后，较佳的还包含下列步骤：将柱层析分离所得物质进行本领域常规的结晶步骤，得银杏内酯A晶体，即可。

其中，所述的结晶步骤较佳的包含下列步骤：

(1’)将柱层析分离所得的洗脱液在20～40℃(优选25℃)下浓缩至出现浑浊后，于2～10℃条件下静置10～24小时，抽滤，得银杏内酯A粗晶体；

(2’)将步骤(1’)所得粗晶体用蒸馏水洗涤，用无水乙醇溶解，溶解后加入蒸馏水，当出现浑浊后于2～10℃(优选4℃)条件下静置10～24小时，得银杏内酯A晶体；

步骤(1’)中，根据本领域常识，浓缩蒸出乙醇的速度不宜过快；在静置结晶后，可通过抽滤得到银杏内酯A粗晶体

步骤(2’)中，用蒸馏水洗涤时，每次洗涤蒸馏水的用量较佳的为3-5L/Kg固体；蒸馏水洗涤的次数较佳的为1次；无水乙醇的用量较佳的为将步骤(1’)所得粗晶体刚刚溶解，即可，一般为1～2L/Kg固体；所加的蒸馏水的用量较佳的为3-5倍乙醇体积，更佳的为4倍乙醇体积，在静置结晶后，可通过抽滤得到银杏内酯A晶体。

本发明中，在上述结晶步骤之后，得到的晶体的纯度大于98％(HPLC检测)。

本发明中，最佳的，所述的银杏内酯A的制备方法包含下列步骤：

(1)取晒干银杏叶，水洗一次，用3～8L/Kg含40～80％(v/v)乙醇的水溶液在60～80℃下浸泡提取2h后，离心取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下除去乙醇，得到醇提物浓缩液。

(2)用盐酸调节上述浓缩液的pH至2～6，乙酸乙酯萃取，萃取后弃去萃余相，向萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10～15％(v/v)乙醇的水溶液溶解银杏内酯A粗品，并用盐酸将其pH调整到2-4。

(3)将银杏内酯A粗品的乙醇溶液上大孔反相吸附树脂NM PS100，上柱后先用4～6BV含20～30％乙醇的水溶液除杂，再用3～5BV含40～60％乙醇的水溶液将银杏内酯A集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将银杏内酯A纯度大于80％的洗脱液混合。

(4)将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现浑浊后，于2～10℃冰箱中静置过夜结晶，得到银杏内酯A粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到银杏内酯A晶体，HPLC检测其纯度大于98％。

本发明中，上述各优选技术特征可在不违背本领域常识的前提下任意组合，即得本发明的各较佳实例。

除特殊说明外，本发明涉及的原料和试剂均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的制备方法中，得到的银杏内酯A不仅收率较高，且可以达到很高的纯度。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

以下各实例中GA均为银杏内酯A。NM PS100为苏州纳微生物科技有限公司生产的大孔反相吸附脂，其粒径为：50～100μm，孔径为树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯。

实施例中的BV表示柱体积，为本领域常规单位。

实施例1

取4.25Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加21L含40％乙醇的水溶液在60℃下浸泡提取2h后离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至4，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到3.0。

取预处理后的大孔反相吸附树脂NM PS100树脂(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上NM PS100。上柱后先用5L含20％乙醇的水溶液除杂，再用4L含40％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于90％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为85.9％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体9.2g，总收率为54.1％，HPLC检测其纯度为98.2％，。

实施例2

取3.15Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加15.5L含50％乙醇的水溶液在70℃下浸泡提取2h后离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至5，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到3.5。

取预处理后的大孔吸附树脂NM PS100树脂(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上NM PS100。上柱后先用5L含20％乙醇的水溶液除杂，再用4L含40％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于80％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为86.1％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体7.7g，总收率为61.1％，HPLC检测其纯度为98.9％。

实施例3

取3.50Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加17L含70％乙醇的水溶液在70℃下浸泡提取2h后离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至4，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含15％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到2.5。

取预处理后的大孔吸附树脂NM PS100树脂(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上NM PS100。上柱后先用5L含30％乙醇的水溶液除杂，再用4L含45％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于80％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为87.2％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体8.2g，总收率为58.6％，HPLC检测其纯度为99.1％。

实施例4

取4.1Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加20L含50％乙醇的水溶液在80℃下浸泡提取2h后离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至3，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到2.5。

取预处理后的大孔吸附树脂NM PS100树脂(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上树脂柱。上柱后先用5L含20％乙醇的水溶液除杂，再用4L含45％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于80％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为86.8％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体9.4g，总收率为57.1％，HPLC检测其纯度为99.5％。

实施例5

取3.6Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加18L含60％乙醇的水溶液在80℃下浸泡提取2h后用高速离心机离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至3，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到3.5。

取预处理后的大孔吸附树脂NM PS100(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上树脂柱。上柱后先用5L含20％乙醇的水溶液除杂，再用4L含45％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于90％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为85.3％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体8.6g，总收率为59.7％，，HPLC检测其纯度为99.4％。

实施例6

取4.2Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加21L含80％乙醇的水溶液在60℃下浸泡提取2h后用高速离心机离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至3，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到3.0。

取预处理后的大孔吸附树脂NM PS100(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上树脂柱。上柱后先用5L含20％乙醇的水溶液除杂，再用4L含50％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于80％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为86.5％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体9.4g，总收率为55.8％，，HPLC检测其纯度为99.3％。

实施例7

取3.6Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加18L含80％乙醇的水溶液在60℃下浸泡提取2h后用高速离心机离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至3，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到3.0。

取预处理后的大孔吸附树脂NM PS100(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上树脂柱。上柱后先用5L含20％乙醇的水溶液除杂，再用4L含50％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于80％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为86.7％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体8.1g，总收率为56.0％，HPLC检测其纯度为98.9％。

实施例8

取4.5Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加22L含70％乙醇的水溶液在70℃下浸泡提取2h后用高速离心机离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至5，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到2.5。

取预处理后的大孔吸附树脂NM PS100(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上树脂柱。上柱后先用5L含25％乙醇的水溶液除杂，再用4L含45％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于90％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为85.2％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，待出现少量浑浊时加入5倍体积蒸馏水，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体10.6g，总收率为59.2％，HPLC检测其纯度为99.6％。

实施例9

取4.1Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加20L含50％乙醇的水溶液在80℃下浸泡提取2h后离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至3，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到2.5。

取预处理后的大孔吸附树脂NM PS100树脂(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上树脂柱。上柱后先用5L含20％乙醇的水溶液除杂，再用4L含45％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于90％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为85.3％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体9.5g，总收率为58.2％，HPLC检测其纯度为99.8％。

实施例10

取3.8Kg晒干银杏叶(GA含量约为0.4％)，水洗一次，加19L含70％乙醇的水溶液在60℃下浸泡提取2h后用高速离心机离心，取上清液，此操作重复两次，合并两次上清液，在35℃下旋蒸除去乙醇，得到银杏叶醇提物浓缩液。

用盐酸调节上述浓缩液的pH至3，等体积乙酸乙酯萃取两次，萃取后弃去萃余相，将萃取相中加入蒸馏水，振荡混合后弃去水相，并将酯相在30℃下旋蒸至乙酸乙酯完全除去；再用含10％乙醇的水溶液溶解GA粗品，并用盐酸将其pH调整到3.5。

取预处理后的大孔吸附树脂微球一号(其粒径为：50～100μm，孔径为树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯，上海华震树脂公司)(树脂预处理步骤：采用含1N盐酸的70％丙酮水溶液冲洗树脂，用量约为3BV，再用去离子水洗到中性)装于Φ80×350mm层析柱中，将GA粗品乙醇溶液上树脂柱。上柱后先用5L含20％乙醇的水溶液除杂，再用4L含50％乙醇将GA集中洗下，分步收集洗脱液，并通过HPLC检测，将GA纯度大于80％的洗脱液混合，树脂柱提取收率为85.2％。

将混合液在25℃条件下缓慢浓缩至溶液出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA粗晶体，抽滤，蒸馏水洗粗晶体一次，再用少量无水乙醇溶解后，加入5倍体积蒸馏水，待出现少量浑浊后，于4℃冰箱中静置过夜结晶，得到GA晶体8.4g，总收率为55.0％，HPLC检测其纯度为99.1％。

Claims (14)

1.一种银杏内酯A的制备方法，其特征在于包含下列步骤：将银杏叶粗提物用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离，即可；所述的大孔反相吸附树脂的参数如下：粒径为50～100μm，孔径为树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯；所述的柱层析分离的步骤如下：将银杏叶粗提物上柱后，先用体积浓度20％～30％的乙醇水溶液进行洗脱除杂，再用体积浓度40％～60％的乙醇水溶液进行洗脱，收集银杏内酯A的纯度大于80％的洗脱液，即可；所述的体积浓度20～30％的乙醇水溶液的用量为4～6个柱体积，体积浓度40％～60％的乙醇水溶液的用量为3～5个柱体积；在将银杏叶粗提物用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离之前，先将银杏叶粗提物溶于体积浓度10～15％的乙醇水溶液中，得银杏叶粗提物乙醇溶液，再上柱进行柱层析分离；所述的银杏叶粗提物乙醇溶液的pH值为2～4。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的孔径为

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的粒径为60～80μm。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的大孔反相吸附树脂为苏州纳微生物科技有限公司生产的大孔反相吸附脂，型号为NMPS100，其粒径为：50～100μm，孔径为树脂骨架为聚苯乙烯-二乙烯苯。

5.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述的大孔反相吸附树脂在使用前，先进行预处理，预处理的方法如下：用酸水溶液冲洗树脂，再用去离子水洗到中性，即可。

6.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述的银杏叶粗提物为醇提和/或酯溶剂萃取所得的粗提物。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的醇为乙醇，和/或，酯为乙酸乙酯。

8.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于：所述的银杏叶粗提物由下列方法制得：

(1)将银杏叶用乙醇水溶液浸泡提取后离心，取上清液；

(2)将步骤(1)所得物质用乙酸乙酯萃取。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的乙醇水溶液的体积浓度为40～80％；每次提取所用的乙醇水溶液与银杏叶的体积质量比为3～8L/Kg；所述的每次浸泡的时间为1～3小时；浸泡的温度为60～80℃；所述的浸泡提取以及离心的次数为1～3次。

10.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，得到上清液后，再进行浓缩除去乙醇，得浓缩液。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，在用乙酸乙酯萃取之前，先用无机酸调节步骤(1)所得的浓缩液的pH为2～6，其中无机酸为盐酸。

12.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，萃取的次数为1～3次；乙酸乙酯的用量为步骤(1)所得物质的1～3倍体积。

13.如权利要求1～4任一项所述的制备方法，其特征在于：在大孔反相吸附树脂柱层析分离结束后，还包含下列步骤：将柱层析分离所得物质进行本领域常规的结晶步骤，得银杏内酯A晶体，即可；所述的结晶包含下列步骤：

(1’)将柱层析分离所得的洗脱液在20～40℃下浓缩至出现浑浊后，于2～10℃条件下静置10～24小时，抽滤，得银杏内酯A粗晶体；

(2’)将步骤(1’)所得银杏内酯A粗晶体用蒸馏水洗涤后，加适量无水乙醇溶解，再缓慢加入3～5倍乙醇体积的蒸馏水，至出现浑浊后于2～10℃条件下静置10～24小时，得银杏内酯A晶体。

14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于：

步骤(2’)中，用蒸馏水洗涤时，每次洗涤蒸馏水的用量为3～5L/Kg固体；蒸馏水洗涤的次数为1次；

步骤(2’)中，无水乙醇的用量为将步骤(1’)所得固体刚刚溶解，即可；所加的蒸馏水的用量为3～5倍乙醇体积，在静置结晶后，可通过抽滤得到银杏内酯A晶体。