CN104655584A - 冬虫夏草中肌苷含量的近红外检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草中肌苷含量的近红外检测方法，主要包括下述步骤①采集冬虫夏草校正集样品原始光谱；②校正集样品原始光谱预处理；③主成分数的确定；④校正模型的建立；⑤模型的验证；⑥待测样品中肌苷含量测定；本发明的检测方法通过采集冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理，确定冬虫夏草中肌苷的主成分数，通过校正模型的建立及验证，再进行冬虫夏草中肌苷含量检测，具有检测速度快，成本低，检测结果准确的特点，对样品不会造成污染，可以回收利用，有利于环境保护与职业健康安全。

Description

冬虫夏草中肌苷含量的近红外检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药材的检测方法，具体是冬虫夏草中肌苷含量的近红外检测方法。

背景技术

冬虫夏草，是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。冬虫夏草有多种活性成分，其中最主要的是虫草酸、核苷类物质、氨基酸、虫草多糖。这些成分中以虫草酸和核苷类物质对冬虫夏草的要用价值影响最大。冬虫夏草中核苷类物质非常多，其中最主要的是虫草素、腺苷、肌苷、鸟苷、尿嘧啶等等。这些物质都对人体的生理调节有重要作用，有多种生物活性，而且对人体必需的核酸来说，核苷类物质是前体物质，对人体免疫力有促进作用。因此，对这些活性成分进行检测，是考核冬虫夏草质量和鉴别产地的一个有效手段。

查阅文献资料得知，冬虫夏草中肌苷含量的检测方法主要是采用高效液相色谱法，检测过程中用到有机试剂如甲醇，样品易污染，不易回收，同时对检测环境和操作人员造成不利影响，成本高而且检测时间较长。

本申请人于2013.11.12向中国专利局提交了《冬虫夏草中虫草酸含量的近红外检测方法》的发明专利申请，申请公布号：CN103558161A。由于冬虫夏草中的虫草酸没有紫外吸收以及虫草酸的化学结构的不同，因此，虫草酸含量的化学值的获得采用的是检测成本略高的液相色谱仪-蒸发光散射检测器。此方法并不适用于冬虫夏草中肌苷含量的检测。

发明内容

本发明根据冬虫夏草中所含的肌苷的物理化学性质，提出了一种冬虫夏草中肌苷含量的近红外检测方法；该方法解决了现有肌苷含量检测方法所存在的检测成本较高，检测时间较长，检测样品易污染且不能回收再利用等问题，具有检测速度快，成本低，检测结果准确等特点，对样品不会造成污染，可以回收利用，有利于环境保护与职业健康安全。

本发明的冬虫夏草中肌苷含量的近红外检测方法，由下述步骤组成：

①采集冬虫夏草校正集样品原始光谱

将若干份冬虫夏草样品分别干燥、粉碎得若干份冬虫夏草粉末，利用近红外光谱仪采集光谱，得到校正集样品原始光谱，将该校正集样品原始光谱的计算平均值存于计算机软件中；

②校正集样品原始光谱预处理

将步骤①所得到的冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理；

③主成分数的确定

将预处理后的校正集样品光谱中的信息数据变换到主成分数为2-10个互不相关的变量中，完成特征信息数据的提取；冬虫夏草中肌苷的主成分数为3；

④校正模型的建立

A.测定冬虫夏草各样品中肌苷含量的化学测定值

样品溶液制备 称取步骤①中的冬虫夏草粉末各0.1g至具塞锥形瓶中，精密称定，加入水25mL，称定重量，超声提取30min，称重，补足减失重量，以0.45μm滤膜过滤，取滤液作为样品溶液备用；

对照品溶液制备 精密称取6.64mg肌苷对照品于25mL容量瓶中，以50％甲醇溶解定容，摇匀，即得浓度为265.6mg/L的肌苷对照品溶液原液，分别精密量取对照品溶液原液各稀释625倍、200倍、100倍、25倍、20倍、10倍、5倍、2倍，以50％甲醇定容，加上对照品溶液原液，共得到浓度分别为0.423mg/L、1.328mg/L、2.656mg/L、10.824mg/L、13.280mg/L、26.560mg/L、53.120mg/L、132.800mg/L、265.600mg/L的对照品溶液。

建立标准曲线 肌苷的色谱分析采用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6*250mm，5μm，880975-914)，紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，柱温箱温度为30℃，进样量为10μL，乙腈与水为流动相进行梯度洗脱，流动相流速为1.0mL/min，分析时间为25min，洗脱条件见下表：

表1 流动相梯度洗脱条件

时间(分钟)	乙腈(％)	水(％)
			0	2	98
8	5	95
			15	15	85

在上述色谱条件下分析各对照品溶液，得到对应各浓度的肌苷色谱峰的峰面积，以浓度为横坐标，相对应的色谱峰面积为纵坐标建立标准曲线；

色谱分析 按上述建立标准曲线中所述的色谱条件进行各样品溶液的色谱分析，得到各样品中肌苷的峰面积，带入标准曲线中计算即得到各样品中肌苷的含量的化学测定值；

B.以上述各样品中肌苷的含量的化学测定值为校正值，将步骤③所得特征信息数据作为自变量，校正值作为因变量，用偏最小二乘法建立自变量与因变量之间的校正模型；

⑤模型的验证：取上述各已知肌苷含量的化学测定值的冬虫夏草粉末样品，重复步骤①-③后，利用已建立的校正模型得到各冬虫夏草粉末样品中肌苷含量的计算值，计算计算值与化学测定值的相关系数和方差，评价所建立校正模型的可靠性；

⑥待测样品中肌苷含量测定

取待测冬虫夏草样品，重复步骤①至步骤③，将步骤③所得特征信息数据输入步骤④所得校正模型中，即可得到待测冬虫夏草样品中的肌苷含量。

鉴于冬虫夏草中所含的肌苷在紫外波长260nm处有最大紫外吸收，紫外检测器的灵敏度高于蒸发光散射检测器，检测成本又较低，因此，本发明首选紫外检测器检测；又因为冬虫夏草中肌苷含量的近红外检测模型建立技术参数与虫草酸不同，结合冬虫夏草中肌苷在近红外波长处的响应情况与近红外检测技术进行了肌苷中近红外检测模型的建立(肌苷与虫草酸在近红外波段的相应情况不同)，本发明主要在于化学值获得方法与虫草酸检测方法不同。本发明的检测方法通过采集冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理，确定冬虫夏草中肌苷的主成分数，利用HPLC-UV检测结果，通过校正模型的建立及验证，再进行冬虫夏草中肌苷含量检测，具有检测速度快，成本低，检测结果准确的特点，对样品不会造成污染，可以回收利用，有利于环境保护与职业健康安全。

本发明中的实验数据采用TQ Analyst V7.2(Thermo Nicolet,USA)和The UnscramblerX 10.0.1软件进行处理和分析。

附图说明

图1是冬虫夏草校正集样品原始光谱图；

图2是肌苷标准曲线图；

图3是冬虫夏草校正集的化学测定值和计算值的关系散点图。

具体实施方式

实施例1

①采集冬虫夏草校正集样品原始光谱

收集市面上销售的冬虫夏草样品72份，将各样品分别于35℃下鼓风干燥3天后初磨至毫米级，再用南京南大球磨机粉碎至0.1μm级，得冬虫夏草粉末72份；在25℃下开启近红外光谱仪预热30分钟，各取0.5g冬虫夏草粉末于直径32mm，厚度15mm的旋转样品杯中，积分球漫反射方式采集光谱，光谱采集范围4000-10000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数32，增益2x；为了克服样品粒度差异引起的光谱漂移，减少误差，每个样品重复装样3次，得到校正集样品原始光谱，参见图1；将该校正集样品原始光谱的计算平均值存于计算机软件中；

②校正集样品原始光谱预处理

将步骤①所得到的冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理；

③主成分数的确定

将预处理后的校正集样品光谱中的信息数据变换到主成分数为2-10个互不相关的变量中，完成特征信息数据的提取；冬虫夏草中肌苷的主成分数为3；

④校正模型的建立

A.测定冬虫夏草各样品中肌苷含量的化学测定值

样品溶液制备 称取步骤①中的冬虫夏草粉末各0.1g至具塞锥形瓶中，精密称定，加入水25mL，称定重量，超声提取30min，称重，补足减失重量，以0.45μm滤膜过滤，取滤液作为样品溶液备用；

对照品溶液制备 精密称取6.64mg肌苷对照品于25mL容量瓶中，以50％甲醇溶解定容，摇匀，即得浓度为265.6mg/L的肌苷对照品溶液原液，分别精密量取对照品原液各稀释625倍、200倍、100倍、25倍、20倍、10倍、5倍、2倍，以50％甲醇定容，加上对照品溶液原液，得到浓度分别为(I)0.423mg/L、(II)1.328mg/L、(III)2.656mg/L、(IV)10.824mg/L、(V)13.280mg/L、(Ⅵ)26.560mg/L、(Ⅶ)53.120mg/L、(Ⅷ)132.800mg/L、(Ⅸ)265.600mg/L的9份对照品溶液；

建立标准曲线 肌苷的色谱分析采用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱(4.6*250mm，5μm，880975-914)，紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，柱温箱温度为30℃，进样量为10μL，乙腈与水为流动相进行梯度洗脱，流动相流速为1.0mL/min，分析时间为25min，洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

时间(分钟)	乙腈(％)	水(％)
			0	2	98
8	5	95
			15	15	85

在上述色谱条件下分析各对照品溶液，得到对应的各浓度的肌苷色谱峰的峰面积，以浓度为横坐标，相对应的色谱峰面积为纵坐标建立标准曲线；标准曲线图如图2中所示。相关数据如表2中所示：

表2 肌苷标准曲线建立相关数据

色谱分析 按建立标准曲线步骤中所述的色谱条件进行各样品溶液的色谱分析，分别得到各样品中肌苷的峰面积，带入标准曲线中计算得到各样品中肌苷的含量的化学测定值。

B.以上述各样品中肌苷含量的化学测定值为校正值，将步骤③所得特征信息数据作为自变量，校正值作为因变量，用偏最小二乘法建立自变量与因变量之间的校正模型(即肌苷含量与近红外光谱特征信息数据之间的映射关系)；

⑤模型的验证：取上述已知肌苷含量的化学测定值的各冬虫夏草粉末样品，重复步骤①-③后，利用已建立的校正模型得到各冬虫夏草粉末样品中肌苷含量的计算值，计算计算值与化学测定值的相关系数(Corr，Coeff)和方差(RMSEC)，评价所建立校正模型的可靠性；验证相关曲线即冬虫夏草校正集化学测定值和计算值的关系散点图参见图3；

⑥待测样品中肌苷含量测定

取待测冬虫夏草样品，重复步骤①至步骤③，将步骤③所得特征信息数据输入步骤④所得校正模型中，即可得到待测冬虫夏草样品中的肌苷含量。冬虫夏草样品中肌苷含量的计算值与化学测定值见表1，并对其计算值与化学测定值进行配对t-检验，所得结果见表4，表明两者差异均不显著(P>0.05)，可见测定结果准确，达到了本发明的目的。

表3 肌苷含量的计算值与化学测定值的比较

表4 肌苷计算值与化学测定值的t检验

名称	相关系数	t值	显著性
				肌苷	0.954	0.22	0.83

Claims (1)

1.冬虫夏草中肌苷含量的近红外检测方法，其特征在于由下述步骤组成：  

①采集冬虫夏草校正集样品原始光谱

    将若干冬虫夏草样品分别干燥、粉碎得若干冬虫夏草粉末，利用近红外光谱仪采集光谱，得到校正集样品原始光谱，将该校正集样品原始光谱的计算平均值存于计算机软件中；

②校正集样品原始光谱预处理

   将步骤①所得到的冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理；

③主成分数的确定

   将预处理后的校正集样品光谱中的信息数据变换到主成分数为2-10个互不相关的变量中，完成特征信息数据的提取；冬虫夏草中肌苷的主成分数为3；

④校正模型的建立

    A.测定冬虫夏草样品中肌苷含量的化学测定值

样品溶液制备  称取步骤①中的冬虫夏草粉末各0.1g至具塞锥形瓶中，精密称定，加入水25mL，称定重量，超声提取30min，称重，补足减失重量，以0.45μm滤膜过滤，取滤液作为样品溶液备用；

对照品溶液制备  精密称取6.64mg肌苷对照品于25mL容量瓶中，以50%甲醇溶解定容，摇匀，即得浓度为265.6mg/L的肌苷对照品溶液原液，分别精密量取对照品溶液原液各稀释625倍、200倍、100倍、25倍、20倍、10倍、5倍、2倍，以50%甲醇定容，加上对照品溶液原液，共得到浓度分别为0.423mg/L、1.328 mg/L、2.656mg/L、10.824mg/L、13.280 mg/L、26.560mg/L、53.120 mg/L、132.800 mg/L 、265.600 mg/L的对照品溶液；

建立标准曲线   肌苷的色谱分析采用Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6*250mm，5μm，880975-914），紫外检测器进行检测，检测波长为260nm，柱温箱温度为30℃，进样量为10μL，乙腈与水为流动相进行梯度洗脱，流动相流速为1.0mL/min，分析时间为25min，洗脱条件见下表：

表1  流动相梯度洗脱条件

在上述色谱条件下分析各对照品溶液，得到对应各浓度的肌苷色谱峰的峰面积，以浓度为横坐标，相对应的色谱峰面积为纵坐标建立标准曲线；

色谱分析   按上述建立标准曲线中所述的色谱条件进行各样品溶液的色谱分析，得到各样品中肌苷的峰面积，带入标准曲线中计算即得到各样品中肌苷的含量的化学测定值；

B. 以上述各样品中肌苷的含量的化学测定值为校正值，将步骤③所得特征信息数据作为自变量，校正值作为因变量，用偏最小二乘法建立自变量与因变量之间的校正模型；

⑤模型的验证：取上述各已知肌苷含量的化学测定值的冬虫夏草粉末样品，重复步骤①-③后，利用已建立的校正模型得到各冬虫夏草粉末样品中肌苷含量的计算值，计算计算值与化学测定值的相关系数和方差，评价所建立校正模型的可靠性；               

⑥待测样品中肌苷含量测定

    取待测冬虫夏草样品，重复步骤①至步骤③，将步骤③所得特征信息数据输入步骤④所得校正模型中，即可得到待测冬虫夏草样品中的肌苷含量。