CN103558161A - 冬虫夏草中虫草酸含量的近红外检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草中虫草酸含量的近红外检测方法，主要包括下述步骤①采集冬虫夏草校正集样品原始光谱；②校正集样品原始光谱预处理；③主成分数的确定；④校正模型的建立；⑤模型的验证；⑥待测样品中虫草酸含量测定；本发明的检测方法通过采集冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理，确定冬虫夏草中虫草酸的主成分数，通过校正模型的建立及验证，再进行冬虫夏草中虫草酸含量检测，具有检测速度快，成本低，检测结果准确的特点，对样品不会造成污染，可以回收利用，有利于环境保护与职业健康安全。

Description

冬虫夏草中虫草酸含量的近红外检测方法
技术领域
本发明涉及一种中药材的检测方法，具体是冬虫夏草中虫草酸含量的近红外（NIR）检测方法。
背景技术
冬虫夏草，是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。药理学现代研究结果中，青海冬虫夏草含有虫草酸约7%，糖类28.9%，脂肪约8.4%，蛋白质约25%。冬虫夏草中82.2%为不饱和脂肪酸，此外，尚含有维生素B12、麦角脂醇、六碳糖醇、多种生物碱等。
据文献资料报道：北冬虫夏草中虫草酸的含量为3.09克，野生的虫草为5.54克，虫草酸是一种D-甘露醇，甘露醇能提高血浆渗透压，导致组织内的水分进入血管内，从而减轻组织水肿，补充血浆。虫草酸多用于脑水肿，防治急性肾功能衰竭，有调节心、脑、血管的作用，促进人体的新陈代谢、改善人体的微循环、降血脂、降血压。因此，虫草酸含量的高低也是判断冬虫夏草质量的重要指标之一。
查阅文献资料得知：冬虫夏草中虫草酸含量的检测方法主要是采用传统的显色方法或者测定吸光度的方法，这样会由于杂质的干扰而影响检测结果的准确性。
发明内容
本发明的目的就是为了解决现有虫草酸含量检测方法由于杂质干扰导致检测结果准确度较低、检测时间较长，检测样品易污染且不能回收再利用等问题，提供一种冬虫夏草中虫草酸含量的近红外检测方法；该方法通过采集冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用化学计量学软件进行光谱预处理，确定冬虫夏草中虫草酸的主成分数，利用HPLC-ELSD检测结果，通过校正模型的建立及验证，再进行冬虫夏草中虫草酸含量检测，具有检测速度快，成本低，检测结果准确的特点，对样品不会造成污染，可以回收利用，有利于环境保护与职业健康安全。
本发明的冬虫夏草中虫草酸含量的近红外检测方法，由下述步骤组成：
①采集冬虫夏草校正集样品原始光谱
收集市面上销售的冬虫夏草样品，将样品35℃下鼓风干燥3天后初磨至毫米级，再用南京南大球磨机粉碎至0.1μm级，得冬虫夏草粉末；在25℃下开启近红外光谱仪预热30分钟，取0.5g冬虫夏草粉末于直径32mm，厚度15mm的旋转样品杯中，积分球漫反射方式采集光谱，光谱采集范围4000-10000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数32，增益2x；为了克服样品粒度差异引起的光谱漂移，减少误差，每个样品重复装样3次，得到校正集样品原始光谱，将该校正集样品原始光谱的计算平均值存于计算机软件中；
②校正集样品原始光谱预处理
将步骤①所得到的冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理；
③主成分数的确定
将预处理后的校正集样品光谱中的信息数据变换到主成分数为2-10个互不相关的变量中，完成特征信息数据的提取；冬虫夏草中虫草酸的主成分数为5；
④校正模型的建立
A.冬虫夏草样品中虫草酸含量的化学测定值
供试品溶液制备称取步骤①中的冬虫夏草粉末0.1g至具塞锥形瓶中，精密称定，加入水25mL，称定重量，超声提取30min，称重，补足减失重量，以0.45μm滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液备用；
对照品溶液制备精密称取55.51mg虫草酸对照品于50mL容量瓶中，以水溶解定容，摇匀，即得浓度为1093.547mg/L的虫草酸对照品溶液原液，再分别精密量取对照品原液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得到浓度分别为54.67735mg/L、109.3547mg/L、218.7094mg/L、437.4188mg/L、656.1282mg/L的对照品溶液；
建立标准曲线虫草酸的色谱分析采用氨基色谱柱，流动相为乙腈-水，体积比为83:17，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，柱温：30℃，蒸发光散射检测器进行检测，漂移管温度为100℃，雾化气体流速为2.5L/min；在上述色谱条件下进行对照品溶液的色谱分析，得到各浓度对照品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积，以浓度的对数为横坐标，相对应的色谱峰面积的对数为纵坐标建立标准曲线；
供试品溶液的色谱分析按上述建立标准曲线中所述的色谱条件进行供试品溶液的色谱分析，得到供试品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积，带入标准曲线中计算即得到供试品溶液中虫草酸的含量的化学测定值；
B.以A步骤中冬虫夏草虫草酸含量的化学测定值为校正值，将步骤③所得特征信息数据作为自变量，校正值作为因变量，用偏最小二乘法建立自变量与因变量之间的校正模型；
⑤模型的验证
取步骤①已知虫草酸含量的冬虫夏草样品，重复步骤①-③后，利用步骤④校正模型得到已知虫草酸含量的冬虫夏草样品中虫草酸含量的计算值，计算计算值与实际值的相关系数和方差，评价步骤④所得校正模型的可靠性;
⑥待测样品中虫草酸含量测定
取待测冬虫夏草样品，重复步骤①至步骤③，将步骤③所得特征信息数据输入步骤④所得校正模型中，即可得到待测冬虫夏草样品中的虫草酸含量。
本发明的检测方法通过采集冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理，确定冬虫夏草中虫草酸的主成分数，利用HPLC-ELSD检测结果，通过校正模型的建立及验证，再进行冬虫夏草中虫草酸含量检测，具有检测速度快，成本低，检测结果准确的特点，对样品不会造成污染，可以回收利用，有利于环境保护与职业健康安全。
本发明中的实验数据采用TQ Analyst V7.2(Thermo Nicolet,USA)和The Unscrambler X 10.0.1软件进行处理和分析。
附图说明
图1是冬虫夏草校正集样品原始光谱图；
图2是虫草酸标准曲线图；
图3是冬虫夏草校正集的实际值和计算值的关系散点图。
具体实施方式
实施例1
①采集冬虫夏草校正集样品原始光谱
收集市面上销售的冬虫夏草样品，将样品35℃下鼓风干燥3天后初磨至毫米级，再用南京南大球磨机粉碎至0.1μm级，得冬虫夏草粉末；在25℃下开启近红外光谱仪预热30分钟，取0.5g冬虫夏草粉末于直径32mm，厚度15mm的旋转样品杯中，积分球漫反射方式采集光谱，光谱采集范围4000-10000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数32，增益2x；为了克服样品粒度差异引起的光谱漂移，减少误差，每个样品重复装样3次，得到校正集样品原始光谱，参见图1；将该校正集样品原始光谱的计算平均值存于计算机软件中；
②校正集样品原始光谱预处理
将步骤①所得到的冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理；
③主成分数的确定
将预处理后的校正集样品光谱中的信息数据变换到主成分数为2-10个互不相关的变量中，完成特征信息数据的提取；冬虫夏草中虫草酸的主成分数为5；
④校正模型的建立
A.冬虫夏草样品中虫草酸含量的化学测定值
供试品溶液制备称取步骤①中的冬虫夏草粉末0.1g至具塞锥形瓶中，精密称定，加入水25mL，称定重量，超声提取30min，称重，补足减失重量，以0.45μm滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液备用；
对照品溶液制备精密称取55.51mg虫草酸对照品于50mL容量瓶中，以水溶解定容，摇匀，即得浓度为1093.547mg/L的虫草酸对照品溶液原液，再分别精密量取对照品原液0.5mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得到浓度分别为（I）54.67735mg/L（II）109.3547mg/L（III）218.7094mg/L（IV）437.4188mg/L（V）656.1282mg/L的五份对照品溶液；
建立标准曲线虫草酸的色谱分析采用氨基色谱柱，流动相为乙腈-水，体积比为83:17，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，柱温：30℃，蒸发光散射检测器进行检测，漂移管温度为100℃，雾化气体流速为2.5L/min；在上述色谱条件下分别对上述五份对照品溶液进行色谱分析，得到各浓度对照品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积，以浓度的对数为横坐标，相对应的色谱峰面积的对数为纵坐标建立标准曲线；标准曲线图如图2中所示。相关数据如表1中所示：
表1虫草酸标准曲线建立相关数据
序号 （I） （II） （III） （IV） （V）
浓度，mg/L 54.67735 109.3547 218.7094 437.4188 656.1282
峰面积 1319673 2780532 5840334 12146622 19625960
供试品溶液的色谱分析按建立标准曲线步骤中所述的色谱条件进行供试品溶液的色谱分析，对采集的69个冬虫夏草样品进行色谱分析，分别得到各样品中虫草酸色谱峰的峰面积，带入标准曲线中计算得到各样品中虫草酸的含量的化学值；
B.以A步骤中冬虫夏草虫草酸含量的化学测定值为校正值，将步骤③所得特征信息数据作为自变量，校正值作为因变量，用偏最小二乘法建立自变量与因变量之间的校正模型（即虫草酸含量与近红外光谱特征信息数据之间的映射关系）；
⑤模型的验证：取步骤①已知虫草酸含量的冬虫夏草样品，重复步骤①-③后，利用步骤④校正模型得到已知虫草酸含量的冬虫夏草样品中虫草酸含量的计算值，计算计算值与实际值的相关系数（Corr，Coeff）和方差（RMSEC），评价步骤④所得校正模型的可靠性；验证相关曲线即冬虫夏草校正集实际值和计算值的关系散点图参见图3；
⑥待测样品中虫草酸含量测定
取待测冬虫夏草样品，重复步骤①至步骤③，将步骤③所得特征信息数据输入步骤④所得校正模型中，即可得到待测冬虫夏草样品中的虫草酸含量。冬虫夏草样品中虫草酸含量的模型预测值与化学测定值见表2，并对其预测值与化学测定值进行配对t-检验，所得结果见表3，表明两者差异均不显著（P>0.05），可见测定结果准确。
表2虫草酸含量的模型预测值与化学测定值的比较
测定值,% 预测值,% 绝对误差,% 相对误差,%
1 13.18 12.00 -1.17 -9.30
2 12.20 12.46 0.26 2.10
3 7.33 7.22 -0.11 -1.51
4 12.43 13.01 0.58 4.53
5 10.54 10.79 0.25 2.38
6 8.05 8.31 0.25 3.10
7 10.26 10.01 -0.25 -2.42
8 9.41 9.46 0.05 0.58
9 7.96 8.83 0.87 10.36
10 9.76 10.42 0.65 6.46
11 8.52 9.04 0.52 5.96
12 7.74 8.74 1.00 12.10
13 9.49 9.65 0.17 1.73
14 10.56 10.30 -0.26 -2.53
15 11.11 11.12 0.00 0.03
16 13.74 12.39 -1.35 -10.35
17 10.06 9.97 -0.09 -0.86
18 7.19 8.34 1.16 14.90
19 7.35 7.73 0.39 5.16
20 7.27 7.31 0.04 0.53
21 7.26 6.76 -0.50 -7.17
22 8.63 8.35 -0.28 -3.30
23 9.09 9.07 -0.02 -0.26
24 8.07 8.81 0.74 8.74
25 10.55 10.57 0.02 0.17
26 12.04 12.78 0.74 5.98
27 11.11 10.95 -0.16 -1.45
28 8.92 8.52 -0.40 -4.62
29 8.88 8.65 -0.23 -2.68
30 10.06 10.01 -0.05 -0.51
31 9.30 9.47 0.16 1.76
32 10.15 10.20 0.05 0.45
33 9.09 8.65 -0.44 -4.96
34 7.82 7.25 -0.58 -7.67
35 7.92 8.06 0.14 1.74
36 7.40 7.33 -0.07 -0.95
37 5.98 5.71 -0.27 -4.60
38 6.85 7.09 0.24 3.51
39 10.98 11.32 0.34 3.05
40 9.36 9.60 0.23 2.47
41 9.02 8.75 -0.26 -2.98
42 9.46 9.05 -0.40 -4.36
43 9.23 9.76 0.53 5.57
44 11.36 10.46 -0.90 -8.25
45 11.18 10.74 -0.45 -4.09
46 9.53 9.10 -0.43 -4.59
47 9.36 9.35 -0.01 -0.09
48 8.92 9.39 0.47 5.09
49 8.44 8.47 0.02 0.29
50 9.68 10.11 0.43 4.33
51 10.12 10.65 0.53 5.13
52 9.33 10.05 0.72 7.44
53 9.38 9.61 0.23 2.43
54 8.02 8.34 0.32 3.94
55 8.10 8.37 0.27 3.23
56 10.80 10.19 -0.61 -5.84
57 8.27 8.92 0.65 7.57
58 10.68 10.19 -0.49 -4.70
59 11.37 10.48 -0.89 -8.14
60 11.68 10.90 -0.77 -6.86
61 8.30 9.20 0.90 10.30
62 10.82 10.95 0.13 1.22
63 11.81 10.90 -0.91 -7.97
64 10.78 10.24 -0.54 -5.10
65 10.90 10.74 -0.17 -1.53
66 10.62 9.98 -0.65 -6.27
67 11.33 11.50 0.17 1.52
68 8.55 10.02 1.47 15.80
69 8.92 10.08 1.15 12.13
表3虫草酸预测值与测定值的t检验
名称 相关系数 t值 显著性
虫草酸 0.954 1.04 0.32

Claims (1)

1.冬虫夏草中虫草酸含量的近红外检测方法，其特征在于由下述步骤组成：  
①采集冬虫夏草校正集样品原始光谱
    收集市面上销售的冬虫夏草样品，将样品35℃下鼓风干燥3天后初磨至毫米级，再用南京南大球磨机粉碎至0.1μm级，得冬虫夏草粉末；在25℃下开启近红外光谱仪预热30分钟，取0.5g冬虫夏草粉末于直径32mm，厚度15mm的旋转样品杯中，积分球漫反射方式采集光谱，光谱采集范围4000-10000cm-1，分辨率8cm-1，扫描次数32，增益2x；为了克服样品粒度差异引起的光谱漂移，减少误差，每个样品重复装样3次，得到校正集样品原始光谱，将该校正集样品原始光谱的计算平均值存于计算机软件中；
②校正集样品原始光谱预处理
     将步骤①所得到的冬虫夏草校正集样品原始光谱，采用多元散射校正、二阶导、Savitzky-Golay平滑进行光谱预处理；
③主成分数的确定
    将预处理后的校正集样品光谱中的信息数据变换到主成分数为2-10个互不相关的变量中，完成特征信息数据的提取；冬虫夏草中虫草酸的主成分数为5；
④校正模型的建立
      A.冬虫夏草样品中虫草酸含量的化学测定值
供试品溶液制备  称取步骤①中的冬虫夏草粉末0.1g至具塞锥形瓶中，精密称定，加入水25mL，称定重量，超声提取30min，称重，补足减失重量，以0.45μm滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液备用；
对照品溶液制备   精密称取55.51mg虫草酸对照品于50mL容量瓶中，以水溶解定容，摇匀，即得浓度为1093.547mg/L的虫草酸对照品溶液原液，再分别精密量取对照品原液0.5mL、1.0mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得到浓度分别为54.67735mg/L、109.3547 mg/L、218.7094 mg/L、437.4188 mg/L、656.1282 mg/L的对照品溶液；
建立标准曲线   虫草酸的色谱分析采用氨基色谱柱，流动相为乙腈-水，体积比为83:17，流速1.0mL/min，进样体积：10μL，柱温：30℃，蒸发光散射检测器进行检测，漂移管温度为100℃，雾化气体流速为2.5L/min；在上述色谱条件下进行对照品溶液的色谱分析，得到各浓度对照品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积，以浓度的对数为横坐标，相对应的色谱峰面积的对数为纵坐标建立标准曲线；
供试品溶液的色谱分析   按上述建立标准曲线中所述的色谱条件进行供试品溶液的色谱分析，得到供试品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积，带入标准曲线中计算即得到供试品溶液中虫草酸的含量的化学测定值；
B. 以A步骤中冬虫夏草虫草酸含量的化学测定值为校正值，将步骤③所得特征信息数据作为自变量，校正值作为因变量，用偏最小二乘法建立自变量与因变量之间的校正模型；
⑤模型的验证
取步骤①已知虫草酸含量的冬虫夏草样品，重复步骤①-③后，利用步骤④校正模型得到已知虫草酸含量的冬虫夏草样品中虫草酸含量的计算值，计算计算值与实际值的相关系数和方差，评价步骤④所得校正模型的可靠性;
⑥待测样品中虫草酸含量测定
取待测冬虫夏草样品，重复步骤①至步骤③，将步骤③所得特征信息数据输入步骤④所得校正模型中，即可得到待测冬虫夏草样品中的虫草酸含量。
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