CN110658157A - 近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，步骤如下：步骤S1，采用传统的方法检测总多糖标准含量；步骤S2，测定所述发酵虫草菌粉原始样品的平均光谱值为发酵虫草菌粉原始光谱；步骤S3，采用TQ Analyst软件分析所述发酵虫草菌粉原始光谱，将步骤S1与步骤S2结合得到定量分析模型；步骤S4，对发酵虫草菌粉待测样品进行近红外光谱扫描得到近红外扫描图谱；步骤S5，将近红外扫描图谱输入TQ Analyst软件进行分析，利用步骤S3得到的所述定量分析模型计算获得所述发酵虫草菌粉待测样品的总多糖含量。与相关技术相比，本发明提供的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，快速、操作简单且不破坏样品。
Description
【技术领域】
本发明涉及产品生产过程检测技术领域，具体涉及一种近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法。
【背景技术】
发酵虫草菌粉是药用菌株经液体深层发酵及加工制成，具有养肺阴，补肾阳的功效。研究证明发酵虫草菌粉类产品化学成分与冬虫夏草相似，主要有核苷类、甾醇类、多糖及氨基酸等主要成分，可作为冬虫夏草的可持续替代品。其中多糖作为活性成分之一，有保肝，降压，促进免疫，抗高血糖、高血脂、抗氧化，抗缺氧，抗肿瘤，抗肝纤维化，促进胆固醇逆向转运等作用，但在发酵虫草菌粉产品金水宝胶囊质量标准项下仅有腺苷及麦角甾醇，未将多糖列入其中，因此多糖的质量控制成为了一大难题。
同时，多糖的化学含量测定方法主要为PMP衍生化-高效液相色谱法、苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等等，化学测量方法具有繁琐的前处理步骤、使用较多的有机试剂且损害样品，不能满足现代快速分析、高效质量控制的需求。
因此，针对现有技术的多糖检测方法步骤繁琐且容易损害样品，不能满足快速分析、高效质量控制的缺陷，有必要提供一种新的可以随时监控多糖含量，且能够反馈调节发酵生产工艺的发酵虫草菌粉生产全过程总多糖的质量控制方法来解决上述问题。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的多糖检测方法步骤繁琐且容易损害样品，不能满足快速分析、高效质量控制的缺陷，本发明提供了一种可以随时监控多糖含量，且能够反馈调节发酵生产工艺的发酵虫草菌粉生产全过程总多糖质量控制方法。
一种近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，包括如下步骤：
步骤S1，采用传统的方法检测发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量；
步骤S2，提供多个操作单元发酵虫草菌粉原始样品，分别获取每个所述发酵虫草菌粉原始样品的光谱值，并取每个所述发酵虫草菌粉原始样品的平均光谱值为发酵虫草菌粉原始光谱；
步骤S3，采用TQ Analyst软件分析所述发酵虫草菌粉原始光谱，将所述步骤S1得到的发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量与所述步骤S2得到的发酵虫草菌粉原始光谱相关联，得到一个发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量与发酵虫草菌粉原始光谱相关联的定量分析模型；
步骤S4，提供发酵虫草菌粉待测样品，对所述发酵虫草菌粉待测样品进行近红外光谱扫描，得到所述发酵虫草菌粉待测样品的近红外扫描图谱；
步骤S5，将得到的近红外扫描图谱输入TQ Analyst软件进行分析，利用步骤S3得到的所述定量分析模型计算获得所述发酵虫草菌粉待测样品的总多糖含量。
优选的，所述步骤S1采用苯酚-硫酸法测定发酵虫草菌粉生产全过程中的总多糖标准含量。
优选的，所述步骤S1包括如下子步骤：
步骤S11，多糖的提取，精密称取2g虫草菌粉，置于圆底烧瓶中，加入30ml双蒸水，100℃加热回流2次，每次1h，趁热过滤，合并滤液，4000r·min-1离心15min除去沉淀，按照体积比1:5浓缩上清液，往浓缩后上清液中加入3倍体积的无水乙醇，置于4℃冰箱醇析12h，将醇析后的多糖溶液4000r·min-1离心15min后取沉淀，将沉淀溶于15ml双蒸水中，加入等体积Sevage试剂萃取3次，取上清液8000r·min-1离心15min，留取上清液，加入3倍体积的95％乙醇，8000r·min-1离心15min后取沉淀，溶于适量双蒸水，冷冻干燥得到发酵虫草菌粉多糖提取物；
步骤S12，供试品溶液的制备，精密称取2mg所述发酵虫草菌粉多糖提取物置于2ml的容量瓶中，加双蒸水溶解并定容至刻度线得到发酵虫草菌粉溶液，然后精密称取1ml所述发酵虫草菌粉溶液置于25ml的容量瓶中，加入双蒸水溶解并稀释至刻度线，得到供试品溶液；
步骤S13，全波长扫描，分别精密量取2ml葡萄糖溶液与2ml供试品溶液于25ml的具塞试管中，加入4％的苯酚溶液0.7ml，再缓缓加入5ml的浓硫酸，置于沸水浴中20min后取出并放置室温，同时取2ml水作为空白进行显色，作为参比，在200～800之间扫描样品；
步骤S14，葡萄糖标准曲线的建立，精密称取葡萄糖5mg置于10ml容量瓶中，加入溶解并定至刻度线得到葡萄糖母液，分别精密吸取0.4ml、0.45ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、1.4ml的所述葡萄糖母液至10ml容量瓶中，分别加入双蒸水稀释至刻度线，得到不同浓度的葡萄糖对照品溶液，精密移取系列浓度的所述葡萄糖对照品溶液2ml至25ml具塞玻璃试管中，在步骤S13的条件下显色后，在波长489nm处测定吸光度，以吸光度对应浓度做工作曲线；
步骤S15，将步骤S12制备的所述供试品溶液在步骤S13的条件下显色后，在波长489nm处测定吸光度，并代入所述工作曲线中计算得到发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量。
优选的，步骤S1还包括步骤S16：将步骤S15得到的不同批次、不同过程的发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量按照从大到小的顺序排列，并在确保校正集含量包含验证集含量的条件下按照5:1的比例选取校正集与验证集。
优选的，步骤S3中，利用步骤S16得到的验证集作为外部数据对所述定量分析模型进行验证，将所述验证集经苯酚-硫酸法测量得出的多糖含量真实值与所述定量分析模型的预测值进行比较，计算模型误差率，验证所述定量分析模型的准确性。
优选的，步骤S2中，采用积分球模式采集发酵虫草菌粉原始样品的光谱，采集过程为：波数范围为4000-12500cm-1，扫描64次，分辨率为8cm-1，采集空气信号作为背景，试验过程中自动扣除背景，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱。
优选的，步骤S3中，所述定量分析模型的确定包括如下过程：建立偏最小二乘回归法定量分析模型，对比分析多元散射校正结合原始光谱、一阶导数、二阶导数及Savitzky-Golay平滑处理光谱的结果，以校正集均方差、验证集均方差和校正集相关系数、验证集相关系数为指标，筛选出最佳的定量分析模型。
优选的，步骤S3中，所述定量分析模型的波数区间为10526.3-8333.33cm-1、9903.9-6521.88cm-1或6667.11-4545.45cm-1。
与相关技术相比，本发明的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，采用近红外光谱作为过程分析技术之一，具有快速、无损、成本低的特点，与现代质量控制需求相符；同时，采用较为简单的苯酚-硫酸法测定发酵虫草菌粉生产全过程中的总多糖标准含量，基于发酵虫草菌粉生产的各个操作单元(菌种培养、菌种传代、菌种发酵、菌种滤过、菌种干燥、菌种粉碎、菌种混合)，从源头开始控制总多糖质量，确保发酵虫草菌粉生产过程产品质量稳定可控；此外，因发酵条件对多糖的活性有极大的影响，故而随时监控多糖含量，反馈调节发酵生产工艺是极为必要，近红外光谱具有准确快速的特点，将近红外光谱结合偏最小二乘回归法建立全过程链总多糖定量分析模型，为生产多糖活性最大化的发酵虫草菌粉提供了一个初步依据。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1为本发明提供的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法的流程示意图；
图2为本发明提供的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法的步骤17得到的葡萄糖标准工作曲线图；
图3为本发明提供的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法的步骤18中不同批次全过程发酵虫草菌粉多糖提取物的平均含量图；
图4为本发明提供的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法的发酵虫草菌粉原始光谱图；
图5为本发明提供的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法的发酵虫草菌粉总多糖定量模型实际值与计算值关系值散点图。
【具体实施方式】
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供了一种利用近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，具体包括如下步骤：
步骤S1，采用传统的方法检测发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量；
其中，所述传统的方法可以为苯酚-硫酸法、PMP-高效液相色谱法及蒽酮-硫酸法等，在本实施方式中采用苯酚-硫酸法测定发酵虫草菌粉生产全过程中的总多糖标准含量。
具体的，所述步骤S1包括如下子步骤：
步骤S11，多糖的提取，精密称取2g虫草菌粉，置于圆底烧瓶中，加入30ml双蒸水，100℃加热回流2次，每次1h，趁热过滤，合并滤液，4000r·min-1离心15min除去沉淀，按照体积比1:5浓缩上清液，往浓缩后上清液中加入3倍体积的无水乙醇，置于4℃冰箱醇析12h，将醇析后的多糖溶液4000r·min-1离心15min后取沉淀，将沉淀溶于15ml双蒸水中，加入等体积Sevage试剂萃取3次，取上清液8000r·min-1离心15min，留取上清液，加入3倍体积的95％乙醇，8000r·min-1离心15min后取沉淀，溶于适量双蒸水，冷冻干燥得到发酵虫草菌粉多糖提取物；
其中，所述Sevage试剂中的三氯甲烷与正丁醇的比值为4:1。
步骤S12，供试品溶液的制备，精密称取2mg所述发酵虫草菌粉多糖提取物置于2ml的容量瓶中，加双蒸水溶解并定容至刻度线得到发酵虫草菌粉溶液，然后精密称取1ml所述发酵虫草菌粉溶液置于25ml的容量瓶中，加入双蒸水溶解并稀释至刻度线，得到供试品溶液；
步骤S13，全波长扫描，分别精密量取2ml葡萄糖溶液与2ml供试品溶液于25ml的具塞试管中，加入4％的苯酚溶液0.7ml，再缓缓加入5ml的浓硫酸，置于沸水浴中20min后取出并放置室温，同时取2ml水作为空白进行显色，作为参比，在200～800之间扫描样品；
步骤S14，请参阅图2，葡萄糖标准曲线的建立，精密称取葡萄糖5mg置于10ml容量瓶中，加入溶解并定至刻度线得到葡萄糖母液，分别精密吸取0.4ml、0.45ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、1.4ml的所述葡萄糖母液至10ml容量瓶中，分别加入双蒸水稀释至刻度线，得到不同浓度的葡萄糖对照品溶液，精密移取系列浓度的所述葡萄糖对照品溶液2ml至25ml具塞玻璃试管中，在步骤S13的条件下显色后，在波长489nm处测定吸光度，以吸光度对应浓度做工作曲线；
步骤S15，请参阅图3，将步骤S12制备的所述供试品溶液在步骤S13的条件下显色后，在波长489nm处测定吸光度，并代入所述工作曲线中计算得到发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量；
步骤S16，将步骤S15得到的不同批次、不同过程的发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量按照从大到小的顺序排列，并在确保校正集含量包含验证集含量的条件下按照5:1的比例选取校正集与验证集。
步骤S2，请参阅图4，提供多个操作单元发酵虫草菌粉原始样品，分别获取每个所述发酵虫草菌粉原始样品的光谱值，并取每个所述发酵虫草菌粉原始样品的平均光谱值为发酵虫草菌粉原始光谱；
具体的，在步骤S2中，采用积分球模式采集发酵虫草菌粉原始样品的光谱，其采集过程为：波数范围为4000-12500cm-1，扫描64次，分辨率为8cm-1，采集空气信号作为背景，试验过程中自动扣除背景，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱。
步骤S3，采用TQ Analyst软件分析所述发酵虫草菌粉原始光谱，将所述步骤S1得到的发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量与所述步骤S2得到的发酵虫草菌粉原始光谱相关联，得到一个发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量与发酵虫草菌粉原始光谱相关联的定量分析模型；
优选的，所述定量分析模型的波数区间为10526.3-8333.33cm-1、9903.9-6521.88cm-1或6667.11-4545.45cm-1。
具体的，请同时参阅图5，在得到所述定量分析模型后，利用步骤S16得到的验证集作为外部数据对所述定量分析模型进行验证，将所述验证集经苯酚-硫酸法测量得出的多糖含量真实值与所述定量分析模型的预测值进行比较，计算模型误差率，验证所述定量分析模型的准确性。结果见表1，由表1可知误差率在0.0018％-0.0498％，所得模型预测值与真实值之间误差较小，准确性较高。
表1发酵虫草菌粉总多糖PLSR定量分析模型预测值与真实值对比
具体的，所述定量分析模型的确定过程如下：建立偏最小二乘回归法(PartialLeast Squares Regression,PLSR)定量分析模型，对比分析多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction,MSC)结合原始光谱、一阶导数、二阶导数及Savitzky-Golay(S-G)平滑处理光谱的结果，以校正集均方差(Root Mean Square ErrorsOf Calibration,RMSEC)、验证集均方差(Root Mean Square Errors Of Prediction,RMSEP)和校正集相关系数(Calibration set correlation coefficients,Rc)、验证集相关系数(Prediction set correlation coefficients,Rp)为指标，筛选出最佳的定量分析模型。其中，不同预处理模型性能指标结果见表2。
表2不同预处理方式性能指标
步骤S4，提供发酵虫草菌粉待测样品，对所述发酵虫草菌粉待测样品进行近红外光谱扫描，得到所述发酵虫草菌粉待测样品的近红外扫描图谱；
步骤S5，将得到的近红外扫描图谱输入TQ Analyst软件进行分析，利用步骤S3得到的所述定量分析模型计算获得所述发酵虫草菌粉待测样品的总多糖含量。
需要说明的是，本发明中所用的发酵虫草菌粉为江西国药有限责任公司生产的发酵虫草菌粉(Cs－4)。
与相关技术相比，本发明的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，采用近红外光谱作为过程分析技术之一，具有快速、无损、成本低的特点，与现代质量控制需求相符；同时，采用较为简单的苯酚-硫酸法测定发酵虫草菌粉生产全过程中的总多糖标准含量，基于发酵虫草菌粉生产的各个操作单元(菌种培养、菌种传代、菌种发酵、菌种滤过、菌种干燥、菌种粉碎、菌种混合)，从源头开始控制总多糖质量，确保发酵虫草菌粉生产过程产品质量稳定可控；此外，因发酵条件对多糖的活性有极大的影响，故而随时监控多糖含量，反馈调节发酵生产工艺极为必要，近红外光谱具有准确快速的特点，将近红外光谱结合偏最小二乘回归法建立全过程链总多糖定量分析模型，为生产多糖活性最大化的发酵虫草菌粉提供了一个初步依据。
以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1，采用传统的方法检测发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量；
步骤S2，提供多个操作单元发酵虫草菌粉原始样品，分别获取每个所述发酵虫草菌粉原始样品的光谱值，并取每个所述发酵虫草菌粉原始样品的平均光谱值为发酵虫草菌粉原始光谱；
步骤S3，采用TQ Analyst软件分析所述发酵虫草菌粉原始光谱，将所述步骤S1得到的发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量与所述步骤S2得到的发酵虫草菌粉原始光谱相关联，得到一个发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量与发酵虫草菌粉原始光谱相关联的定量分析模型；
步骤S4，提供发酵虫草菌粉待测样品，对所述发酵虫草菌粉待测样品进行近红外光谱扫描，得到所述发酵虫草菌粉待测样品的近红外扫描图谱；
步骤S5，将得到的近红外扫描图谱输入TQ Analyst软件进行分析，利用步骤S3得到的所述定量分析模型计算获得所述发酵虫草菌粉待测样品的总多糖含量。
2.根据权利要求1所述的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，其特征在于，所述步骤S1采用苯酚-硫酸法测定发酵虫草菌粉生产全过程中的总多糖标准含量。
3.根据权利要求2所述的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，其特征在于，所述步骤S1包括如下子步骤：
步骤S11，多糖的提取，精密称取2g虫草菌粉，置于圆底烧瓶中，加入30ml双蒸水，100℃加热回流2次，每次1h，趁热过滤，合并滤液，4000r·min-1离心15min除去沉淀，按照体积比1:5浓缩上清液，往浓缩后上清液中加入3倍体积的无水乙醇，置于4℃冰箱醇析12h，将醇析后的多糖溶液4000r·min-1离心15min后取沉淀，将沉淀溶于15ml双蒸水中，加入等体积Sevage试剂萃取3次，取上清液8000r·min-1离心15min，留取上清液，加入3倍体积的95％乙醇，8000r·min-1离心15min后取沉淀，溶于适量双蒸水，冷冻干燥得到发酵虫草菌粉多糖提取物；
步骤S12，供试品溶液的制备，精密称取2mg所述发酵虫草菌粉多糖提取物置于2ml的容量瓶中，加双蒸水溶解并定容至刻度线得到发酵虫草菌粉溶液，然后精密称取1ml所述发酵虫草菌粉溶液置于25ml的容量瓶中，加入双蒸水溶解并稀释至刻度线，得到供试品溶液；
步骤S13，全波长扫描，分别精密量取2ml葡萄糖溶液与2ml供试品溶液于25ml的具塞试管中，加入4％的苯酚溶液0.7ml，再缓缓加入5ml的浓硫酸，置于沸水浴中20min后取出并放置室温，同时取2ml水作为空白进行显色，作为参比，在200～800之间扫描样品；
步骤S14，葡萄糖标准曲线的建立，精密称取葡萄糖5mg置于10ml容量瓶中，加入溶解并定至刻度线得到葡萄糖母液，分别精密吸取0.4ml、0.45ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、1.4ml的所述葡萄糖母液至10ml容量瓶中，分别加入双蒸水稀释至刻度线，得到不同浓度的葡萄糖对照品溶液，精密移取系列浓度的所述葡萄糖对照品溶液2ml至25ml具塞玻璃试管中，在步骤S13的条件下显色后，在波长489nm处测定吸光度，以吸光度对应浓度做工作曲线；
步骤S15，将步骤S12制备的所述供试品溶液在步骤S13的条件下显色后，在波长489nm处测定吸光度，并代入所述工作曲线中计算得到发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量。
4.根据权利要求3所述的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，其特征在于，步骤S1还包括步骤S16：将步骤S15得到的不同批次、不同过程的发酵虫草菌粉生产过程中的总多糖标准含量按照从大到小的顺序排列，并在确保校正集含量包含验证集含量的条件下按照5:1的比例选取校正集与验证集。
5.根据权利要求4所述的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，其特征在于，步骤S3中，利用步骤S16得到的验证集作为外部数据对所述定量分析模型进行验证，将所述验证集经苯酚-硫酸法测量得出的多糖含量真实值与所述定量分析模型的预测值进行比较，计算模型误差率，验证所述定量分析模型的准确性。
6.根据权利要求1所述的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，其特征在于，步骤S2中，采用积分球模式采集发酵虫草菌粉原始样品的光谱，采集过程为：波数范围为4000-12500cm-1，扫描64次，分辨率为8cm-1，采集空气信号作为背景，试验过程中自动扣除背景，温度25℃，湿度40％，以log1/R形式显示光谱。
7.根据权利要求1所述的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，其特征在于，步骤S3中，所述定量分析模型的确定包括如下过程：建立偏最小二乘回归法定量分析模型，对比分析多元散射校正结合原始光谱、一阶导数、二阶导数及Savitzky-Golay平滑处理光谱的结果，以校正集均方差、验证集均方差和校正集相关系数、验证集相关系数为指标，筛选出最佳的定量分析模型。
8.根据权利要求1所述的近红外分析发酵虫草菌粉生产过程总多糖的质量控制方法，其特征在于，步骤S3中，所述定量分析模型的波数区间为10526.3-8333.33cm-1、9903.9-6521.88cm-1或6667.11-4545.45cm-1。
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